伊曲康唑霧化吸入預(yù)防侵襲性肺曲霉病藥效學(xué)研究

盧鑫 朱穎 王麗 施毅 高海燕 楊健 張秀偉南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院呼吸內(nèi)科00;解放軍南京總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科000

伊曲康唑是臨床應(yīng)用廣泛的三唑類抗真菌藥物,傳統(tǒng)用藥方式為靜脈及口服給藥,主要針對真菌感染的預(yù)防性治療、經(jīng)驗(yàn)性治療、針對性治療和挽救性治療方面。氣道是人體抵御曲霉感染的第一道防線,霧化吸入應(yīng)用抗真菌藥物可在肺局部形成較高藥物濃度,發(fā)揮抗真菌活性,抑制曲霉菌絲的侵襲性生長。本研究擬通過動物實(shí)驗(yàn)觀察伊曲康唑霧化吸入、系統(tǒng)給藥及聯(lián)合給藥對侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)小鼠生存率及肺部真菌負(fù)荷的影響,對霧化吸入伊曲康唑防治IPA 的用藥策略做初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及菌株 本研究符合 《赫爾辛基宣言》的原則。選用6周齡雌性清潔級ICR 小鼠60只,分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食進(jìn)水。選用MF13煙曲霉菌株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 隨機(jī)分配為4 組,每組15只,設(shè)置對照組:感染未用藥;腹腔注射治療組:感染后第2天開始腹腔注射伊曲康唑至第7天;霧化預(yù)防組:感染前第2天開始霧化伊曲康唑至第7天;聯(lián)合防治組:感染前第2天開始霧化伊曲康唑聯(lián)合感染后第2天開始腹腔注射伊曲康唑至第7天。如圖1所示,每組中隨機(jī)選取9只小鼠觀察生存情況,時間截止到感染后第12天;其余6只小鼠在感染后第7天脫頸處死取肺組織勻漿化檢測肺真菌負(fù)荷,死亡的小鼠立即取肺組織勻漿化檢測肺真菌負(fù)荷。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程示意圖

1.2.2 IPA 動物模型制備 實(shí)驗(yàn)小鼠采用以下方法造成免疫抑制狀態(tài):環(huán)磷酰胺250 mg/kg腹腔注射(感染前第4天及感染前第1天各1次),地塞米松50 mg/kg腹腔注射 (感染前第1天、感染當(dāng)天及感染后第1天各1次)。免疫抑制后采用氣管插管氣管內(nèi)滴入法接種50μl濃度為2×108菌落形成單位/毫升 (Colony-form Units/ml,CFU/ml)的煙曲霉孢子懸液[1]。

1.2.3 霧化吸入給藥 小鼠腹腔注射120μl 2%戊巴比妥麻醉后頭部固定,連接霧化器啟動霧化。用藥劑量為30 mg/kg,每天用藥一次,霧化時間為60 min。

1.2.4 腹腔注射給藥 固定小鼠并翻轉(zhuǎn)暴露腹部皮膚,選擇中下腹部為進(jìn)針點(diǎn),緩慢注入藥液后快速退針,保持此體位30 s,伊曲康唑用量為30 mg/kg。

1.2.5 肺組織真菌菌落負(fù)荷檢測方法 無菌條件下取小鼠新鮮右肺并勻漿化,電子天平稱重后按1 g濕肺組織∶10 ml磷酸鹽緩沖液 (含0.1%吐溫80)比例稀釋,取10μl稀釋液接種于沙保弱培養(yǎng)基平板上,置于真菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),24 h 后讀取平板菌落數(shù),假設(shè)菌落數(shù)為n,按以下公式計(jì)算:肺組織的真菌負(fù)荷=n×103CFU/g鼠肺組織,換算為Lg[1]。

1.2.6 小鼠存活情況 每日觀察各組實(shí)驗(yàn)小鼠生存狀態(tài)直至感染后第12 天,記錄小鼠存活情況。繪制生存-時間曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以±s表示,計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)及百分比表示。組間計(jì)量資料的比較以單因素方差分析,組間資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射伊曲康唑治療對IPA 小鼠生存率及肺真菌負(fù)荷的影響

2.1.1 生存率比較 將腹腔注射治療組與對照組進(jìn)行比較,見圖2,腹腔注射伊曲康唑可使IPA 小鼠生存獲益,中位生存時間由6 d上升至8 d(P=0.039)。

2.1.2 肺真菌負(fù)荷比較 見圖3,對照組肺真菌負(fù)荷為5.383±0.196,腹腔注射治療組為4.817±0.154,2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。腹腔注射伊曲康唑可顯著降低實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織真菌負(fù)荷。

2.2 伊曲康唑霧化預(yù)防用藥對IPA 小鼠生存率及肺真菌負(fù)荷的影響

2.2.1 生存率 見圖2,霧化伊曲康唑預(yù)防性用藥與對照組(感染未治療)比較小鼠生存獲益,中位生存時間由6 d上升至＞12 d (P=0.002),但與腹腔注射治療組比較小鼠生存率無明顯提高(P=0.080)。

圖2 霧化預(yù)防組與腹腔注射治療組及對照組相比對IPA小鼠生存時間的影響

2.2.2 肺真菌負(fù)荷 見圖3,腹腔注射治療組肺真菌負(fù)荷為4.817±0.154,霧化預(yù)防組肺真菌負(fù)荷為4.233±0.199,2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與腹腔注射治療組比較,霧化伊曲康唑預(yù)防性用藥可顯著降低實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織真菌負(fù)荷。

圖3 霧化預(yù)防組與腹腔注射治療組相比對IPA 小鼠肺真菌負(fù)荷的影響

2.3 伊曲康唑霧化預(yù)防及腹腔注射治療聯(lián)合應(yīng)用對IPA 小鼠生存率及肺真菌負(fù)荷的影響

2.3.1 生存率 見圖4,聯(lián)合防治組與腹腔注射治療組相比較,小鼠生存率提高(P=0.028)。

圖4 聯(lián)合防治組與腹腔注射治療組及對照組相比對IPA小鼠生存時間的影響

2.3.2 肺真菌負(fù)荷 見圖5,與腹腔注射治療組(4.817±0.154)相比較,聯(lián)合防治組 (3.942±0.188)能有效降低小鼠肺真菌負(fù)荷 (P=0.005)。

3 討論

真菌感染是腫瘤化療、實(shí)體器官及干細(xì)胞移植受者等免疫抑制人群較常見的機(jī)會性感染之一[2]。盡管不斷有新的抗真菌藥物投入臨床,但I(xiàn)PA 一經(jīng)診斷往往較難治愈,病死率高達(dá)50%～80%,占住院死亡患者總數(shù)的4%[3]。針對高危人群IPA的防治逐步為醫(yī)師所重視。治療策略也不斷完善,主要包括:預(yù)防性治療、經(jīng)驗(yàn)性治療、針對性治療和挽救性治療。

抗真菌藥物的霧化吸入給藥最早于1988年提出,為使藥物抵達(dá)肺泡內(nèi),要求霧化器可將藥液轉(zhuǎn)化為直徑介于0.5～5μm 的藥物微滴[4]。已有多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)研究證明利用現(xiàn)有霧化設(shè)備所產(chǎn)生的AmB藥物微粒中位直徑 (mean mass aerodynamic diameter,MMAD)在1.31～3.7μm[5-7],伊曲康唑MMAD 在2～3 μm[8-9],米卡芬凈在1.67～2.2μm[10]。國內(nèi)學(xué)者在AmB、氟康唑等抗真菌藥物霧化吸入給藥的臨床研究中雖未涉及MMAD 等霧化效率指標(biāo),但良好的臨床效果同樣顯示了應(yīng)用國產(chǎn)霧化裝置的可行性[11-13]。

圖5 聯(lián)合防治組與腹腔注射治療組相比對IPA 小鼠肺真菌負(fù)荷的影響

對多種抗真菌藥物霧化吸入研究均采用注射制劑。藥代動力學(xué)研究顯示,動物接受AmB 霧化吸入6周后肺組織藥物濃度依然高達(dá)7.7～14.3μg/g濕肺組織[5];有學(xué)者報(bào)道霧化吸入AmB 后半衰期為1.3～4.5 d,同時血藥濃度維持在0.2 mg/L 以下[14]。霧化吸入伊曲康唑0.5～1 h后肺組織藥物濃度達(dá)到峰值,超過11.0μg/g濕肺組織[15-18],藥物半衰期為7 h。另有研究者報(bào)道伏立康唑霧化吸入后血藥濃度峰值達(dá)到7.1 mg/L[19]。

關(guān)于抗真菌藥物霧化吸入防治IPA 療效研究分為動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究兩個方面,Am B 霧化吸入已有6項(xiàng)臨床研究數(shù)據(jù)得到報(bào)道,有關(guān)Meta分析結(jié)果顯示,針對高危人群霧化吸入AmB 能有效預(yù)防IPA 的發(fā)生[20]。其他抗真菌藥物霧化吸入研究尚局限于動物實(shí)驗(yàn)階段。在探討霧化吸入給藥有效性時往往將“腹腔注射AmB 治療”做為治療真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn),相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)預(yù)防性霧化吸入伊曲康唑小鼠生存率明顯高于Am B 腹腔注射治療組[17,21]。但目前Am B 已不作為治療IPA 首選用藥,以此標(biāo)準(zhǔn)僅能初步判斷抗真菌藥物霧化吸入有可行性,難以對伊曲康唑霧化吸入藥效學(xué)進(jìn)行準(zhǔn)確評價。本研究將伊曲康唑腹腔注射用藥作為標(biāo)準(zhǔn),對霧化吸入用藥在預(yù)防、治療的藥效學(xué)進(jìn)行綜合評估,并對兩種給藥方式聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行評價。動物實(shí)驗(yàn)中往往在感染前第2天開始給藥定義為預(yù)防性用藥,感染后第2天開始給藥定義為治療性用藥[22]。從生存率及肺部真菌負(fù)荷兩個方面加以評價。肺部真菌負(fù)荷有兩種檢測方法:平板菌落計(jì)數(shù)和熒光定量PCR,其中平板菌落計(jì)數(shù)是經(jīng)典方法,應(yīng)用也最為廣泛。

本研究首先觀察了腹腔注射伊曲康唑治療對IPA 小鼠病死率及肺真菌負(fù)荷的影響,結(jié)果顯示可提高小鼠生存率并降低肺真菌負(fù)荷,證明腹腔注射伊曲康唑治療IPA 是有效的。

觀察伊曲康唑不同給藥方式及治療策略的治療效果,研究發(fā)現(xiàn)與伊曲康唑腹腔注射治療相比,霧化預(yù)防組及聯(lián)合防治組可明顯減少實(shí)驗(yàn)小鼠死亡并降低肺真菌負(fù)荷,推測在粒細(xì)胞缺乏小鼠肺內(nèi)保持高藥物濃度,可有效抑制進(jìn)入氣道的曲霉孢子萌發(fā),聯(lián)合腹腔注射伊曲康唑達(dá)到較高血藥濃度,對侵襲生長的曲霉產(chǎn)生持續(xù)作用。

IPA 治療效果差,新藥研制周期長,探索已有藥物新的用藥方式及各種用藥方式聯(lián)合應(yīng)用可能對治療疾病帶來益處。本研究僅對伊曲康唑霧化吸入給藥療效做初步探討,可見伊曲康唑霧化作為高危人群預(yù)防性用藥及與系統(tǒng)給藥聯(lián)合應(yīng)用可能具有潛在的應(yīng)用價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突