一種三角帆蚌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶基因cDNA的全長(zhǎng)克隆與表達(dá)分析

張愛菊，劉士力，劉金殿，張根芳，周志明,*

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所浙江研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313001；2. 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321000)

鈣是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子，參與許多基本細(xì)胞過程的調(diào)控[1-2]。在軟體動(dòng)物中，Ca2+還是參與其生物礦化過程的重要元素，對(duì)珍珠和貝殼的形成及生長(zhǎng)非常關(guān)鍵。胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的維持是這些調(diào)控或作用正常實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。在靜息細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)、外的Ca2+含量均是相對(duì)穩(wěn)定的[3]。環(huán)境Ca2+濃度是影響育珠蚌鈣代謝的重要原因之一。而軟體動(dòng)物鈣代謝，對(duì)于闡明貝殼以及珍珠形成機(jī)理和提高優(yōu)質(zhì)珠的產(chǎn)量有著重要意義。直接從環(huán)境中吸收鈣是Ca2+進(jìn)入淡水軟體動(dòng)物體內(nèi)的一種重要途徑[4]。因此，溶質(zhì)鈣外排機(jī)制對(duì)胞質(zhì)鈣返回靜止?fàn)顟B(tài)、維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)很重要。同時(shí)，質(zhì)膜上和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(或肌漿網(wǎng))上的Ca2+泵將細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+排出胞外或進(jìn)入胞內(nèi)鈣庫(kù)也是維持細(xì)胞調(diào)控的重要基礎(chǔ)[5-6]。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化主要由肌漿網(wǎng)(SR)對(duì)Ca2+的釋放和攝入來實(shí)現(xiàn)[6]。SR是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣貯存器，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度而發(fā)揮重要的生理功能。Sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase(SERCA)是肌漿網(wǎng)膜上的Ca2+泵，靠水解ATP將細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+逆濃度梯度泵入肌漿網(wǎng)而將細(xì)胞基質(zhì)中的Ca2+泵入肌質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存起來[7]。迄今為止，有關(guān)軟體動(dòng)物SERCA基因的研究主要集中在合浦珠母貝(Pinctadafucata)、美洲牡蠣(Crassostreavirginica)等海水貝類[8]，而在淡水貝類中鮮有報(bào)道。本研究通過RACE技術(shù)，成功克隆得到一種淡水貝類——三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)SERCA基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并分析其核苷酸和氨基酸序列，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)其在不同組織、不同外界Ca2+濃度刺激和同種Ca2+濃度刺激下不同時(shí)間的表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步深入研究SERCA基因的功能及其調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用1齡三角帆蚌采自浙江金華威旺養(yǎng)殖新技術(shù)有限公司試驗(yàn)基地，平均殼長(zhǎng)65 mm，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室在PVC塑料箱中暫養(yǎng)1周后隨機(jī)選取3只，取其鰓、外套膜、性腺、肝胰腺、斧足等組織，等量相同組織混合在一起經(jīng)液氮研磨后分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。暫養(yǎng)期間，采用池塘水(綠藻為主)連續(xù)充氣養(yǎng)殖，保持水溫(25±1) ℃，pH (7.6±0.1)，每2 d換水1/3。

1.2 總RNA的提取及cDNA首鏈的合成

取三角帆蚌各組織樣品按照TRIzol Reagent(Invitrogen公司)一步法提取總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的濃度和質(zhì)量，同時(shí)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。之后，取各組織總RNA 500 ng按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo公司)說明書，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)三角帆蚌轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序得到的SERCA部分cDNA序列，設(shè)計(jì)引物RC126-1F和RC126-1R(表1)。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×GC BufferⅠ12.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)4 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)后，用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(生工SK1131)回收、純化。按照克隆試劑盒說明(TaKaRa公司)連接入pMD18-T載體，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞(SK2301)，經(jīng)LB平板培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序得到600 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物，符合預(yù)期大小，并經(jīng)BLAST分析初步確定為SERCA基因的部分序列。

根據(jù)已獲得的中間片段，分別設(shè)計(jì)5’和3’端RACE所需的引物，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。按照Clontech Smart cDNA Amplification kit操作說明書，分別合成5’-RACE Ready-cDNA和3’-RACE-Ready-cDNA作為模板，各進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增。第一輪PCR反應(yīng)體系：2×GC BufferⅠ12.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)4 μL，5’-RACE Ready-cDNA或3’-RACE-Ready-cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。第二輪PCR反應(yīng)體系：2×GC BufferⅠ25 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)8 μL，第一輪或第二輪PCR稀釋產(chǎn)物1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆、測(cè)序與中間片段所述步驟相同。

1.4 序列分析

測(cè)序結(jié)果通過DNAStar軟件中的SeqMan程序先進(jìn)行載體序列的去除和拼接，獲得SERCA基因全長(zhǎng)cDNA序列，與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)及蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)作BLAST(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析。同時(shí)將cDNA序列翻譯成氨基酸序列，應(yīng)用ORF Finder程序(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)確定正確的開放閱讀框(open reading frame，ORF)。用ExPASy在線Protparam 程序(http: //www.expasy.org /tools/protparam.html)預(yù)測(cè)氨基酸序列的物理參數(shù)，HMMTOP(Tusndy and Simon 2001)和TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)分析跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP 3.0 server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽。SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域。用DNAMAN 8軟件對(duì)相應(yīng)的SERCA氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，采用鄰位相接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建三角帆蚌SERCA基因氨基酸序列與其他物種的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，并用Bootstrap重復(fù)1 000次計(jì)算各分支的置信度[9]。

1.5 組織差異表達(dá)檢測(cè)

根據(jù)已獲得的全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)定量PCR引物SERCA-RTF和SERCA-RTR(表1)。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)三角帆蚌SERCA基因的組織差異，以5種組織(性腺、肝胰臟、斧足、外套膜和鰓)合成的首鏈cDNA為模板，按照FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)說明(Roche公司)，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)[10]。PCR反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(7.5 μmol·L-1)各1.0 μL，cDNA模板2.5 μL，補(bǔ)足ddH2O至25 μL。程序設(shè)置：95 ℃10 min進(jìn)入循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃60 s，72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

表1三角帆蚌SERCA基因克隆和表達(dá)分析的引物

Table1Primers designed for cloning and expression analysis of aSERCAgene forH.cumingii

1.6 環(huán)境Ca2+刺激試驗(yàn)

取15只暫養(yǎng)一周后的三角帆蚌隨機(jī)分成5組，分別放入不同Ca2+濃度的20 L PVC塑料箱中，每組3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)組在曝氣后的自來水中加入無水氯化鈣，使水體中的Ca2+濃度分別為40、60、80和100 mg·L-1，對(duì)照組不添加氯化鈣。在飼養(yǎng)7 d后，分別取三角帆蚌外套膜保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，另取暫養(yǎng)的三角帆蚌15只，放入Ca2+濃度為60 mg·L-1的塑料箱中，并分別于0、24、48、96和168 h取外套膜保存于-80 ℃超低溫冰箱備用，每次3個(gè)重復(fù)。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)所取外套膜組織中的SERCA基因表達(dá)情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析

進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)時(shí)，以NCBI上公布的β-actin(NCBI序列號(hào)：HM045420)為內(nèi)參，用于校正，內(nèi)參引物見表1。數(shù)據(jù)繪圖采用Excel 2013軟件。數(shù)據(jù)基本統(tǒng)計(jì)分析、多因素方差分析、相關(guān)分析采用SPSS 16.0軟件。qRT-PCR結(jié)果用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角帆蚌SERCA基因cDNA全長(zhǎng)序列

獲得一種三角帆蚌SERCA基因全長(zhǎng)cDNA序列，該基因全長(zhǎng)3 326 bp(GenBank 登錄號(hào)：KP313822)，包括201-bp 5’-UTR區(qū)域、3 060-bp編碼框(ORF)和65-bp 3’-UTR。有1個(gè)終止密碼子TGA和一個(gè)多聚A尾巴(polyA)，但沒有多聚腺苷酸加尾信號(hào)位點(diǎn)(AATAAA)。

2.2 三角帆蚌SERCA氨基酸序列特征

ORF共編碼1 019個(gè)氨基酸。通過預(yù)測(cè)，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為112.81 ku，分子式：C5052H8029N1325O1484S54，理論等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)為5.42。其中，亮氨酸(Leu)含量最高，為8.4%，其次為纈氨酸(Val)，含量為8.1%，色氨酸(Trp)含量最少，為1.4%。帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)122個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基(Arg + Lys)101個(gè)。脂肪族氨基酸指數(shù)為96.54。氨基酸預(yù)測(cè)無信號(hào)肽。與其他典型SERCAs不同的是，該三角帆蚌SERCA有9個(gè)跨膜區(qū)域(圖1)。

SMART分析顯示，三角帆蚌SERCA氨基酸序列呈現(xiàn)出典型的Ca2+-ATP酶特征，由Cation-transporting P-type ATPase, N-terminal (Cation_ATPase_N)、E1-E2 ATPase-associated region(E1-E2_ATPase)、Haloacid dehalogenase-like hydrolase (Hydrolase)、Cation-transporting P-type ATPase， C-terminal (Cation_ATPase_C)四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別包含77個(gè)(殘基1-77)、249個(gè)(殘基93-341)、380個(gè)(殘基345-724)、173個(gè)(殘基819-991)氨基酸殘基。這些結(jié)構(gòu)域中含有SERCAs的常見結(jié)構(gòu)，包括磷酸化區(qū)域(phosphorylation region)，異硫氰酸熒光素位點(diǎn)(fluorescein isothiocyanate site)，F(xiàn)SBA結(jié)合位點(diǎn)(5′-(p-fluorosulfonyl) benzoyladenosinebinding site)，受磷蛋白結(jié)合區(qū)(phospholamban-binding motif)以及毒胡蘿卜素位點(diǎn)(thapsigargin sites)(圖1)。

2.3 SERCA氨基酸序列同源性分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

經(jīng)NCBI中Protein Blast 比對(duì)，與合浦珠母貝(P.fucata)SERCA異構(gòu)體C和A的相似性最高，均為88%，與鱗硨磲(Tridacnasquamosa)、美洲牡蠣(C.virginica)、大瓶螺(Pomaceacanaliculata)、加洲海兔(Aplysiacalifornica)、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、海扇貝(Placopectenmagellanicus)等海洋軟體動(dòng)物的相似性也很高，依次為87%、87%、86%、85%和85%。此外，同其他一些物種SERCA氨基酸序列也存在不同程度的相似性(表2)，說明SERCA序列高度保守。

用DNAMAN 8軟件將三角帆蚌與其他17種生物的SERCA基因氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并以鄰位相接法(NJ法)構(gòu)建了氨基酸的進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果表明，系統(tǒng)進(jìn)化樹可分為明顯的兩大支，其中，紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)占據(jù)一個(gè)分支，其它SERCA構(gòu)成另一大分支，三角帆蚌首先與鱗硨磲聚在一起，然后與其他海洋軟體動(dòng)物，如合浦珠母貝、美洲牡蠣等緊密聚在一起，且與粉正蚓(Lumbricusrubellus)等環(huán)節(jié)動(dòng)物親緣關(guān)系較近，聚為一支，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系基本符合傳統(tǒng)的分類地位。

相同殘基用“*”表示，半保守位置用“﹒”表示；三角帆蚌的跨膜螺旋M1-M9用陰影顯示；磷酸化位點(diǎn)、FITC和FSBA結(jié)合位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出；2個(gè)典型的胰蛋白酶位點(diǎn)R188和R505用粗體和下劃線標(biāo)出；典型的受磷蛋白結(jié)合區(qū)用下劃線加斜體標(biāo)出；預(yù)測(cè)的毒胡蘿卜素位點(diǎn)加粗顯示?？s寫及登錄號(hào)見表2。Identical residues were shown with an asterisk (*)， and semi-conservative substitutions were labeled with a period (﹒). Transmembrane segments M1-M9 from H.cumingii were shaded in grey. The phosphorylation site， fluorescein isothiocyanate site (FITC) and the 5＇-(p-fluorosulfonyl) benzoyladenosine binding site (FSBA) were underlined and labeled. Two typical tryptic sites R188 and R505 existing in sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)1 and SERCA2 were marked in bold and underlined. Typical phospholamban-binding motif of SERCA2 was underlined italicized. Putative thapsigargin sites were indicated in bold. The abbreviation name and accession No. were shown as that in Table 2.圖1 預(yù)測(cè)三角帆蚌SERCA氨基酸序列與合浦珠母貝的序列比對(duì)Fig.1 Amino acid sequence alignment of SERCAs from H. cumingii and P. fucata

表2三角帆蚌和其他物種SERCA氨基酸序列的相似性

Table2 Similarity of SERCA amino acid sequence amongH.cumingiiand other species

物種Species中文名Chinese nameGenBank登錄號(hào)GenBank accession No.文中縮寫Abbreviation name 相似性Similarity/%Hyriopsis cumingii三角帆蚌AKE25951.1Hc-Eca100Pinctada fucata合浦珠母貝ABS19817.1 Pf-Eca C88Pinctada fucata合浦珠母貝ABS19815.1 Pf-Eca A88Tridacna squamosa鱗硨磲AML22896.1 Ts-Eca87Crassostrea virginica美洲牡蠣XP_022343179.1 Cv-Eca X487Pinctada fucata合浦珠母貝ABS19816.1 Pf-Eca B86Crassostrea virginica 美洲牡蠣XP_022343176.1 Cv-Eca X186Crassostrea virginica美洲牡蠣XP_022343177.1 Cv-Eca X286Pomacea canaliculata大瓶螺XP_025091373.1 Pc-Eca X386Aplysia californica加洲海兔XP_012940855.1 Ac-Eca85Placopecten magellanicus 海扇貝AAC63909.1 Pm-Eca85Mizuhopecten yessoensis 蝦夷扇貝XP_021371547.1 My-Eca X185Crassostrea gigas太平洋牡蠣EKC33522.1 Cg-Eca83Octopus bimaculoides加州雙斑蛸XP_014786351.1 Ob-Eca1-like82Biomphalaria glabrata光滑雙臍螺XP_013087479.1 Bg-Eca1-like82Lingula anatina 海豆芽XP_013421506.1 La-Eca X681Lumbricus rubellus 粉正蚓ACX35339.1 Lr-Ca278Cherax quadricarinatus 紅螯螯蝦AIW68606.1Cq-Eca75

2.4 三角帆蚌SERCA基因的表達(dá)特征

圖2 根據(jù)SERCA氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of SERCA amino acid sequence from H. cumingii and other species

2.4.1 組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了三角帆蚌SERCA基因在不同組織的表達(dá)差異性，結(jié)果表明三角帆蚌SERCA表達(dá)水平存在明顯的組織差異，在鰓表達(dá)最高，其次為外套膜、肝胰腺，在性腺和斧足中的表達(dá)量較低(圖3)。

2.4.2 環(huán)境Ca2+刺激下的SERCAmRNA表達(dá)情況

不同Ca2+濃度處理試驗(yàn)結(jié)果表明，隨水體中Ca2+濃度逐漸升高，三角帆蚌SERCA基因在外套膜中的表達(dá)水平呈先下降后上升趨勢(shì)，并在Ca2+濃度為60 mg·L-1時(shí)達(dá)到最低值，Ca2+濃度為80 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高值，且顯著高于其他試驗(yàn)組(圖4-A)。同時(shí)在60 mg·L-1Ca2+濃度條件下，對(duì)三角帆蚌外套膜進(jìn)行不同時(shí)間的表達(dá)試驗(yàn)，結(jié)果表明，SERCA基因的表達(dá)量隨時(shí)間推移先上升，于48 h時(shí)達(dá)到最高，而后逐漸下降，但在168 h時(shí)略有上升(圖4-B)。

圖3 三角帆蚌SERCA基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expressions of SERCA gene in different tissues from H. cumingii

A，不同Ca2+濃度下外套膜中SERCA的相對(duì)表達(dá)量；B，60 mg·L-1 Ca2+濃度條件下外套膜中SERCA在不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量。柱狀圖上同個(gè)系列無相同小寫字母的表示各Ca2+濃度組間差異顯著(P<0.05)；無相同大寫字母的表示時(shí)間差異極顯著(P<0.01)。A， The relative expression of SERCA in the mantle under different Ca2+ concentration treatments; B， The temporal expression profile of SERCA under Ca2+ concentration of 60 mg·L-1. The different lowercase letters and capital letters meant significant difference at P<0.05 and P<0.01 respectively.圖4 三角帆蚌SERCA基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression level of SERCA detected by real-time PCR from H. cumingii

3 討論

3.1 結(jié)構(gòu)特征

SERCAs屬于P型ATP酶家族，靠水解ATP將細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+逆濃度梯度泵入肌漿網(wǎng)而將細(xì)胞基質(zhì)中的Ca2+泵入肌質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存起來[12]。因此，Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能的變化不僅會(huì)直接影響肌肉收縮功能，而且會(huì)造成細(xì)胞漿中游離Ca2+濃度增加[13]。一般來說，SERCAs由一條單一的多肽鏈組成，形成3個(gè)球形的胞漿區(qū)域，由螺旋桿部連接到10個(gè)跨膜螺旋(M1-M10)。然而，F(xiàn)an等[8]研究表明，合浦珠母貝的一個(gè)SERCA異構(gòu)體，即PSERB可能擁有11個(gè)跨膜區(qū)域。與這些SERCAs不同的是，本研究克隆的三角帆蚌SERCA基因氨基酸序列預(yù)測(cè)有9個(gè)跨膜螺旋。

研究認(rèn)為，哺乳動(dòng)物和鳥類的SERCA由3個(gè)同源基因(SERCA1、SERCA2和SERCA3)編碼，每個(gè)基因有多種異構(gòu)體[14-18]，而一些無脊椎動(dòng)物中SERCAs的異構(gòu)體僅由一個(gè)基因編碼[19-21]。同時(shí)，有學(xué)者認(rèn)為，脊椎動(dòng)物中的3個(gè)SERCA編碼基因和無脊椎動(dòng)物中的唯一一個(gè)SERCA編碼基因由一個(gè)共同的SERCA祖基因衍生而來[21]。Fan等[8]的研究表明，合浦珠母貝的SERCA有3個(gè)異構(gòu)體，它們因擁有不同的C末端而被區(qū)分[22]。本研究?jī)H克隆了一種三角帆蚌SERCA基因，在氨基酸結(jié)構(gòu)水平上的拼接機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.2 組織特異性表達(dá)

研究表明，淡水和海水軟體動(dòng)物都積極地從環(huán)境中吸收鈣[4]，但鈣代謝機(jī)制存在明顯差異。海水軟體動(dòng)物外套膜和消化腺中幾乎沒有鈣的存在，不在組織中貯留鈣[23]。而淡水軟體動(dòng)物吸收的Ca2+有一部分以鈣球體的形式貯藏起來備用[24]。在淡水軟體動(dòng)物中，斧足是主要運(yùn)動(dòng)器官；性腺是生殖系統(tǒng)的重要組成部分；肝胰腺與軟體動(dòng)物消化、免疫等功能密切相關(guān)；外套膜為分泌鈣到礦化位點(diǎn)的重要組織[25]；鰓是從環(huán)境中吸收鈣的主要組織[26]。其中，外套膜作為珍珠形成的部位，對(duì)Ca2+具有高度通透性[27-28]，其內(nèi)、外表皮具有主動(dòng)吸收Ca2+和儲(chǔ)存Ca2+的功能，且Ca2+利用率高[29]；鰓作為三角帆蚌的呼吸和濾食器官，對(duì)Ca2+具有較強(qiáng)的親和力和較高的代謝率，是開展鈣代謝過程的重要組織之一。研究表明，相比外套膜，鰓能吸收更多的Ca2+，但其利用率沒有前者高[30]。由此可見，外套膜和鰓的鈣代謝活動(dòng)旺盛，鈣穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)它們非常重要。研究表明，PSERB可在多種組織中表達(dá)，是一個(gè)潛在的“看家基因”，其分布模式與哺乳動(dòng)物的SERCA2b相似；PSERA可在閉殼肌和斧足中表達(dá)，且在閉殼肌中有很高的表達(dá)量，可能為肌肉特異性異構(gòu)體，有助于放松收縮的肌肉[25，31-32]；PSERC可在除閉殼肌和斧足以外的組織中表達(dá)，且在鰓和外套膜中有最高的表達(dá)水平，這與非肌肉特異性異構(gòu)體非常相似。在軟體動(dòng)物中，PSERC在鰓和外套膜中的高度表達(dá)可能體現(xiàn)了它在軟體動(dòng)物生物礦化過程中對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)的重要性[8]。本研究克隆的三角帆蚌SERCA基因在鰓中表達(dá)最高，其次為外套膜、肝胰腺，在性腺和斧足中的表達(dá)量較低，說明在外套膜、鰓等鈣代謝活動(dòng)旺盛的組織中表達(dá)量很高，推測(cè)該基因在Ca2+吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)與儲(chǔ)存方面有著重要作用，參與珍珠形成等生物礦化過程。然而，該基因在三角帆蚌外套膜和鰓中的定位仍需進(jìn)一步研究。此外，該基因在肝胰腺中的表達(dá)量也較高，推測(cè)肝胰腺也具備儲(chǔ)存Ca2+的功能。性腺和斧足是三角帆蚌的繁殖、運(yùn)動(dòng)器官，其中較低的mRNA表達(dá)量，可能說明這兩個(gè)組織儲(chǔ)存Ca2+的能力較弱。今后將繼續(xù)研究該三角帆蚌SERCA基因的異構(gòu)體種類，進(jìn)一步了解SERCA基因在維持鈣穩(wěn)態(tài)中的具體功能，掌握鈣吸收、儲(chǔ)藏、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

3.3 環(huán)境Ca2+刺激

環(huán)境鈣濃度是影響育珠蚌鈣代謝的重要原因之一。郝瑩瑩[24]研究結(jié)果表明，添加Ca2+時(shí)，細(xì)胞外Ca2+流動(dòng)方向是從外排逐步變?yōu)閮?nèi)流，并隨濃度增大，Ca2+流動(dòng)速度增大，細(xì)胞內(nèi)部的熒光信號(hào)增強(qiáng)。在調(diào)控途徑上，有關(guān)鈣代謝的調(diào)控因子可能通過鈣的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、貯藏及沉積從而參與和調(diào)控貝殼與珍珠的形成。在河蚌育珠過程中，Ca2+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于珍珠的產(chǎn)量提高起著重要作用，加快Ca2+在珍珠囊中的沉積，是促進(jìn)珍珠快速生長(zhǎng)的重要手段。在天然水體中，河蚌生存的環(huán)境中鈣含量很低，主要是靠外套膜、鰓和斧足等與周圍水環(huán)境相接觸的組織直接從環(huán)境中吸收鈣，周圍水環(huán)境中Ca2+推測(cè)是以復(fù)合體形式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的，因?yàn)橐杂坞x的離子形態(tài)難以直接穿過外套膜表皮細(xì)胞的質(zhì)膜，且要耗費(fèi)一定的能量，所以部分Ca2+在膜的界面上與離子搬運(yùn)體結(jié)合形成復(fù)合體進(jìn)入質(zhì)膜[4]。

珍珠的形成是個(gè)復(fù)雜精細(xì)的生物礦化過程，水體中保持適宜的Ca2+濃度，是珍珠生長(zhǎng)的必備條件。李文娟等[33]研究認(rèn)為，適宜的Ca2+濃度能促進(jìn)三角帆蚌外套膜對(duì)Ca2+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)與儲(chǔ)存，而過高的Ca2+濃度則會(huì)抑制三角帆蚌外套膜的鈣代謝。舒妙安等[34]研究認(rèn)為，水體中適宜的Ca2+濃度(40～60 mg·L-1)能促進(jìn)三角帆蚌的鈣代謝過程，加快珍珠形成。本研究克隆的三角帆蚌SERCA基因在外套膜中的表達(dá)水平呈先下降后上升趨勢(shì)，并在Ca2+濃度為60 mg·L-1時(shí)達(dá)到最低值，Ca2+濃度為80 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高值，推測(cè)60 mg·L-1Ca2+濃度時(shí)外套膜積極地分泌鈣到生物礦化位點(diǎn)參與珍珠生長(zhǎng)，導(dǎo)致鈣儲(chǔ)存功能被弱化。當(dāng)環(huán)境Ca2+濃度為80 mg·L-1時(shí)，外套膜的分泌功能相對(duì)弱化，而儲(chǔ)存功能增強(qiáng)。至于在三角帆蚌不同生長(zhǎng)發(fā)育階段或外套膜不同位置的表達(dá)情況是否一致，還有待進(jìn)一步研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)三角帆蚌在適宜Ca2+濃度(60 mg·L-1)條件下，其外套膜SERCA基因的表達(dá)量隨時(shí)間推移先上升，于48 h時(shí)達(dá)到最高，而后逐漸下降，由此推測(cè)48 h轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存Ca2+能力很強(qiáng)，隨后降低。