丙硫菌唑?qū)Π唏R魚的安全性評價及其生物富集行為研究

郭寶元，張洋，王松雪

1. 國家糧食和物質(zhì)儲備局科學(xué)研究院，北京 100037 2. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，中國科學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，北京 100085

丙硫菌唑，化學(xué)名為2-(2-(1-氯環(huán)丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羥丙基)-1-2-二氫-3-1,2,4-三唑-3-硫酮，英文名prothioconazole，CAS號178928-70-6，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。熔點139.1～144.5 ℃，Henry常數(shù)<3×10-5Pa·m3·mol-1，飽和蒸氣壓(20 ℃)<4×10-7Pa，LogKow(20 ℃)為4.05，水中溶解度(20 ℃，pH=7)為0.3 g·L-1[1-2]。丙硫菌唑是一種廣譜三唑類殺菌劑，主要防治由子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌等3類致病菌引起的病害，用于防治禾谷類作物小麥、大麥和水稻等的多種病害，同時對油菜、花生、豆類、黃瓜和番茄等的眾多病害防治效果也非常好[3-5]。自2004年首獲登記以來已在全球60多個國家登記并銷售，在殺菌劑中就占據(jù)了重要地位。2015年，全球擁有5.00億美元以上銷售額的殺菌劑只有8個，丙硫菌唑以8.00億美元的銷售額位居第三。雖然國內(nèi)目前登記工作剛剛開始，根據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng)公布的數(shù)據(jù)，迄今為止，僅海利爾和久易農(nóng)業(yè)2家企業(yè)完成原藥登記，海利爾、久易農(nóng)業(yè)和溧陽中南化工3家企業(yè)進(jìn)行了3種制劑登記，綜合來看，丙硫菌唑在國內(nèi)市場應(yīng)該是一種非常有前景的殺菌劑[1-2]。

圖1 丙硫菌唑結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The structural of prothioconazole

一般來說，農(nóng)藥在施用后，只有少部分能夠到達(dá)其靶標(biāo)，大部分會落入土壤，同時滯留在植株上的農(nóng)藥也會通過雨水沖刷而進(jìn)入土壤，然后通過地表徑流，進(jìn)入水體，從而危害水生生物的安全[6]。因此，對于農(nóng)藥的安全評價需要考察其對水生動植物的安全性。同時，考慮到丙硫菌唑的logKow為4.05，具有比較高的疏水性，其在水生生物體內(nèi)的累積作用也是不可忽視的[1]。國內(nèi)丙硫菌唑的登記工作剛剛開始，目前，丙硫菌唑的研究還多集中于合成工藝優(yōu)化[7-9]、藥效評價[3-5]與殘留方法[10-11]等方面，對于其環(huán)境安全評價研究還比較少。筆者近來發(fā)現(xiàn)了丙硫菌唑在生物體內(nèi)代謝和累積規(guī)律[12]，以此為基礎(chǔ)，本文開展了丙硫菌唑?qū)Π唏R魚的安全性評價及其在魚體內(nèi)的生物累積效應(yīng)，以評估丙硫菌唑施用后，對水生生物的風(fēng)險。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

TSQ Quantum Access MAX液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；湘儀離心機1850(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。Mettler Toledo pH計(梅特勒-托利多國際有限公司)；上海雷磁JPB-607A型溶解氧分析儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

二氯甲烷(分析純)和乙腈(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(北京)；乙腈(色譜純)和甲酸(色譜純)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。95%丙硫菌唑原藥和50%丙硫菌唑水分散粒劑由農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥鑒定所惠贈，丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)品(99.5%)購自Sigma-Aldrich。涉及流動相、提取等試驗步驟的用水采用Millipore超純水設(shè)備制備。暴露用水為經(jīng)過曝氣的自來水。

暴露試驗用水：試驗用水為存放并去氯處理24 h以上的自來水。水質(zhì)硬度在10～250 mg·L-1之間(以CaCO3計)，水溫控制在20～25 ℃，pH在6.0～8.5之間，并且試驗期間pH變化量在±0.5之間，溶解氧保持在試驗溫度下飽和值的60%。

供試魚：試驗用魚為斑馬魚(Brachydaniorerio)，試驗用斑馬魚為實驗室繁育。選取健康無病、大小一致的斑馬魚為試驗對象。試驗前在與試驗時相同的環(huán)境條件下馴養(yǎng)7 d，馴養(yǎng)期間每天喂食0.02 g，每日光照12 h，及時清除糞便及食物殘渣。

1.2 試驗方法

1.2.1 液相色譜質(zhì)譜分析方法

液相色譜質(zhì)譜(High Performance Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, HPLC-MS)條件如下：流動相為V(0.33%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=10∶90，流速為0.2 mL·min-1，色譜柱型號為Hypersil GOLD25002-102130 (100 mm×2.1 mm)，柱溫為30 ℃，樣品室溫度為20 ℃，進(jìn)樣方式為自動進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為5 μL，保留時間為1.75 min，離子源類型為ESI-，離子源溫度為350 ℃。

水樣前處理方式：5 mL樣品，用5 mL二氯甲烷漩渦振蕩3 min，重復(fù)提取一次，合并二氯甲烷。取5 mL二氯甲烷濃縮近干，用5 mL乙腈定容，超聲3 min，過0.22 μL有機濾膜，待測。

魚體前處理方式：1 g斑馬魚(濕重)研磨，加20 mL乙腈，浸泡振蕩過夜，離心5 min，取上清液過膜，待測，濃度高的，稀釋后進(jìn)樣。

1.2.2 急性毒性試驗

急性毒性試驗方法參考《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則 第12部分：魚類急性毒性試驗》(GB/T 31270.12—2014)。取50%丙硫菌唑水分散粒劑2.0011、4.0019 g，用曝氣自來水分別溶解定容至1 000、2 000 mL，混合后得到理論濃度為1.00 g a.i.·L-1儲備液，使用0.45 μm濾膜過濾后得到溶液濃度為41.2 mg a.i.·L-1?？瞻字胁惶砑愚r(nóng)藥成分，其他保持一致。

用曝氣水將儲備液稀釋為1.50、1.81、2.16、2.60和3.11 mg a.i.·L-15個濃度組。溶液配制如表1所示。

試驗各濃度組均不設(shè)重復(fù)，在每個燒杯中加入2 L供試藥液或試驗用水后，分別放入10尾試驗魚。試驗周期為96 h，每隔24 h更換原有藥液。分別在試驗開始后0、24、48和72 h及試驗結(jié)束時，測定并記錄試液的溫度、pH值和溶解氧含量。并在試驗開始后6、24、48和72 h及試驗結(jié)束時，觀察并記錄試驗魚的中毒癥狀和死亡數(shù)目。

分別在試驗開始后0和24 h更換試驗溶液之前從各處理組取100 mL的供試物溶液，于冰箱中保存，用于丙硫菌唑水體濃度檢測。

計算各濃度組在試驗開始后24、48、72和96 h試驗魚的累計死亡率。采用SPSS軟件的Probit法計算各時間點的半數(shù)致死濃度LC50及其95%置信區(qū)間。

1.2.3 斑馬魚生物富集

生物富集試驗參考國家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則 第7部分：生物富集試驗》(GB/T 31270.7—2014)。稱取1.4 g 95%丙硫菌唑原藥，用水定容至1 000 mL，得到濃度為1 330 mg·L-1的儲備液，過膜后濃度為204 mg·L-1。

斑馬魚急性毒性試驗結(jié)果顯示，96 h-LC50為2.0 mg·L-1。試驗溶液配制濃度分別為96 h-LC50的1/100和1/10，即0.02和0.2 mg·L-1。

根據(jù)設(shè)定濃度，配制2 L試驗水，每種濃度各16缸，每缸放置5條斑馬魚，同時設(shè)置空白。每24 h更換藥液。

于0、24、48、96、144和192 h分別從各處理中取水樣與魚樣，測定水樣與魚樣中的供試物含量。

檢測魚體攝入丙硫菌唑的實際值。魚體對丙硫菌唑的富集系數(shù)按公式(1)計算[12-16]。

(1)

式中：BCF為生物富集系數(shù)(bioconcentration factor)；Cfs為魚體內(nèi)的供試物含量(mg·kg-1)；Cws為水體中的供試物含量(mg·L-1)。

表1 50%丙硫菌唑水分散粒劑對斑馬魚急性毒性試驗結(jié)果Table 1 Acute toxicity test results of 50% prothioconazole in Brachydonio rerio

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 LC-MS/MS分析方法

樣品測定的LC-MS/MS分析方法中，線性范圍為0.002～1.0 mg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y= 294910x+13626，R2= 0.9931；色譜圖中，在丙硫菌唑出峰的位置沒有干擾峰；在水中加入丙硫菌唑原藥儲備液，使其濃度為0.08和1.0 mg·L-12個濃度，平均添加回收率為96.71%和90.64%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.56%和2.54%；在魚體中加入丙硫菌唑原藥儲備液，使其濃度為0.05和10.0 mg·kg-12個濃度，平均添加回收率為85.83%和91.35%，RSD為3.66%和3.16%。方法以3倍信噪比計算的話，檢測限(LOD)<0.002 mg·L-1的定量限(LOQ)時，以實際添加回收濃度為準(zhǔn)，水中為0.08 mg·L-1，魚中為0.05 mg·kg-1。該方法能夠滿足水中/魚體中丙硫菌唑的測定要求。

2.2 丙硫菌唑?qū)Π唏R魚的急性毒性

試驗期間pH值為7.6～8.1，水溫為22.5～23.1 ℃，溶解氧為67%～77%，符合試驗要求。試驗期間空白對照試驗用魚并未出現(xiàn)異常情況。在試驗開始后6 h，設(shè)定濃度為1.50、1.81和2.16 mg a.i.·L-1的處理組中試驗魚在燒杯底部集群游動；設(shè)定濃度為2.60、3.11 mg a.i.·L-1的處理組試驗魚反應(yīng)激烈，有竄游、側(cè)翻及失去平衡現(xiàn)象。試驗結(jié)束后，所有5個設(shè)定濃度1.50、1.81、2.16、2.60和3.11 mg a.i.·L-1處理組均出現(xiàn)試驗用魚游動能力下降、躺于容器底部和死亡癥狀。

丙硫菌唑的設(shè)定濃度為1.50、1.81、2.16、2.60和3.11 mg a.i.·L-1，0、24 h后對應(yīng)的試驗用水中供試物含量均大于設(shè)定濃度的80%。

依據(jù)表1的實驗結(jié)果，計算丙硫菌唑?qū)Π唏R魚的急性毒性，結(jié)果如表2所示。

大部分三唑類對大多數(shù)非靶標(biāo)生物毒性比較低[17]，對魚類表現(xiàn)出中等毒性[18-19]。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》中對魚類毒性等級的劃分標(biāo)準(zhǔn)，50%丙硫菌唑水分散粒劑對斑馬魚急性毒性指標(biāo)96 h-LC50在1.00～10.0 mg a.i.·L-1范圍內(nèi)，屬“中毒”級。

2.3 丙硫菌唑在斑馬魚體內(nèi)的生物累積效應(yīng)

根據(jù)丙硫菌唑的LC50設(shè)置丙硫菌唑在斑馬魚體內(nèi)的富集試驗濃度，采用1/10和1/100 LC50進(jìn)行生物富集的試驗，結(jié)果如圖2所示。依據(jù)試驗結(jié)果，丙硫菌唑在斑馬魚體內(nèi)存在生物富集效應(yīng)。從暴露開始，丙硫菌唑在斑馬魚體內(nèi)快速累積，在0.02 mg·kg-1(1/100 LC50)水平下暴露24 h后，斑馬魚體內(nèi)的丙硫菌唑的濃度達(dá)到0.302 mg·kg-1，BCF24 h為15。隨后，斑馬魚體內(nèi)的丙硫菌唑逐步增加。4 d(96 h)時，斑馬魚體內(nèi)的丙硫菌唑濃度基本達(dá)到平衡，BCF達(dá)到30.34；到192 h(8 d)時，斑馬魚體內(nèi)的濃度達(dá)到0.733 mg·kg-1，BCF8 d緩慢增長到34.36。

圖2 丙硫菌唑富集系數(shù)(BCF)與暴露濃度和暴露時間的關(guān)系圖注：1/100和1/10 LC50的濃度為0.02、0.2 mg·kg-1。Fig. 2 Variation of bioconcentration factor (BCF) of prothioconazole vs exposure time in Brachydanio rerio at different treatment concentrationsNote: 1/100 and 1/10 LC50 of the prothioconazole concentrations are 0.02 and 0.2 mg·kg-1.

表2 50%丙硫菌唑水分散粒劑對斑馬魚急性毒性試驗的LC50Table 2 Acute toxicity test results (LC50) of 50% prothioconazole in Brachydonio rerio

在1/10 LC50(0.2 mg·L-1)水中，24 h后，斑馬魚體內(nèi)的丙硫菌唑的濃度就達(dá)到0.302 mg·kg-1，BCF24 h為16.69，與1/100 LC50相當(dāng)水平。而經(jīng)過24 h暴露后，斑馬魚體內(nèi)的丙硫菌唑濃度基本達(dá)到平衡。隨后斑馬魚體內(nèi)的丙硫菌唑濃度緩慢增加，生物富集因子也小幅增長，到192 h時，斑馬魚體內(nèi)的丙硫菌唑濃度為4.198 mg·kg-1，BCF8 d值為19.72。

大部分三唑類農(nóng)藥包括丙硫菌唑在水體中水解緩慢，而在生物體內(nèi)也具有比較高的穩(wěn)定性，同時，它疏水性強，在生物體內(nèi)的降解速度比累積速度慢，容易在生物體內(nèi)累積[14-16]。經(jīng)過8 d暴露，在低濃度下，生物富集因子可以達(dá)到35.36，而在比較高的環(huán)境濃度下，生物富集因子也可以達(dá)到19.72。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則 第7部分：生物富集試驗》(GB/T 31270.7—2014)中農(nóng)藥生物富集性評價標(biāo)準(zhǔn)(如表2所示)在10

丙硫菌唑?qū)Π唏R魚有一定的毒性，毒性等級為中毒，同時，在斑馬魚體內(nèi)還存在生物累積效應(yīng)，累積效應(yīng)為中等富集性。因此，丙硫菌唑的風(fēng)險，可能會通過食物鏈放大。在丙硫菌唑的推廣和使用的過程中，應(yīng)該考慮到其潛在的環(huán)境風(fēng)險。