小牛血清去蛋白對腦缺血-再灌注損傷模型大鼠血腦屏障的保護作用研究*

鄧 超，鄭永強，徐 悅

（湖北省十堰市人民醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 十堰 442000）

腦卒中又稱中風、腦血管意外，為急性腦血管疾病，其中缺血性卒中占60%～70%。腦缺血觸發(fā)的病理改變會影響血腦屏障（BBB）的通透性[1]，導致腦水腫和局部炎癥。本研究中以小牛血清去蛋白用于腦缺血-再灌注損傷模型大鼠，并分析其對模型大鼠BBB的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：清潔級SD大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量為（250±20）g，購自湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK<鄂>2017-0008，適應性喂養(yǎng)，自由進食和飲水，人工黑暗和光照交替，在體質(zhì)量達到（270±20）g時納入實驗。本研究經(jīng)醫(yī)院動物實驗倫理審查委員會批準，實驗中大鼠的處置方法符合動物倫理學要求。

儀器：JEM-2000EX型透射電鏡（日本電子光學公司）；CM3050S型冰凍切片機（德國Leica公司）；BX-51型顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

試藥：小牛血清去蛋白腸溶膠囊（錦州奧鴻藥業(yè)有限公司，國藥準字H20090346，規(guī)格為每粒5 mg，批號為 2820170104）；兔抗帶狀閉合蛋白 -1（ZO-1，美國CST公司）；免疫組化試劑盒（美國Molecular Probes公司）；伊文斯藍（EB，美國 Sigma-Aldrich 公司）。

1.2 方法

建模、分組與給藥：按隨機數(shù)字表法將100只SD大鼠分為假手術(shù)組（A組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B組，等體積0.9%氯化鈉溶液）及小牛血清去蛋白低劑量組（C1組，7.5 mg/kg，按肽量計，下同）和高劑量組（C2組，37.5 mg/kg），各 25 只。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)10 d。參考線栓法相關(guān)文獻[2]，阻斷大鼠大腦中動脈，于缺血2 h后再灌注24 h，以建立腦缺血再灌注損傷模型。觀察大鼠左側(cè)肢體肌力減弱，運動左偏，解剖未見蛛網(wǎng)膜下腔出血則表明模型復制成功。A組除不阻斷大鼠大腦中動脈外，其余操作同上。

腦組織EB染色：再灌注24 h后，于處死大鼠前1 h靜脈輸入EB 0.9%氯化鈉注射液（0.2 mL/100 g）。腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg），心臟注入0.9%氯化鈉注射液，開顱取腦，稱定大鼠腦濕質(zhì)量，切碎塊，置試管中，加4 mL甲酰胺，恒溫避光環(huán)境水浴3 d，3 000 r/min離心10 min，取上清液，于620 nm波長處測定吸光度值，計算腦組織EB含量。

BBB超微結(jié)構(gòu)觀察：再灌注48 h內(nèi)，腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg）以麻醉大鼠（40 mg/kg），其中 B 組大鼠固定再灌注 0.5，2，6，12，24 h 時麻醉。經(jīng)左心室輸注0.9%氯化鈉注射液60 mL，灌注鑭醛固定液50 mL，開顱取腦。將腦組織從視交叉向后冠狀切片成約1 mm，分別在缺血同側(cè)和對側(cè)相應部位的皮質(zhì)及底節(jié)區(qū)各取2小塊腦組織，以透射電鏡觀察再灌注0.5，2～6，12～24，48 h時大鼠BBB的超微結(jié)構(gòu)。

免疫組化：再灌注24 h后，建模成功后腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg）以麻醉大鼠，多聚甲醛心臟灌流，取腦組織，10%甲醛溶液固定24 h，并經(jīng)石蠟包埋，脫水、切片、染色。按試劑盒說明書操作，以圖像分析系統(tǒng)檢測ZO-1陽性血管數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大體、光鏡、電鏡觀察結(jié)果

大體標本可見，模型大鼠缺血側(cè)腦組織呈藍染，而對側(cè)未見藍染（見圖1），顯示大鼠腦間質(zhì)及神經(jīng)纖維腫脹，缺血處細胞變少，并同正常組織形成了移行帶。電鏡可見，B組大鼠腦組織內(nèi)皮細胞皺縮，管腔變形，基底膜斷裂；而C2組在光鏡下缺血部位有輕度間質(zhì)水腫，但不及B組的腫脹程度；腫脹程度較輕，基底膜尚未斷裂，較完整；C1組介于B組和C2組之間（見圖2）。

圖1 模型組大鼠腦組織染色大體圖

圖2 右半側(cè)大腦皮質(zhì)額葉冠狀切片電鏡觀察圖（HE，×400）

2.2 BBB超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

由圖3可見，A組大鼠腦組織非缺血區(qū)的腦血管內(nèi)皮細胞形態(tài)、內(nèi)皮細胞間的緊密連接（TJ）正常，未見鑭顆粒。再灌注0.5 h，大鼠腦組織缺血區(qū)開始腫脹，星型膠質(zhì)細胞足突有輕度腫脹，但與毛細血管基底膜連接仍較緊密；內(nèi)皮細胞出現(xiàn)腫脹，其胞質(zhì)內(nèi)線粒體增多，TJ處可見鑭顆粒。再灌注2～6 h后，大鼠缺血區(qū)腦組織腫脹，膠質(zhì)足突及血管基底膜分離，間隙增加；內(nèi)皮細胞腫脹更明顯，可見空泡，胞質(zhì)內(nèi)見到鑭顆粒；神經(jīng)纖維微管排列不整齊，細胞間隙中有鑭顆粒。再灌注12～24 h時，大鼠腦組織缺血區(qū)嚴重腫脹，結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞變性壞死，核溶解，細胞內(nèi)見到鑭顆粒；基底膜不連續(xù)；鑭顆粒經(jīng)血管漏出至腦實質(zhì)。再灌注48 h時，大鼠腦組織缺血區(qū)基本已無正常結(jié)構(gòu)，可見大量小膠質(zhì)細胞，其胞質(zhì)內(nèi)有脂滴、壞死組織等，形似泡沫細胞；內(nèi)皮細胞皺縮，胞質(zhì)電子密度變大，胞質(zhì)內(nèi)可見髓樣體。

圖3 BBB超微結(jié)構(gòu)圖

2.3 EB含量和ZO-1陽性血管檢測結(jié)果

結(jié)果見表1。與A組比較，B組大鼠腦組織EB含量顯著增加，ZO-1陽性血管數(shù)顯著減少（P<0.05）；與B組相比，C1組和C2組大鼠腦組織EB含量顯著減少，C2組ZO-1陽性血管數(shù)顯著增加（P<0.05）。

表1 各組大鼠腦組織EB含量和ZO-1陽性血管數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織EB含量和ZO-1陽性血管數(shù)比較（±s）

注：與A組比較，#P<0.05；與B組比較，*P<0.05。

組別A組B組C1組C2組EB 含量（μg/g）10.53±1.28 54.69±2.20#49.52±2.27*44.91±3.15*ZO-1陽性血管數(shù)（條）9±2 2±1#3±1 4±2*

3 討論

BBB是腦組織結(jié)構(gòu)的一部分，對神經(jīng)系統(tǒng)有保護作用，微血管內(nèi)皮細胞是BBB的基本組成部分，它們形成了保障局部環(huán)境穩(wěn)定的第一道防線[3]。缺血再灌注后，缺血半暗帶組織可繼續(xù)存活[4]；但再灌注會導致代謝失衡[5]，使乳酸、炎性因子及自由基等生成過多[6]，令細胞骨架變化，細胞間連接數(shù)量變少[7]，BBB通透性升高[8]。ZO-1是TJ的重要成分[9]，可參與TJ跨膜蛋白的聯(lián)系[10]，其對生化反應敏感[11]，腦缺血時，能及時應答炎性細胞因子[12]，導致相關(guān)復合體解離，最終影響B(tài)BB[13]。

本研究結(jié)果顯示，大鼠缺血區(qū)腦組織BBB通透性改變的程度與再灌注的時間緊密相關(guān)。再灌注0.5 h時，BBB的TJ開放；再灌注2～6 h時，內(nèi)皮細胞出現(xiàn)空泡化，胞質(zhì)有吞噬的鑭顆粒，說明胞膜的通透性開始增大，足突與基底膜開始分離，鑭顆粒沉積在細胞間隙；再灌注12～24 h后，BBB結(jié)構(gòu)嚴重破壞，大量鑭顆粒漏入腦實質(zhì)；再灌注48 h，內(nèi)皮細胞不完整，大量神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞壞死崩解，小膠質(zhì)細胞胞質(zhì)內(nèi)充滿的脂滴和壞死組織形成的類似泡沫細胞的結(jié)構(gòu)提示組織開始修復。說明BBB的通透性在再灌注24 h內(nèi)逐漸升高，在48 h后逐漸降低。腦缺血模型大鼠腦組織ZO-1陽性血管數(shù)顯著減少，EB含量增多，腦水腫程度加重。其原因可能為再灌注增加的炎性因子降低了ZO-1表達，引起內(nèi)皮細胞的骨架變化，跨膜蛋白的連接程度變小，BBB通透性改變，局部穩(wěn)態(tài)失衡。與B組比較，C1組和C2組大鼠腦組織EB含量顯著減少，C2組ZO-1陽性血管數(shù)顯著增加。表明小牛血清去蛋白可影響ZO-1蛋白表達，從而維系TJ復合體的結(jié)構(gòu)，進而保護BBB。

綜上所述，小牛血清去蛋白對腦缺血再灌注損傷模型大鼠BBB具有保護作用，其機制可能與穩(wěn)定缺血區(qū)腦細胞和增強ZO-1表達有關(guān)。