生物有機(jī)肥對(duì)不同連作年限設(shè)施黃瓜土壤微生物數(shù)量和酶活性的影響

王燕云，趙龍杰，郝春莉，蔡盡忠，*

(1.廈門華廈學(xué)院 檢驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)系，福建 廈門 361024； 2.廈門市環(huán)境監(jiān)測(cè)工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361024)

我國是世界上最大的設(shè)施蔬菜種植國家[1]。受生產(chǎn)栽培條件限制及經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，設(shè)施內(nèi)蔬菜種植種類單一，連作現(xiàn)象普遍存在。黃瓜作為一種重要的瓜類蔬菜，其栽培面積約占設(shè)施栽培總面積的 60%。設(shè)施黃瓜連作導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降，黃瓜生長勢(shì)變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降、病蟲害嚴(yán)重。這已成為制約設(shè)施黃瓜可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題。設(shè)施黃瓜連作障礙的防控技術(shù)包括嫁接[2]、土壤消毒[3]、輪作[4]、生物有機(jī)肥[5]等。其中，嫁接技術(shù)和土壤消毒技術(shù)煩瑣且成本高，輪作并不適合各蔬菜基地單一品種的趨向。生物有機(jī)肥作為一種緩解連作障礙的措施，不僅成本較低，而且應(yīng)用方便。

土壤微生物和土壤酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)質(zhì)量的重要指標(biāo)。土壤微生物是土壤生化反應(yīng)的推動(dòng)者和參與者，是土壤有機(jī)無機(jī)復(fù)合體的重要組成部分，被認(rèn)為是表征土壤質(zhì)量變化最敏感、最有潛力的指標(biāo)[6]。土壤酶活性在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起著重要作用，體現(xiàn)了土壤總的生物學(xué)活性，表征了土壤的綜合肥力特征及土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化進(jìn)程，可以作為衡量生態(tài)系統(tǒng)土壤質(zhì)量變化的預(yù)警和敏感指標(biāo)[7]。

木霉菌是一種廣泛用于植物病害生物防治和改善作物生長的絲狀真菌，能夠增加作物產(chǎn)量和品質(zhì)，還能改良土壤[8]。北蟲草為冬蟲夏草同屬藥用真菌，其人工栽培目前以小麥、大米、小米或高粱作為養(yǎng)分來源。規(guī)?；斯ぴ耘啾毕x草，子實(shí)體采收后剩下的培養(yǎng)基數(shù)量很大，且營養(yǎng)豐富，有很大的開發(fā)空間。古龍酸母液是維生素C(VC)二步發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸性廢棄液，含有豐富的低分子量有機(jī)酸，能夠改善土壤質(zhì)量[9]。北蟲草廢棄培養(yǎng)基和古龍酸母液產(chǎn)量很大，目前尚無高效的處置方法，將其排放于環(huán)境中既造成環(huán)境污染又浪費(fèi)資源。

本研究利用木霉菌、北蟲草廢棄培養(yǎng)基、古龍酸母液通過堆肥制備了一種生物有機(jī)肥，經(jīng)過前期試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)設(shè)施土壤具有顯著的改良效果。將此生物有機(jī)肥施用于不同連作年限的設(shè)施黃瓜土壤，通過測(cè)定土壤微生物數(shù)量、酶活性、黃瓜產(chǎn)量和黃瓜品質(zhì)指標(biāo)，揭示生物有機(jī)肥對(duì)連作黃瓜土壤生態(tài)質(zhì)量和產(chǎn)量的影響，為指導(dǎo)平衡施肥與土壤養(yǎng)分管理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

深綠木霉菌由中科院微生物研究所菌種庫提供。北蟲草廢棄培養(yǎng)基取自河南省濮陽市北蟲草培養(yǎng)基地。古龍酸母液取自石藥集團(tuán)。生物有機(jī)肥由深綠木霉菌、廢棄培養(yǎng)基、古龍酸母液按菌料比(質(zhì)量比)1∶250∶250添加，調(diào)節(jié)含水量至50%，pH調(diào)至6.5，攪拌均勻后，堆成高約1 m的金字塔形，堆肥開始每5 d翻堆一次，堆肥30 d時(shí)，堆肥腐熟。該生物有機(jī)肥呈褐色粒狀，無惡臭，有機(jī)質(zhì)含量為49.88%，總N含量為2.80%，P2O5含量為2.28%，K2O含量為0.58%，水分含量為18.56%，pH值6.62，總As含量為3.15 mg·kg-1，總Hg含量為0.77 mg·kg-1，總Pb含量為18.14 mg·kg-1，總Cd含量為0.45 mg·kg-1，總Cr含量為33.47 mg·kg-1。這些指標(biāo)皆符合我國農(nóng)業(yè)行業(yè)有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)(NY 525—2012)。

1.2 盆栽試驗(yàn)

2017年5月以盆栽方式進(jìn)行生物有機(jī)肥的施肥試驗(yàn)。試驗(yàn)土壤取自山東省壽光市孫家集鎮(zhèn)大棚連片區(qū)0—20 cm根區(qū)耕層，包括4種土壤：未連作土壤(設(shè)施周邊玉米-辣椒輪作土壤)，以及連作3、7、11 a的設(shè)施黃瓜土壤(同一蔬菜和同一管理水平)，4種土壤的養(yǎng)分含量如表1所示。生物有機(jī)肥的施用量包括4個(gè)水平：未施肥、低用量(7.5 t·hm-2)、中等用量(15 t·hm-2)、高用量(30 t·hm-2)。試驗(yàn)共設(shè)置16個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。盆栽時(shí)，每盆中放入1.5 kg土壤，均勻撒入大小一致的5粒黃瓜種子，當(dāng)黃瓜幼苗株高為10 cm時(shí)，每盆間苗至3株，至黃瓜株高達(dá)50 cm時(shí)，每盆最終留苗1株。在黃瓜培養(yǎng)期間保持各盆土壤水分含量為田間持水量的60%。記錄每盆的黃瓜產(chǎn)量，盛果期每個(gè)處理取6個(gè)代表植株的代表性果實(shí)測(cè)定黃瓜品質(zhì)指標(biāo)(VC、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量)，同時(shí)分別采集盆中土壤，過2 mm篩，測(cè)定土壤微生物數(shù)量和酶活性。

表1供試土壤養(yǎng)分特征

Table1Nutrients property of test soils

連作年限Continuouscropping year/a有機(jī)質(zhì)Organic matter/(g·kg-1)總氮Total N/(g·kg-1)總磷Total P/(g·kg-1)總鉀Total K/(g·kg-1)速效氮Available N/(mg·kg-1)速效磷Available P/(mg·kg-1)速效鉀Available K/(mg·kg-1)023.650.810.721.1327.5824.3129.09325.180.890.811.1931.3445.1852.47732.761.121.051.3254.7938.7641.551142.151.461.381.5748.2732.3434.02

1.3 測(cè)試方法

VC含量采用2，6-二氯靛酚滴定法測(cè)定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[10]。土壤微生物數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法[11]：細(xì)菌計(jì)數(shù)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌計(jì)數(shù)采用馬丁氏培養(yǎng)基，放線菌計(jì)數(shù)采用改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基，木霉菌計(jì)數(shù)采用木霉菌選擇性培養(yǎng)基(TSM)，尖孢鐮刀菌計(jì)數(shù)采用尖孢鐮刀菌分離培養(yǎng)基(PEA)[12]。土壤蔗糖酶活性采用二硝基水楊酸比色法測(cè)定[13]，磷酸酶活性采用對(duì)硝基苯磷酸鹽法測(cè)定[11]，過氧化氫酶活性采用滴定法測(cè)定[14]，脲酶活性采用次氯酸鈉比色法測(cè)定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

為了總體評(píng)價(jià)生物有機(jī)肥對(duì)連作設(shè)施土壤質(zhì)量的修復(fù)效果，消除土壤微生物數(shù)量和酶活性量綱不同對(duì)土壤質(zhì)量總體評(píng)價(jià)的影響，參考王兵等[16]和楊長明等[17]評(píng)價(jià)土壤綜合質(zhì)量的方法，采用隸屬度評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量。

所有土壤指標(biāo)數(shù)據(jù)均在土壤烘干(105 ℃)質(zhì)量的基礎(chǔ)上進(jìn)行計(jì)算。所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)連作黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

如圖1所示，從連作年限的角度分析，在不施生物有機(jī)肥的條件下，當(dāng)連作年限從0增長到3 a時(shí)，黃瓜產(chǎn)量和黃瓜可溶性糖含量無顯著差異，黃瓜VC含量卻呈現(xiàn)顯著(P<0.05)差異；當(dāng)連作年限從3 a延長到7 a或11 a時(shí)，黃瓜產(chǎn)量及黃瓜可溶性糖含量顯著(P<0.05)下降，但與未連作的處理相比并無顯著差異，連作11 a處理的黃瓜VC含量顯著(P<0.05)低于連作3 a處理的黃瓜，但與連作7 a處理的黃瓜并無顯著差異。在施用低量生物有機(jī)肥的條件下，當(dāng)連作年限從0增長到3 a時(shí)，黃瓜VC含量無顯著差異；當(dāng)連作年限從3 a延長到7 a或11 a時(shí)，黃瓜VC含量顯著(P<0.05)下降。在施用中、高量生物有機(jī)肥的條件下，不同連作年限處理的黃瓜產(chǎn)量，以及黃瓜VC、可溶性糖含量均無顯著差異。在施肥量相同的條件下，不同連作年限下黃瓜可溶性蛋白質(zhì)含量始終無顯著差異?？梢钥闯?，黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)總體在連作3 a處理下尚無明顯負(fù)面影響，但隨著連作年限的繼續(xù)延長開始降低，表明設(shè)施黃瓜存在著嚴(yán)重的連作障礙問題。

從生物有機(jī)肥施用量的角度分析，相同連作年限下，黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)指標(biāo)均隨著施肥量的增加而增加，高用量下的黃瓜產(chǎn)量，以及VC、可溶性糖含量均顯著(P<0.05)高于不施用生物有機(jī)肥的處理。相同連作年限下，不同生物有機(jī)肥用量處理的黃瓜可溶性蛋白質(zhì)含量同樣無顯著差異?？梢钥闯觯哂昧可镉袡C(jī)肥可明顯提高長期連作黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

2.2 對(duì)連作土壤微生物數(shù)量的影響

如圖2所示，從連作年限的角度分析，隨著設(shè)施黃瓜連作年限的增加，土壤細(xì)菌、放線菌、木霉菌數(shù)量總體呈現(xiàn)先增加后逐漸降低的趨勢(shì)，在連作3 a時(shí)達(dá)到峰值；土壤真菌數(shù)量總體持續(xù)緩慢增加；土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量在連作3 a以前緩慢增長，之后總體呈現(xiàn)急劇增長的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，在連作3 a以內(nèi)，土壤的生態(tài)質(zhì)量尚無明顯劣化，當(dāng)連作年限進(jìn)一步延長，隨著病原真菌——尖孢鐮刀菌數(shù)量的急劇增長，土壤生態(tài)環(huán)境急劇惡化。

柱上無相同小寫字母的表示同一連作年限不同施肥量處理間存在顯著差異(P<0.05)，無相同大寫字母的表示同一施肥量不同連作年限處理間存在顯著差異(P<0.05)。Bars marked without the same lowercase letters indicated significant difference at P<0.05 among the treatments with the same continuous cropping years yet different application rate of bio-organic fertilizer. Meanwhile， bars marked without the same uppercase letters indicated significant difference at P<0.05 among the treatments with different continuous cropping years yet the same application rate of bio-organic fertilizer.圖1 不同處理對(duì)連作土壤黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different treatments on cucumber yield and quality

從生物有機(jī)肥對(duì)連作土壤修復(fù)效果的角度分析，不同連作年限的土壤細(xì)菌、放線菌、木霉菌數(shù)量均隨著施肥量的增加而增加，而尖孢鐮刀菌的數(shù)量則隨著施肥量的增加而下降，連作年限越長，減少的幅度越大，高用量下連作3、7、11 a的土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量分別比未施肥處理減少了75.13%、94.72%、97.37%。以上結(jié)果說明，生物有機(jī)肥能夠有效抑制連作土壤中病害真菌的數(shù)量，改善土壤的微生態(tài)平衡，對(duì)長期連作土壤具有明顯的改善效果。

2.3 對(duì)連作土壤酶活性的影響

土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶分別與碳循環(huán)、有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化、氮循環(huán)和磷循環(huán)相關(guān)，可以表示土壤的肥力質(zhì)量。如圖3所示，從連作年限的角度分析，隨著設(shè)施黃瓜連作年限的增加，土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶活性總體呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì)，在連作3 a時(shí)達(dá)到峰值，而后蔗糖酶和過氧化氫酶活性緩慢降低，脲酶和磷酸酶活性較大幅度地降低。從生物有機(jī)肥對(duì)連作土壤修復(fù)效果的角度分析，不同連作年限的土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶活性均隨施肥量的增加而提高，且高用量生物有機(jī)肥對(duì)連作年限長的土壤酶活性的作用效果更明顯。

2.4 不同處理下連作土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)

如圖4所示，隨著設(shè)施黃瓜連作年限的延長，土壤質(zhì)量隸屬度總體呈現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)，在連作3 a時(shí)達(dá)到峰值，但連作年限越久，土壤質(zhì)量越差。從生物有機(jī)肥對(duì)連作土壤修復(fù)效果的角度分析，不同連作年限的土壤隸屬度均隨施肥量的增加而提高，且生物有機(jī)肥對(duì)連作年限長的土壤質(zhì)量的修復(fù)效果更好。

3 討論

本研究表明，設(shè)施黃瓜土壤質(zhì)量隨著連作年限的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，連作3 a時(shí)最高，而連作11 a時(shí)最低，表現(xiàn)出了明顯的連作障礙問題。土壤連作障礙發(fā)生的因素包括自毒物質(zhì)和致病真菌的積累[18]。由于3 a的連作時(shí)間較短，土壤中還未積累過多的自毒物質(zhì)和致病菌，加上人工管理對(duì)土壤質(zhì)量的提升作用，因而連作3 a時(shí)土壤的質(zhì)量最高，表現(xiàn)出高的黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)。土壤細(xì)菌、放線菌和真菌的區(qū)系組成和數(shù)量變化常能反映出土壤生物活性水平[19]。在未施生物有機(jī)肥的處理中，隨著連作年限的進(jìn)一步延長，土壤細(xì)菌與真菌數(shù)量的比例不斷減少，由未連作土壤的5 756∶1減少為連作11 a時(shí)的1 230∶1，土壤肥力由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變，土壤中自毒物質(zhì)和致病真菌不斷積累，其中尖孢鐮刀菌數(shù)量在連作7 a和11 a時(shí)分別比未連作土壤大幅提高了8.61倍和21.61倍，引發(fā)了嚴(yán)重的連作障礙問題，因而土壤生態(tài)質(zhì)量和黃瓜產(chǎn)量品質(zhì)都顯著降低。馬云華等[20]、賀麗娜等[21]、劉來等[22]研究了連作對(duì)溫室黃瓜和大棚辣椒土壤性質(zhì)的影響，結(jié)果均表明，土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量、土壤酶活性隨連作年限延長先升高后降低，在連作5 a后開始降低，真菌數(shù)量和病原真菌數(shù)量一直增加，這與本研究的結(jié)果一致。

圖2 不同處理對(duì)連作土壤微生物數(shù)量的影響Fig.2 Effect of different treatments on microbe number of continuous cropping soil

圖3 不同處理對(duì)連作土壤酶活性的影響Fig.3 Effect of different treatments on enzymes activities of continuous cropping soil

圖4 不同處理對(duì)連作土壤質(zhì)量隸屬度的影響Fig.4 Effect of different treatments on quality membership of continuous cropping soil

向連作土壤施入生物有機(jī)肥后，尤其是在高用量下，土壤質(zhì)量能夠恢復(fù)到或者超越未連作土壤水平。本研究施用的生物有機(jī)肥由木霉菌、北蟲草廢棄培養(yǎng)基和古龍酸母液混制堆肥而成。木霉菌是一種拮抗真菌，在識(shí)別病原真菌過程中能夠分泌一系列細(xì)胞壁降解酶和次生代謝物，形成侵入結(jié)構(gòu)，最終抑制病原真菌的增殖[8]?？赡苷堑靡嬗诖?，本研究中施入高量生物有機(jī)肥處理的土壤病原真菌——尖孢鐮刀菌的數(shù)量大幅度減少。同時(shí)，放線菌數(shù)量也隨著生物有機(jī)肥施用量的增加而不斷提高，高用量下連作土壤的放線菌數(shù)量高于未連作土壤，而放線菌大多能產(chǎn)生抗生素[23]，拮抗病原真菌。在上述因素的綜合作用下，本試驗(yàn)施用的生物有機(jī)肥有效抑制了連作土壤中尖孢鐮刀菌等病害真菌的發(fā)生。肥料中廢棄北蟲草培養(yǎng)基的主要成分為小麥粒，可為土壤微生物提供充足的有機(jī)物質(zhì)。組成肥料的古龍酸母液含有豐富的低分子量有機(jī)酸，低分子量有機(jī)酸能夠透過細(xì)菌較薄的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，作為能源物質(zhì)被細(xì)菌利用[24]。這些因素都有利于促進(jìn)土壤細(xì)菌的增殖。在連作11 a的土壤中，土壤細(xì)菌真菌比例由未施肥時(shí)的1 230∶1增加到高用量生物有機(jī)肥的1 473∶1，土壤肥力由“真菌型”向“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變，土壤生態(tài)環(huán)境趨好。

土壤酶活性與土壤功能緊密相關(guān)，土壤生態(tài)系統(tǒng)改良通常都伴隨著土壤酶活性的提高[25]。蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性分別與土壤碳、氮、磷循環(huán)密切相關(guān)，可以表征土壤中碳、氮、磷的轉(zhuǎn)化能力，過氧化氫酶活性與有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)[26]，其活性被視作反映土壤肥力的指標(biāo)[27]。生物有機(jī)肥中含有大量的有機(jī)質(zhì)和氮、磷等養(yǎng)分，施入到連作土壤后作為酶的底物激發(fā)了相應(yīng)土壤酶的活性。這也就意味著生物有機(jī)肥能夠加速土壤養(yǎng)分元素的周轉(zhuǎn)，提高土壤肥力。本研究中生物有機(jī)肥提高了連作土壤的微生物數(shù)量和酶活性，尤其是高用量生物有機(jī)肥使連作7 a和11 a土壤的微生物數(shù)量和土壤酶活性恢復(fù)到或超越未連作土壤水平，表明本試驗(yàn)所采用的生物有機(jī)肥能夠有效改良連作土壤的生態(tài)質(zhì)量，使其恢復(fù)到正常水平。一些學(xué)者將生物有機(jī)肥用于連作黃瓜[5]、連作番茄和辣椒[28]、馬鈴薯[29]、連作切花菊[30]土壤后，發(fā)現(xiàn)生物有機(jī)肥顯著提高了連作土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量和土壤酶活性，降低了土壤真菌和病原真菌數(shù)量，這與本研究的結(jié)果基本一致。

生物有機(jī)肥施入設(shè)施黃瓜連作土壤后，土壤連作年限越長，生物有機(jī)肥修復(fù)土壤的效果越顯著。這是因?yàn)樵撋镉袡C(jī)肥中的木霉菌是病原微生物的拮抗菌，對(duì)于連作年限短的土壤，病原菌含量很少，土壤質(zhì)量較高，因而生物有機(jī)肥中只有廢棄北蟲草培養(yǎng)基和古龍酸母液可起到部分促進(jìn)細(xì)菌增殖和提高土壤酶活性的作用。隨著連作年限延長，土壤中的病原微生物急劇增多，生態(tài)質(zhì)量變差，此時(shí)生物有機(jī)肥中的木霉菌能夠充分發(fā)揮其抑制病原菌增殖的功能，同時(shí)與生物有機(jī)肥中的另外2種成分協(xié)同作用，因而展現(xiàn)出更明顯的修復(fù)效果。