• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬流行性腹瀉病毒Nsp5基因的原核表達及生物信息學分析

    2019-04-18 11:44:14劉正奎牟泓燁祝徐航王曉杜
    浙江農(nóng)業(yè)學報 2019年4期
    關(guān)鍵詞:表位蛋白酶引物

    劉正奎,吳 瑗,陳 琳,王 磊,牟泓燁,祝徐航,王曉杜,*

    (1.浙江農(nóng)林大學 動物科技學院,浙江 杭州 311300; 2.金華職業(yè)技術(shù)學院 農(nóng)業(yè)生物工程學院,浙江 金華321007)

    豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)常感染3~10日齡仔豬,可引起該豬群發(fā)生豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED),臨床癥狀以急性腸炎和脫水致死為特征的高度傳染性疾病。PEDV感染豬群,仔豬發(fā)病率和死亡率都很高,一年四季均可發(fā)病,自2011年以來,新的變異毒株開始在各地紛紛流行[1-3],現(xiàn)已出現(xiàn)在世界各個國家和地區(qū)[4-6],給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[7-8]。

    豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬α型冠狀病毒,其復制酶蛋白是由ORF1a和ORF1b基因編碼的PP1a和PP1ab前體蛋白,經(jīng)病毒編碼蛋白酶加工而成,形成至少16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural proteins,NSPs),從PP1a或PP1ab的氨基端起依次為Nsp1-16,這些蛋白在病毒的轉(zhuǎn)錄、復制、抗宿主細胞防御機制過程中發(fā)揮重要功能[9-10]。其中Nsp5被稱為3C樣蛋白酶[11],是一種富含組氨酸和半胱氨酸的蛋白酶[12],該蛋白酶具有切割活性,可以將多聚前體蛋白PP1ab切割為成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4-16[11]。除了具有切割活性外,還發(fā)現(xiàn)Nsp5是一種干擾素的拮抗分子[13],同時在病毒復制過程中,對N蛋白進行加工修飾,調(diào)節(jié)PEDV對宿主細胞的適應性[14]。因此,研究PEDV的Nsp5蛋白結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能對了解該病毒的致病機理,開發(fā)新型抗病毒藥物具有重要意義。本研究通過克隆Nsp5基因,構(gòu)建原核表達載體,在大腸埃希菌進行表達,同時利用生物信息學軟件進行結(jié)構(gòu)預測分析,為解析Nsp5的功能提供生物材料和數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    PEDV/LY/2014/04分離株來自臨床腹瀉樣本,由本實驗室分離得到,保存于浙江農(nóng)林大學動物預防醫(yī)學與公共衛(wèi)生實驗室;pET-28a(+)載體由本實驗室保存。

    1.2 主要試劑

    E.coliDH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司;T4連接酶、限制性內(nèi)切酶SalI和EcoRⅠ購自NEB公司;質(zhì)粒小提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;KOD plus Neo購自TOYOBO公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 引物設計與合成

    依據(jù)豬流行性腹瀉病毒CV777疫苗株全基因組序列(GenBank:KT323979),利用序列比對方法,找到編碼Nsp5的基因,使用DNAStar中的Primer Select軟件進行Nsp5基因片段的引物設計。設計一對擴增Nsp5基因的特異性引物,上下游引物兩端添加EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點,擴增片段大小為616 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成,如表1。

    1.3.2Nsp5基因擴增

    采用TRIZOL法提取PEDV/LY/2014/04分離株的RNA,隨機引物反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA,以此cDNA為模板進行目的片段Nsp5的PCR擴增。PCR擴增體系:rTaqMix 10 μL,dd H2O 6 μL,上下游引物各1 μL,cDNA模板2 μL,共20μL。PCR擴增條件:預變性94 ℃ 3 min;94 ℃變性45 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán),72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

    表1Nsp5基因擴增引物及鑒定引物

    Table1Nsp5 gene amplification primers and identification primers

    引物名稱Primer name引物序列Primer sequence(5’-3’)目的片段大小Product size/bpNsp5-FwdCCGGAATTCATGTTGCAGAGTGTTGCATCTACTTATGTAG616Nsp5-RevGACGTCGACTCACTGGAGCTTAACAATACGCTCACNsp5-FwdCCGGAATTCATGTTGCAGAGTGTTGCATCTACTTATGTAG705T7-TerminalGCTAGTTATTGCTCAGCGG

    1.3.3 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Nsp5構(gòu)建

    利用膠回收試劑盒將Nsp5擴增片段純化回收,利用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切,同時用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pET-28a(+)載體,酶切結(jié)束電泳后切膠回收,兩種酶切產(chǎn)物按照適宜比例,利用T4連接酶在16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物經(jīng)熱擊法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞,涂布卡那霉素的平板,37 ℃過夜培養(yǎng),挑取單個菌落進行菌落PCR鑒定。鑒定呈陽性的菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后,質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,再進行EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定,酶切鑒定正確的克隆送交上海生工生物有限公司進行測定驗證。測序驗證正確的重組質(zhì)粒命名pET-28a(+)-Nsp5。

    1.3.4 His-Nsp5重組蛋白的誘導表達

    將1.3.3節(jié)構(gòu)建正確的pET-28a(+)-Nsp5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞,涂布于含卡那霉素抗性的LB平板,37 ℃過夜培養(yǎng),分別挑選3~5個單菌落于LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)12~16 h,以此為種子液。種子液按照體積比1∶100轉(zhuǎn)接液體LB培養(yǎng)基里,當菌液的D600值在0.5~0.6時,取1 mL菌液作為誘導前樣品,加入終濃度為1 mmoL·L-1的IPTG,在37 ℃、200 r·min-1進行誘導表達,誘導6 h后取1 mL菌液作為誘導后樣品,所取樣品處理后進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色后分析重組Nsp5蛋白表達情況。

    1.3.5 His-Nsp5重組蛋白的純化

    小量表達驗證成功的克隆,擴大培養(yǎng)后進行大量誘導,收集大量誘導表達菌體后,用PBS緩沖液重懸,冰浴超聲破碎30 min,離心收集包涵體沉淀。包涵體沉淀經(jīng)尿素溶解后,在4 ℃、12 000 r·min-1離心25 min,上清移至新的離心管;將上清與平衡過的鎳柱在4 ℃結(jié)合3~4 h,待結(jié)合液流出,加入30 mL 50 mmoL·L-1咪唑洗除雜蛋白,然后緩慢持續(xù)地加入5 mL 400 mmoL·L-1咪唑洗脫目的蛋白,收集洗脫下來的目的蛋白,酶標儀測定蛋白濃度,純化得到的蛋白加入等體積100%甘油,保存于-80 ℃?zhèn)溆?。純化后目的蛋白進行SDS-PAGE電泳,分析His band Ni+純化后重組蛋白的純度和表達量。

    1.3.6 Nsp5蛋白質(zhì)的生物信息學分析

    Vector NTI Advance 軟件對Nsp5蛋白質(zhì)的化學性質(zhì)進行理論分析(包括分子質(zhì)量、等電點以及氨基酸組成等),ProtScale(http://web.Expasy.org/protscale/)分析Nsp5蛋白質(zhì)的親水性與疏水性,ABCpred服務器在線分析了Nsp5蛋白的B細胞潛在抗原表位,SOPMA服務器在線分析了Nsp5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測,Phyre2.0(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi?id=index)預測分析Nsp5蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu),Raswin軟件初步預測了Nsp5蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Nsp5基因的PCR擴增及重組表達載體的PCR鑒定

    PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示,大小約616 bp,與預期大小相符(圖1)。將Nsp5的PCR產(chǎn)物和載體pET-28a(+)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切之后,經(jīng)T4連接酶連接,熱擊轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中,得到重組載體pET-28a(+)-Nsp5。通過PCR的方法,鑒定引物為目的基因的上游引物Nsp5-Fwd和載體pET-28a(+)的T7-Terminal引物(表1),同時通過雙酶切(EcoRⅠ和SalⅠ)鑒定的方法,篩選并驗證得到陽性克隆(圖2)。陽性克隆送生物公司測序,序列比對結(jié)果表明,該序列與GenBank的PEDV毒株(KM213245)同源性高達99%,且編碼框插入正確。

    2.2 重組蛋白的誘導表達及鑒定

    將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Nsp5轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中,經(jīng)IPTG誘導,SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,在誘導后樣品泳道出現(xiàn)了特異性蛋白表達,其分子質(zhì)量約為22 ku,與預期大小相符(圖3)。針對誘導后的包涵體沉淀,采用His band Ni+柱進行純化,所得樣品進行SDS-PAGE檢測,結(jié)果獲得純度達到70%以上的重組蛋白(His-Nsp5)。

    M,DL 2000 bp DNA標準分子量;1,陰性對照;2,Nsp5基因PCR擴增產(chǎn)物。M, DL 2000 bp DNA marker; Lane 1, Negative control; Lane 2, Nsp5 gene PCR products.圖1 Nsp5基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of Nsp5 PCR products

    M,DL 2000 bp DNA 標準分子量;1,pET-28a(+)-Nsp5經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切產(chǎn)物。M, DL 2000 bp DNA marker; Lane 1, pET-28a(+)-Nsp5 digested by EcoRⅠ and SalⅠ.圖2 pET-28a(+)-Nsp5雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant pET-28a(+)-Nsp5 plasmid by double enzyme digestion

    M,低分子量標準蛋白質(zhì)Marker;1,pET-28a(+)-Nsp5未經(jīng)IPTG誘導全菌樣品;2,pET-28a(+)-Nsp5經(jīng)IPTG誘導后全菌樣品;3-5,pET-28a(+)-Nsp5包涵體純化后蛋白濃度由低到高的樣品。M, Low molecular weight standard protein marker; Lane 1, Non-induced pET-28a(+)-Nsp5; Lane 2: IPTG induced pET-28a(+)-Nsp5; Lane 3-5, Different concentrations of purified protein.圖3 Nsp5蛋白表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE analysis of Nsp5 protein expression

    2.3 豬流行性腹瀉病毒Nsp5蛋白質(zhì)的生物信息學分析

    2.3.1 理化性質(zhì)

    豬流行性腹瀉病毒的Nsp5的基因含有1個由591 bp組成的開放閱讀框,編碼196個氨基酸殘基組成的多肽,其中A+T=55.50%、C+G=44.50%,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的理論值為21 820.07 u,理論等電點(pI)為8.734,在正常生理狀態(tài)下,該蛋白帶正電荷;原子組成是C954H1553N275O291S9;正電荷殘基共有(Lys+Arg)24個,負電荷殘基(Asp+Glu)21個。該蛋白質(zhì)由16種氨基酸組成,其中Val、Ala、Ser、Arg的含量相對較多,Cys、Phe、Trp相對較少。不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)為42.90,表明這個蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為95.97,總平均親水性為-0.214。親水性分析結(jié)果表明該蛋白質(zhì)是親水蛋白質(zhì)(圖4)。

    2.3.2 Nsp5蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)預測

    SOPMA服務器預測結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)骨架(圖5)組成包含:α-螺旋(h)占55.61%、β-折疊(t)占7.65%、無規(guī)則卷曲(c)占20.92%、延伸鏈(e)占15.82%。利用Phyre2.0蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測服務器(使用Intensive選項)對Nsp5白質(zhì)進行三級結(jié)構(gòu)預測,結(jié)果顯示,所得結(jié)構(gòu)有較多的α-螺旋和無規(guī)則卷曲(圖6),結(jié)合圖5的結(jié)果,三級結(jié)構(gòu)預測和二級結(jié)構(gòu)預測基本一致。

    2.3.3 Nsp5蛋白質(zhì)B細胞表位預測

    應用ABCpred服務器對Nsp5蛋白的B細胞潛在抗原表位進行預測(閾值設定為0.51,窗口大小設定為16),結(jié)果如表2: Nsp5蛋白共有15個潛在的B細胞抗原表位,其中41—56位aa得分最高(結(jié)果按得分降序排列,得分越高則意味著是目的肽段的可能性越大),PEDV感染豬群的血清中可能存在特異性抗體。

    3 討論

    作為冠狀病毒復制啟始的主要蛋白酶,Nsp5不僅在病毒非結(jié)構(gòu)蛋白加工方面發(fā)揮重要作用,而且參與酶解宿主蛋白[15]、RNA結(jié)合以及病毒復制等過程[16-17],Zhu等[18]報道豬流行性腹瀉病毒3C樣蛋白酶通過切割NEMO調(diào)節(jié)其干擾素β拮抗作用,因此一直被認為是開發(fā)抗冠狀病毒藥物的有效靶標[19]。本研究通過利用pET-28a(+)原核表達系統(tǒng),成功構(gòu)建并在E.coliBL21(DE3)中誘導表達了PEDV/LY/2014/04分離株的重組His-Nsp5蛋白,利用生物信息學軟件分析該蛋白,為今后該病的診斷技術(shù)和免疫機制研究提供重要的基礎信息。

    圖4 Nsp5蛋白質(zhì)的親水性與疏水性分析Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of Nsp5 protein

    圖5 Nsp5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.5 Simulated secondary structure of protein Nsp5

    圖6 Nsp5蛋白質(zhì)3D構(gòu)象預測Fig.6 Prediction of the 3D structure of protein Nsp5

    表2PEDV/LY/2014/04分離株Nsp5的B細胞表位預測

    Table2Prediction of B cell epitopes of PEDV/LY/2014/04 isolateNsp5

    序號No.B細胞抗原表位潛在序列B cell epitope potential sequence位置Position/aa得分Score1HAMNVAKSEFDREAST41-560.952NARQQYEDAVNNGSPP18-330.863IWNIIDIKDNDGKVVH154-1690.854VGLPSYVIYENARQQY8-230.835TSDIDSYNRIQREGCV133-1480.826AAAQMYKEARAVNRKS67-820.817VVHVKEVTAQNAESLS167-1820.818DMSSVDTILNLAKDGV100-1150.819NRIQREGCVHYAGTIW140-1550.7810IKDNDGKVVHVKEVTA160-1750.7611VVSAMHSLLFGMLRRL84-990.7312DREASTQRKLDRMAEQ51-660.7313AESLSWPLVLGCERIV178-1930.7014DGVVPLSVIPAVSATK113-1280.6915GSPPQLVKQLRHAMNV30-450.58

    運用結(jié)構(gòu)基因組學研究方法,基因克隆、蛋白質(zhì)純化、晶體的篩選和晶體衍射數(shù)據(jù)的收集,構(gòu)建出病毒晶體結(jié)構(gòu),是研究PEDV 3C樣蛋白酶結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵技術(shù)。St. John等[12]通過X射線晶體衍射的技術(shù)分析了3C樣蛋白酶的空間結(jié)構(gòu),3C樣蛋白酶在空間群P212121中結(jié)晶為不對稱單元的二聚體。如人類冠狀病毒229E 3C樣蛋白酶[20]和SARS 3C樣蛋白酶[21]所報道的一樣,PEDV 3C樣蛋白酶是在每個單體中含有三個結(jié)構(gòu)域的同型二聚體,含有由殘基Cys144和His41形成的二元催化體系,其活性位點位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ之間的裂縫中,結(jié)構(gòu)域Ⅲ參與單體二聚化,其最終負責形成蛋白酶的活性[22]。正是因為研究者解析了該蛋白的結(jié)構(gòu),發(fā)展了許多3C樣蛋白酶抑制劑,很多抑制劑能有效抑制冠狀病毒的復制[19,23]。

    PEDV的Nsp5基因序列比對分析表明,Nsp5基因是PEDV基因組中比較保守的區(qū)段,保證了其功能正確實施。PEDV的Nsp5分子質(zhì)量理論值為21 820.07 u,理論等電點(pI)為8.734;具有多個高親水性區(qū)域,屬于親水蛋白質(zhì);SOPMA服務器(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)是常用的蛋白質(zhì)預測二級結(jié)構(gòu)在線工具,該工具可以預測蛋白二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)序列中的復雜基序、構(gòu)建蛋白質(zhì)的3D模型,Nsp5則主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成;Phyre2.0蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測服務器(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi?id=index)主要用于蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu),Nsp5則主要由螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成。ABCpred服務器(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)是采用機器學習算法,依賴于Bcipep數(shù)據(jù)庫,對固定長度的多肽進行B細胞表位預測,Nsp5蛋白共有15個潛在的B細胞抗原表位,原核表達產(chǎn)物可作為設計新型疫苗的靶標,也可作為檢測PEDV病毒抗體的ELISA檢測方法的包被抗原,可以判定是否存在PEDV的感染。

    本研究開展了Nsp5蛋白的原核表達,對其理化性質(zhì)、B細胞抗原表位、高級結(jié)構(gòu)預測方面進行了生物信息學分析,為Nsp5蛋白的研究提供了基本數(shù)據(jù)資料,可為后續(xù)深入探討Nsp5蛋白在豬流行性腹瀉病毒復制過程中的作用機理研究奠定一定的基礎,也為進一步開展PEDV的診斷技術(shù)及免疫學研究奠定了基礎。

    猜你喜歡
    表位蛋白酶引物
    H3N2流感病毒HA保守Th表位對CD4+T細胞活化及分化的影響
    DNA引物合成起始的分子基礎
    高中生物學PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    生物學通報(2022年1期)2022-11-22 08:12:18
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    思鄉(xiāng)與蛋白酶
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:30
    聯(lián)合T、B細胞表位設計多肽疫苗的研究進展①
    多胚蛋白酶 高效養(yǎng)畜禽
    火炬松SSR-PCR反應體系的建立及引物篩選
    IgA蛋白酶在IgA腎病治療中的潛在價值
    小反芻獸疫病毒化學合成表位多肽對小鼠的免疫效果研究
    亚洲四区av| 国产成人freesex在线| 久久热精品热| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美 日韩 精品 国产| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲成人一二三区av| 97超碰精品成人国产| 永久免费av网站大全| 色吧在线观看| 老司机亚洲免费影院| 91成人精品电影| 久久久久国产网址| 久久99精品国语久久久| 人人澡人人妻人| 天美传媒精品一区二区| 99热这里只有是精品在线观看| 91精品国产九色| 一级爰片在线观看| 中文天堂在线官网| 国产精品三级大全| 99热6这里只有精品| 日韩一区二区视频免费看| 免费观看在线日韩| 2018国产大陆天天弄谢| 少妇 在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美xxⅹ黑人| 精品一区二区免费观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 极品人妻少妇av视频| 嫩草影院入口| 国产深夜福利视频在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | xxx大片免费视频| 日韩欧美精品免费久久| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品色激情综合| 男男h啪啪无遮挡| 高清毛片免费看| 大香蕉久久网| 亚洲综合色惰| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品国产av在线观看| 男女边摸边吃奶| 一级a做视频免费观看| 久久久久网色| 久久婷婷青草| av网站免费在线观看视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| av不卡在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 高清午夜精品一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 老司机亚洲免费影院| 男人添女人高潮全过程视频| 国产永久视频网站| 国产综合精华液| 韩国高清视频一区二区三区| 精品酒店卫生间| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 午夜老司机福利剧场| 极品少妇高潮喷水抽搐| 永久免费av网站大全| 有码 亚洲区| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产伦理片在线播放av一区| 成人国产麻豆网| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久久久久久久丰满| 久久久久久久久久人人人人人人| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲综合精品二区| 日韩视频在线欧美| 欧美日韩成人在线一区二区| 免费大片18禁| 亚洲图色成人| 亚洲av日韩在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲性久久影院| 国产 一区精品| 高清不卡的av网站| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产成人精品久久久久久| 少妇的逼好多水| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜免费男女啪啪视频观看| 黄片无遮挡物在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 晚上一个人看的免费电影| 国产在线免费精品| 日日撸夜夜添| 老司机影院成人| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲av国产av综合av卡| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品亚洲成a人片在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 一边亲一边摸免费视频| 国产一级毛片在线| 国产精品久久久久久久电影| 激情五月婷婷亚洲| 自线自在国产av| 国产av码专区亚洲av| 在线观看三级黄色| 亚洲精品第二区| 在线精品无人区一区二区三| 桃花免费在线播放| 少妇 在线观看| 欧美+日韩+精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 校园人妻丝袜中文字幕| 免费黄频网站在线观看国产| 在线观看免费日韩欧美大片 | 欧美三级亚洲精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 视频在线观看一区二区三区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 2022亚洲国产成人精品| av国产久精品久网站免费入址| 97超碰精品成人国产| 亚洲美女黄色视频免费看| 最近中文字幕高清免费大全6| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品久久久久久久电影| 国产男女内射视频| 我要看黄色一级片免费的| 国产综合精华液| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美精品亚洲一区二区| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| av黄色大香蕉| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 久久久久久久大尺度免费视频| 丝瓜视频免费看黄片| 少妇高潮的动态图| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 丰满乱子伦码专区| 最近2019中文字幕mv第一页| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品一区二区在线观看99| 国产成人精品福利久久| 一区二区三区精品91| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 97精品久久久久久久久久精品| 十八禁高潮呻吟视频| 国产成人精品福利久久| av福利片在线| 国产视频首页在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 91国产中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 999精品在线视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 成人亚洲精品一区在线观看| av播播在线观看一区| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久久久久亚洲中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 91午夜精品亚洲一区二区三区| 人人澡人人妻人| 乱码一卡2卡4卡精品| 视频区图区小说| 成人漫画全彩无遮挡| 少妇 在线观看| 久久久欧美国产精品| 日韩人妻高清精品专区| 精品久久久久久久久av| 在线 av 中文字幕| 国产在线一区二区三区精| 国产在线免费精品| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲av成人精品一二三区| 精品少妇久久久久久888优播| 高清毛片免费看| 黄色配什么色好看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 9色porny在线观看| 欧美日韩av久久| 日韩视频在线欧美| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 2021少妇久久久久久久久久久| 午夜影院在线不卡| 成人免费观看视频高清| 亚洲美女黄色视频免费看| 成人漫画全彩无遮挡| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品国产av在线观看| 超色免费av| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 少妇的逼水好多| 日韩人妻高清精品专区| 伦理电影免费视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久欧美国产精品| 91国产中文字幕| 国产高清有码在线观看视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 欧美性感艳星| 男女无遮挡免费网站观看| 美女主播在线视频| 精品人妻熟女av久视频| 色94色欧美一区二区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 一级二级三级毛片免费看| 一个人免费看片子| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品一二三区在线看| 精品国产露脸久久av麻豆| 天堂8中文在线网| 黄色欧美视频在线观看| 美女国产视频在线观看| 丝袜在线中文字幕| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲欧美清纯卡通| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲情色 制服丝袜| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲av免费高清在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲成人手机| 黄色配什么色好看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 亚洲精品久久午夜乱码| 热99久久久久精品小说推荐| 国产成人免费观看mmmm| 久热久热在线精品观看| 国产极品天堂在线| 老司机亚洲免费影院| 久久久久久久久久久免费av| 中国国产av一级| 人体艺术视频欧美日本| 激情五月婷婷亚洲| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 成人国产麻豆网| a级毛色黄片| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美日本中文国产一区发布| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产av一区二区精品久久| 日日撸夜夜添| 伊人久久国产一区二区| 草草在线视频免费看| 熟女人妻精品中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久97久久精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 18在线观看网站| 亚洲精品日本国产第一区| 久久女婷五月综合色啪小说| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久婷婷青草| 一边亲一边摸免费视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产黄频视频在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩免费高清中文字幕av| 女性生殖器流出的白浆| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜福利,免费看| 一级片'在线观看视频| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲国产av影院在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲熟女精品中文字幕| 婷婷成人精品国产| 婷婷色麻豆天堂久久| 日本欧美国产在线视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| www.av在线官网国产| 欧美性感艳星| 国产成人一区二区在线| 国产综合精华液| 国产不卡av网站在线观看| 欧美精品国产亚洲| 欧美一级a爱片免费观看看| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲图色成人| 视频区图区小说| 欧美成人精品欧美一级黄| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 女性生殖器流出的白浆| av卡一久久| 大香蕉久久网| 国产精品久久久久久av不卡| 国产精品一区二区在线观看99| 最近中文字幕高清免费大全6| 尾随美女入室| 综合色丁香网| 免费看光身美女| 青青草视频在线视频观看| kizo精华| 一级毛片电影观看| 精品人妻在线不人妻| 久久人人爽人人爽人人片va| 成人综合一区亚洲| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 午夜福利视频在线观看免费| 一级毛片 在线播放| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 美女福利国产在线| 国产在线免费精品| 嫩草影院入口| 成人免费观看视频高清| 美女内射精品一级片tv| 精品酒店卫生间| 伦理电影免费视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 91久久精品电影网| 黄片播放在线免费| 伊人久久国产一区二区| 亚洲精品自拍成人| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 熟女电影av网| 99久国产av精品国产电影| 九九在线视频观看精品| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产 一区精品| 老司机亚洲免费影院| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 考比视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 九色亚洲精品在线播放| 黄色一级大片看看| 一级毛片 在线播放| 99九九在线精品视频| 日韩电影二区| 久久精品国产自在天天线| 人妻少妇偷人精品九色| 女人久久www免费人成看片| 免费av中文字幕在线| 九九爱精品视频在线观看| 国产永久视频网站| 美女内射精品一级片tv| 日韩在线高清观看一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 一级黄片播放器| 99视频精品全部免费 在线| 18禁在线播放成人免费| 国产成人精品一,二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 99九九线精品视频在线观看视频| 国产日韩欧美在线精品| 欧美bdsm另类| 18禁观看日本| 美女国产视频在线观看| 精品久久久噜噜| 啦啦啦在线观看免费高清www| 美女中出高潮动态图| 一边亲一边摸免费视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲国产日韩一区二区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 一本一本综合久久| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 制服诱惑二区| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品国产一区二区久久| av在线老鸭窝| 一级a做视频免费观看| 热99久久久久精品小说推荐| 久久久久久久精品精品| 成人免费观看视频高清| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 老司机亚洲免费影院| 伊人亚洲综合成人网| 一级黄片播放器| 欧美日韩在线观看h| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲伊人久久精品综合| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美 日韩 精品 国产| 日本wwww免费看| 91成人精品电影| 777米奇影视久久| 精品视频人人做人人爽| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产在线免费精品| 我要看黄色一级片免费的| 人成视频在线观看免费观看| 日韩一区二区三区影片| 少妇丰满av| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧洲日产国产| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久午夜福利片| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲av综合色区一区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 少妇精品久久久久久久| 丰满乱子伦码专区| 免费大片黄手机在线观看| 美女内射精品一级片tv| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 老司机亚洲免费影院| 色婷婷久久久亚洲欧美| 男人添女人高潮全过程视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品午夜福利在线看| 夜夜爽夜夜爽视频| 桃花免费在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产成人免费观看mmmm| 伊人久久国产一区二区| 边亲边吃奶的免费视频| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲在久久综合| 亚洲国产精品专区欧美| 51国产日韩欧美| 女性生殖器流出的白浆| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲在久久综合| 国产成人av激情在线播放 | 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩欧美精品免费久久| 欧美最新免费一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| www.av在线官网国产| 91久久精品国产一区二区成人| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美另类一区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 大片电影免费在线观看免费| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲怡红院男人天堂| 青春草国产在线视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久人人爽人人片av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 高清不卡的av网站| 成人免费观看视频高清| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久亚洲国产成人精品v| 免费av中文字幕在线| h视频一区二区三区| 国产精品三级大全| 免费看av在线观看网站| 男人操女人黄网站| 嘟嘟电影网在线观看| 91国产中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 交换朋友夫妻互换小说| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久国产精品麻豆| 日日摸夜夜添夜夜爱| 女人久久www免费人成看片| 99九九在线精品视频| 国产av码专区亚洲av| 在现免费观看毛片| 美女大奶头黄色视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 一本大道久久a久久精品| 在线天堂最新版资源| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 日韩欧美精品免费久久| 插逼视频在线观看| 亚洲综合精品二区| 最近中文字幕2019免费版| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲人成77777在线视频| 99久久综合免费| 国产精品一区二区在线观看99| av卡一久久| 国产av精品麻豆| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 最近中文字幕2019免费版| 插阴视频在线观看视频| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 制服丝袜香蕉在线| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 水蜜桃什么品种好| 2022亚洲国产成人精品| 免费看av在线观看网站| av免费观看日本| 久久久久久人妻| 七月丁香在线播放| 国产成人精品一,二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产成人aa在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 国产精品欧美亚洲77777| 精品视频人人做人人爽| 色哟哟·www| 日韩欧美一区视频在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 午夜视频国产福利| 一级二级三级毛片免费看| 99国产精品免费福利视频| 午夜免费鲁丝| 女人久久www免费人成看片| 丰满少妇做爰视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 五月天丁香电影| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 91aial.com中文字幕在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 91成人精品电影| 久久久国产一区二区| 热99久久久久精品小说推荐| 人人澡人人妻人| 大香蕉久久网| 一本久久精品| 在线看a的网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 交换朋友夫妻互换小说| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日本-黄色视频高清免费观看| 最近手机中文字幕大全| av.在线天堂| 老司机亚洲免费影院| 边亲边吃奶的免费视频| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲精品色激情综合| 国产av一区二区精品久久| 天堂8中文在线网| 国产精品一区二区在线观看99| 一本大道久久a久久精品| 美女大奶头黄色视频| 欧美丝袜亚洲另类| 搡女人真爽免费视频火全软件| 91成人精品电影| 夫妻午夜视频| 一个人看视频在线观看www免费| 一区二区三区免费毛片| 国产免费一级a男人的天堂| 久久精品国产亚洲网站| 久久精品国产自在天天线| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美另类一区| 久久久久国产网址| 一本大道久久a久久精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 99热这里只有是精品在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| tube8黄色片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日本黄色日本黄色录像| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一本色道久久久久久精品综合| 国产在线免费精品| 麻豆乱淫一区二区| 欧美精品国产亚洲| .国产精品久久| 国产69精品久久久久777片| 国产亚洲欧美精品永久| 大陆偷拍与自拍| 丝袜在线中文字幕| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲av在线观看美女高潮| 天美传媒精品一区二区|