冷凍脅迫對蘆薈葉肉細胞原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響

張海嬌，徐長山，邵海玲，喬金，何惠敏，鄭博文

東北師范大學紫外光發(fā)射材料與技術(shù)教育部重點實驗室，長春130024

凍害是造成巨大農(nóng)業(yè)損失和植物死亡的主要因素，研究冷凍脅迫對植物的影響，對于揭示凍害機理，尋找抗凍害途徑，減少因低溫和凍害造成的農(nóng)作物損失具有重要意義。目前，有關(guān)冷凍脅迫的研究主要集中在抗寒基因和基因表達產(chǎn)物、抗氧化防御系統(tǒng)、離子濃度變化和離子流、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等方面[1-3]。Zhu等[4]的研究表明，冷害會影響水稻細胞中抗氧化活性酶的活性，生成活性氧。Kazemishahandashti等[5]對鷹嘴豆苗進行冷凍處理，發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸比率有所增加，CaCAT和CaSOD基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，并生成大量的防御酶。Ma等[6]對水稻進行低溫處理后檢測其根部細胞的鈣離子(Ca2+)流，發(fā)現(xiàn)胞外的Ca2+會快速流入細胞內(nèi)，COLD1基因超表達，水稻細胞對Ca2+的吸收極其強烈，表明COLD1可通過調(diào)控Ca2+來激活水稻的抗寒響應(yīng)。

植物細胞中的Ca2+在抗逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中一直備受人們關(guān)注。當細胞受低溫、高溫和鹽堿等外部刺激時，早期的細胞信號事件幾乎都是Ca2+的變化[7]，影響了細胞內(nèi)Ca2+水平平衡，形成鈣信號被相應(yīng)細胞器識別[8-10]?，F(xiàn)已有大量冷凍脅迫的研究數(shù)據(jù)證明，植物細胞內(nèi)的Ca2+在感應(yīng)、傳導(dǎo)抗寒信號和誘導(dǎo)生理響應(yīng)過程中起著重要的作用。當植物受冷凍脅迫時，Ca2+會流進植物細胞內(nèi)，引起細胞內(nèi)部Ca2+濃度升高，誘導(dǎo)植物細胞內(nèi)抗寒基因的表達[11-12]。Zheng等[13]使用化學定位法研究了冷凍脅迫下枇杷葉肉細胞Ca2+分布的變化，發(fā)現(xiàn)冷凍脅迫首先會誘導(dǎo)Ca2+進入細胞內(nèi)，并在葉綠體膜上聚集，最終進入葉綠體。van der Luit等[14]對低溫脅迫下的煙草幼苗進行了研究，發(fā)現(xiàn)低溫會使細胞質(zhì)和細胞核中Ca2+濃度快速升高，誘導(dǎo)NpCaM-1的表達。Mori等[15]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)低溫會觸發(fā)細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的迅速升高。目前的這些研究大多是檢測組織、細胞或細胞器中Ca2+的分布、濃度變化和離子流來研究植物在受冷凍脅迫時的抗逆反應(yīng)。但通過檢測冷凍脅迫下原生質(zhì)體破裂產(chǎn)生的Ca2+濃度信號來分析其細胞液中Ca2+分布的研究仍比較少。

在眾多離子中，鈉離子(Na+)的主要生理作用是增加細胞的滲透勢。當植物吸收大量的Na+后，其胞內(nèi)的電解質(zhì)濃度增加，組成原生質(zhì)體的膠體會發(fā)生膨脹，從而提高了原生質(zhì)的親水性，增加了細胞的保水力[16]。低濃度的Na+對小麥、玉米、大豆、棉花和藻類等植物的生長都有促進作用[17]。在1979年，Brownell和Crossland[18]就已經(jīng)證實，Na是C4植物的必需營養(yǎng)物質(zhì)，如鹽生植物濱藜和白刺，Na元素的缺失會導(dǎo)致葉片枯黃，生長延緩。而高濃度的Na+很容易對植物造成毒害，破壞細胞膜和使一些蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，影響細胞的生理活動，如細胞分裂和生長、代謝及礦質(zhì)營養(yǎng)元素的動態(tài)平衡等方面，抑制植物生長發(fā)育[19-20]。目前對Na+的研究主要集中在植物鹽害和抗鹽性方面[21]，但對冷凍脅迫下植物細胞中Na+分布的相關(guān)研究比較少。

近幾年來，由于納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料逐漸以各種方式滲透到人們的生產(chǎn)生活中。氧化鋅納米粒子(ZnO NPs)由于其獨特的物理、化學特性被應(yīng)用到陶瓷、紡織、醫(yī)藥、防曬化妝品和太陽能電池等方面[22]。ZnO NPs可以通過水、土壤和空氣等方式對人類、動物和植物造成影響[23]。當前，有關(guān)ZnO NPs對動植物產(chǎn)生負面影響的報道比較多。如陳澤林等[24]發(fā)現(xiàn)ZnO NPs對處于吸脹階段、萌動階段和發(fā)芽階段的小麥都有毒性作用。Boonyanitipong等[25]的研究表明，ZnO NPs可以阻礙水稻根生長，并減少根的數(shù)量。但還有研究表明，ZnO NPs在一定條件下，對植物的生長發(fā)育具有積極作用。Prasad等[26]使用粒徑為25 nm、濃度為1 000 mg·L-1的ZnO NPs處理花生種子，發(fā)現(xiàn)花生幼苗的萌芽和生存能力都得到了顯著的提升。Pavani等[27]報道稱，ZnO NPs增加了鷹嘴豆新鮮和干燥的重量，促進了其芽、根的伸長。Abdel Latef等[28]研究發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs還可以減輕其他類型的非生物脅迫對植物所造成的影響。使用粒徑為21.3 nm的不同濃度ZnO NPs(20、40和60 mg·L-1)澆灌鹽漬土栽培(150 mmol·L-1NaCl)的羽扇豆，發(fā)現(xiàn)ZnO NPs不但促進了光合色素、酚類化合物和抗壞血酸的形成，還增強了超氧化物歧化酶、氧化氫酶和氧化物酶的活性。與未經(jīng)ZnO NPs處理鹽漬土栽培的羽扇豆相比，鹽漬土抑制可其生長，減少葉綠素的色素沉淀，削弱過氧化氫酶的活性。但對于植物冷凍脅迫的研究，目前尚未有研究涉及ZnO NPs在植物受冷凍脅迫中的作用。

使用離子選擇性微電極檢測蘆薈(Aloevera)原生質(zhì)體破裂時形成的Ca2+濃度脈沖，同時檢測Na+濃度作為對比，研究了冷凍脅迫對原生質(zhì)體中Ca2+的分布的影響。并研究了冷凍溫度、解凍時間和ZnO NPs處理等因素對冷凍脅迫下蘆薈原生質(zhì)體中離子的分布的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 蘆薈(Aloe vera)細胞原生質(zhì)體的制備

使用分析天平(XS205DU，精度十萬分之一，Switzerland)稱取2.186 g甘露醇(≥80.5%，中國惠世生化試劑有限公司)、0.222 g二水合氯化鈣(≥98%，西隴化工有限公司)、0.040 g磷酸二氫鉀(≥99.5%，北京化工廠)、0.400 g纖維素酶(U·g-1>15 000，國藥集團化學試劑有限公司)和0.280 g果膠酶(1.18 U·mg-1，Sigma Aldrich)放入燒杯中，加入20 mL去離子水，用磁力攪拌器(CL-2，鞏義市予華儀器有限公司)攪拌。再將得到的溶液進行離心(DT5-6，北京現(xiàn)代北利離心機有限公司)，轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1，時間8 min。取其上清液倒入燒杯中，酶解液制備完成。取長勢優(yōu)良的蘆薈葉片，用去離子水洗凈，把表面水分吸干，切成3 cm的小段，去除葉片表面透明表皮和中間透明膠質(zhì)層后，切成4 mm寬的小條。取4 g左右的葉片，放入盛有20 mL酶解液的燒杯中，用封口膜將燒杯口封住。放入恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWYR-240，上海智誠分析儀器制造有限公司)中，黑暗條件下進行酶解，溫度為20 ℃，轉(zhuǎn)速為60 r·min-1，時間4 h左右。為促進酶解，每隔1 h搖瓶一次。

酶解后得到含有原生質(zhì)體、維管成分和未酶解完全的葉子殘片等的混合液，用200目的網(wǎng)篩過濾，得到初步純化的蘆薈原生質(zhì)體，靜止放置。為減少酶解液中含有的離子對后續(xù)測量的干擾，在測量前需用無鈣、無鈉培養(yǎng)基(濃度為109.3 mg·L-1的甘露醇溶液)清洗原生質(zhì)體。用膠頭滴管吸除原生質(zhì)體上層的酶解液，向其加入20 mL無鈣、無鈉培養(yǎng)基，靜置20 min。如此反復(fù)清洗4次，加入20 mL無鈣、無鈉培養(yǎng)基，室溫下靜止放置，備用。

1.2 離子選擇微電極的制備及表征

1.2.1 離子微電極的制備

使用微電極拉制儀(WD-2，成都儀器廠)拉制玻璃微電極，設(shè)置加熱指數(shù)為300，硼硅酸鹽玻璃管(B150-110-10，外徑1.5 mm，內(nèi)徑1.10 mm，長度10 cm，Sutter Instrument)經(jīng)電阻圈加熱軟化，重錘下拉，得到微電極管。先將微電極管放置在溫度為200 ℃的干燥箱中(DHG-9140A，鞏義市予華儀器有限公司)，進行預(yù)干燥處理1 h。再采取尾端注入法對微電極管進行硅烷化。然后在微電極管中灌充濃度為10-1mg·L-1的CaCl2或NaCl電解液，并在微電極尖端吸入液體離子交換劑。最后插入Ag/AgCl絲作為內(nèi)參比電極，鈣或鈉離子選擇性微電極制備完成[29-30]。

1.2.2 離子選擇性微電極的表征

離子選擇性微電極在使用之前需對其進行性能檢測，從線性范圍、檢測下限、響應(yīng)時間和穩(wěn)定性4個方面對所制備的Ca2+、Na+選擇性微電極進行了表征，如圖1所示。

由圖1(a)、(b)中可知，Ca2+、Na+選擇性微電極在標定液濃度10-1～10-5mol·L-1范圍內(nèi)都有良好的響應(yīng)，回歸系數(shù)分別為0.9991、0.9996，檢測下限均可達10-5mol·L-1。圖1(c)為微電極在10-3mol·L-1的標定液中，連續(xù)檢測3 h內(nèi)的電位值，平均電位值分別為-(14.46±0.24)、-(52.44±0.59) mV，穩(wěn)定性都良好。圖1(d)為Ca2+、Na+選擇性微電極在不同濃度標定液中的響應(yīng)時間，分別為(0.550±0.016)、(0.646±0.014) s，都小于1 s，響應(yīng)性能良好。以上情況說明，制得的Ca2+、Na+選擇性微電極具有良好的性能，滿足實驗的要求。

1.3 ZnO NPs的表征及懸浮液的配制

1.3.1 ZnO NPs的表征

圖2(a)、(b)分別為ZnO NPs(Sigma Aldrich)的XRD譜和TEM圖。在圖2(a)中，經(jīng)與PDF#36-1415卡片對照后，發(fā)現(xiàn)測試譜中的所有衍射峰與標準譜完全一致，說明該物質(zhì)為六角纖鋅礦型ZnO，未見其他雜相存在。由圖2(b)可以看出ZnO NPs形狀呈球形，形貌均勻，平均直徑約為20 nm。

1.3.2 ZnO NPs懸浮液的配制

用分析天平稱取0.60、1.00、1.40和1.80 mg的ZnO NP放入燒杯中，分別加入20 mL無鈣、無鈉培養(yǎng)基。水浴超聲(KQ-250DB，350 W，昆山市超聲儀器有限公司)10 min，配制成濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1的ZnO NP懸浮液。

1.4 蘆薈原生質(zhì)體的冷凍處理

用膠頭滴管吸除原生質(zhì)體層上的培養(yǎng)基，搖晃燒杯，用移液槍吸取原生質(zhì)體向6只培養(yǎng)管中各滴入1 000 μL，注入5 mL的無鈣、無鈉培養(yǎng)基。其中1只室溫下保存，5只放入冰箱冷凍處理，使其溫度分別降至10 ℃、0 ℃、-5 ℃、-7 ℃和-10 ℃，取出后室溫下靜止放置，使已結(jié)冰的培養(yǎng)基完全解凍，溫度恢復(fù)到室溫待用。

1.5 用ZnO NPs進行預(yù)處理和后處理

預(yù)處理：將蘆薈原生質(zhì)體隨機分成約等量的4組，每組4份。取其中一組，分別注入5 mL不同濃度的ZnO NPs懸浮液(30、50、70和90 mg·L-1)，放入冰箱冷凍處理，待溫度降至-7 ℃后取出解凍，使其溫度恢復(fù)到室溫。

后處理：再取一組，分別滴入裝有5 mL的無鈣、無鈉培基的培養(yǎng)管中，放入冰箱中冷凍結(jié)冰后取出。靜止放置，待其溫度恢復(fù)到室溫時，去除上層培養(yǎng)基，注入不同濃度的ZnO NPs懸浮液(30、50、70和90 mg·L-1)各5 mL，處理20 min。

最后取剩余2組，分別加入5 mL的不同濃度ZnO NPs懸浮液，靜止室溫下分別處理3和18 h。

1.6 離子脈沖信號的檢測

為降低實驗環(huán)境中可能存在的震動和電磁輻射對測量信號的干擾，實驗需在金屬屏蔽網(wǎng)中的防震臺上進行。先將Ca2+、Na+選擇性微電極和作為參比的甘汞電極分別固定在三維微操縱儀上，并與微電極放大器(SWF-1D，成都儀器廠)的前級相連(Ca2+、Na+選擇性微電極分別接到不同的輸入通道)。將樣品池(10 mL無菌培養(yǎng)皿)放在倒置顯微鏡(CPX41，Olympus)的操作臺上，將甘汞電極移到距樣品池底部約0.5 cm處，緩慢將Ca2+、Na+選擇性微電極靠近樣品池底部并固定。將倒置顯微鏡調(diào)至4倍物鏡，調(diào)節(jié)三維操縱儀使得2支選擇性微電極在視野中央。再將物鏡切換到10倍，細調(diào)三維微操縱儀使Ca2+、Na+選擇性微下降至樣品池底部，需保持2只微電極的尖端同時在視野中。最后用移液槍吸取50 μL的待測原生質(zhì)體，滴入裝有10 mL低滲液(濃度為0.0273 mg·L-1的甘露醇溶液)的培養(yǎng)管中，輕輕搖晃均勻后緩慢倒入樣品池中。保證甘汞電極和Ca2+、Na+選擇性微電極同時浸沒在溶液中。通過顯微鏡在視野中找到一個原生質(zhì)體作為待測目標，并且視野中應(yīng)沒有其他原生質(zhì)體存在。將Ca2+、Na+選擇性微電極分別移動到目標原生質(zhì)體附近，使2支選擇性微電極的尖端盡量靠近該原生質(zhì)體的同一位置。關(guān)閉屏蔽網(wǎng)，生理信號采集系統(tǒng)(RM6240B，成都儀器廠)開始記錄并將信號顯示在顯示器上。觀測到原生質(zhì)體破裂的脈沖信號后，再等待電位恢復(fù)平穩(wěn)停止記錄，保存數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計學方法

每組實驗重復(fù)3次，每次實驗中從每組原生質(zhì)體中隨機選取3個原生質(zhì)體(合計每組9個原生質(zhì)體)進行離子濃度脈沖測試，用SPSS 22.0軟件(SSPS Inc.)對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。采用ANOVA方法對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(檢驗標準為P<0.05)。*表示P<0.05，**表示P<0.01。實驗數(shù)據(jù)表述為平均值±標準偏差。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 冷凍對原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響

未經(jīng)冷凍和經(jīng)冷凍處理的蘆薈原生質(zhì)體破裂時的Ca2+、Na+脈沖信號(以電極電位表示，下同)如圖3所示。由圖3(a)可知，未經(jīng)冷凍處理的Ca2+、Na+信號在原生質(zhì)體破裂前電位相對平穩(wěn)，對應(yīng)背景離子濃度。當原生質(zhì)體開始破裂時，其周圍的Ca2+濃度明顯上升，直至離子濃度達到一個峰值，這段時間為T1，計算得到T1=(11.5±2.2) s。之后隨著Ca2+慢慢向周圍擴散，Ca2+濃度慢慢開始下降，直至趨于平穩(wěn)，回復(fù)到背景濃度。整個過程結(jié)束后形成了一個向上的脈沖信號。這個脈沖信號為一個單一的脈沖，沒有疊加其他細節(jié)，表明原生質(zhì)體內(nèi)Ca2+濃度分布比較均勻。Na+濃度脈沖信號與此類似，原生質(zhì)體開始破裂到達到峰值所用時間為t1，計算得到t1=(4.0±0.98) s。圖3(b)為經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體破裂時產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。與圖3(a)對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍處理后，Ca2+的脈沖信號發(fā)生了明顯變化。雖然在破裂前Ca2+的濃度仍保持在背景濃度上，但當原生質(zhì)體開始破裂時，經(jīng)冷凍處理后的原生質(zhì)體周圍的Ca2+濃度并未像未經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體那樣快速上升，反而先顯著地下降達到一個最低點，緊接著才迅速上升，在Ca2+濃度脈沖的前沿處形成一個明顯的“凹陷”，從原生質(zhì)體破裂到凹陷恢復(fù)所用時間為T2，經(jīng)計算得到T2=(11.3±1.5) s，形成凹陷的深度為H，計算得H=(16.9±2.4) mV，從原生質(zhì)體破裂到脈沖最高點所用時間T1’=(19.8±3.0) s。而經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體的Na+的濃度脈沖信號則與未經(jīng)處理的原生質(zhì)體破裂時的離子信號情況基本相同，沒有出現(xiàn)前沿凹陷的現(xiàn)象，t1’=(3.9±1.0) s。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍處理后的Ca2+濃度脈沖從原生質(zhì)體破裂開始至到達峰值所有的時間T1大于未經(jīng)冷凍處理的Ca2+濃度脈沖的相應(yīng)值，兩者間存在顯著差異(P<0.01)，相差約8 s；而Na+濃度脈沖在冷凍前后t1幾乎沒有變化(二者無統(tǒng)計學差異，P>0.05)。

經(jīng)冷凍處理后的蘆薈原生質(zhì)體，其破裂時形成Ca2+濃度脈沖信號前沿出現(xiàn)顯著的凹陷現(xiàn)象，說明原生質(zhì)體中的Ca2+分布不再均勻，靠近細胞中心濃度較高，而細胞膜附近濃度較低，產(chǎn)生了分層現(xiàn)象。

原生質(zhì)體在低滲液吸水而膨脹破裂的。由于在這一過程中有水滲透進原生質(zhì)體，如果原生質(zhì)體內(nèi)的Ca2+不能很快擴散進這些新滲入的水中，則在原生質(zhì)體中靠近細胞膜處便會形成一個Ca2+的低濃度區(qū)，這自然會使脈沖信號的前沿處出現(xiàn)一個與低濃度區(qū)相對應(yīng)的凹陷。

但從圖3(a)中可知，未經(jīng)冷凍處理蘆薈原生質(zhì)體在破裂時，其Ca2+濃度脈沖的前沿處并未出現(xiàn)這種凹陷。這說明,未經(jīng)冷凍處理的蘆薈原生質(zhì)體內(nèi)的Ca2+能夠很快地擴散到滲入原生質(zhì)體內(nèi)的水中，維持了Ca2+濃度的均勻分布。這也表明,未經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體對其內(nèi)部的Ca2+濃度分布具有很好的調(diào)控能力。

經(jīng)過冷凍后的蘆薈原生質(zhì)體在破裂時其Ca2+濃度脈沖信號前沿處出現(xiàn)了凹陷，表明其中的Ca2+流動性變差，或者說原生質(zhì)體調(diào)控Ca2+濃度分布的能力遭到了破壞，使得Ca2+不能很快擴散到滲入的水中去，造成Ca2+濃度分布不均勻，出現(xiàn)了分層現(xiàn)象。

以往人們在研究低溫脅迫或細胞的冷凍保存與復(fù)蘇時，大多集中于研究胞外空間的離子流變化或水結(jié)冰時形成的冰晶對細胞的機械損傷，而沒有注意到細胞調(diào)控Ca2+分布的能力的變化[31-32]。趙明明等[33]研究了低溫處理后冬青葉片細胞內(nèi)Ca2+水平變化，結(jié)果表明，細胞內(nèi)Ca2+沉淀隨溫度的降低而有所增加。楊蕊等[34]報道了在4 ℃下黃楊葉肉細胞中Ca2+和Ca2+-ATPase的變化，處理3～12 h后細胞間隙和液泡中的Ca2+沉淀顆粒較少，而細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的Ca2+增多，Ca2+-ATPase分布幾乎未受影響，處理24 h后，細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)Ca2+開始轉(zhuǎn)移到細胞間隙和液泡中，Ca2+-ATPase的活性增強。在2018年，雖然Mori等[15]在文章中提到低溫會引起擬南芥細胞內(nèi)Ca2+濃度的迅速升高。但這些研究均未提及Ca2+的濃度分布是否出現(xiàn)分層現(xiàn)象。因此，筆者的研究結(jié)果對于今后這方面的研究具有一定的借鑒意義。與Ca2+不同，Na+在冷凍處理后其濃度分布沒有發(fā)生分層的現(xiàn)象，這可能與細胞對Ca2+和Na+分布的調(diào)控機制不同，及Ca2+和Na+在細胞抗冷凍反應(yīng)中的作用有關(guān)，需要作進一步的深入研究。

2.2 冷凍溫度對蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響

為了進一步研究冷凍溫度對蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+、Na+濃度分布的影響，將蘆薈原生質(zhì)體冷凍至不同溫度后，研究了其中的Ca2+、Na+濃度分布。

圖4為冷凍至不同溫度的蘆薈原生質(zhì)體，在低滲液中破裂時的產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。(a)～(f)的溫度分別為18 ℃、10 ℃、0 ℃、-5 ℃、-7 ℃和-10 ℃。從圖中可以看出，當溫度為18 ℃、10 ℃、0 ℃和-5 ℃時Ca2+、Na+的信號脈沖與未經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體破裂時的離子信號基本相同，其信號前沿處均未出現(xiàn)凹陷。而當冷凍至-7 ℃時，Ca2+脈沖的前沿部分開始出現(xiàn)明顯的“凹陷”，原生質(zhì)體中Ca2+分布發(fā)生了改變。溫度降低到-10 ℃時，凹陷依然存在。

王紅等[35]使用焦銻酸鈣沉淀的電鏡細胞化學方法研究水稻幼苗細胞經(jīng)1 ℃處理24、48 h后細胞中Ca2+定位分布的變化。研究發(fā)現(xiàn)，處理24 h胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)形成了一圈Ca2+沉淀顆粒，當處理時間增加到48 h后，液泡中的Ca2+許多也分布在液泡膜的內(nèi)側(cè)，一部分顆粒趨向靠近液泡膜，而液泡中心部分的Ca2+分布似乎有減少的趨勢。謝潮添等[36]同樣使用焦銻酸鈣沉淀的電鏡細胞化學方法，研究了2 ℃下的董棕幼苗葉肉細胞中Ca2+水平及其細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，研究表明，未經(jīng)低溫處理的董棕幼苗葉肉細胞，焦銻酸鈣沉淀顆粒大量出現(xiàn)在液泡和細胞間隙中。48 h低溫處理后，細胞基質(zhì)和細胞膜上焦銻酸鈣沉淀增加，葉綠體外膜受損。處理120 h后，焦銻酸鈣沉淀大多分布在胞基質(zhì)和細胞膜上，較少分布在液泡和核基質(zhì)中。葉綠體、核膜和液泡膜嚴重破損，內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊。上述研究表明，低溫處理有使Ca2+向細胞膜附近聚集的趨勢，這與筆者的發(fā)現(xiàn)似乎剛好相反。不過，上述研究均使用了焦銻酸鈣沉淀的電鏡細胞化學方法，測量過程中細胞中的Ca2+以沉淀方式被析出，而且透射電鏡觀察需要對細胞進行固定，這些都影響了的Ca2+的流動性。而筆者所采用的方法則不需要對Ca2+進行沉淀析出，也不用對細胞進行固定處理，所得的結(jié)果應(yīng)當更接近細胞內(nèi)Ca2+的真實分布。

圖4 不同冷凍溫度下原生質(zhì)體破裂時的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(f)溫度分別為18 ℃、10 ℃、0 ℃、-5 ℃、-7 ℃和-10 ℃。Fig. 4 Pulse of Ca2+ and Na+ concentration of protoplasts cooled to different temperatures Note: (a)～(f), the temperatures are 18 ℃, 10 ℃, 0 ℃, -5 ℃, -7 ℃ and -10 ℃.

有趣的是，在各種不同的溫度下，Na+脈沖信號的前沿始終沒有出現(xiàn)凹陷。這說明，冷凍脅迫會對蘆薈原生質(zhì)體中的Ca2+分布造成影響，但對Na+分布幾乎沒有影響。

2.3 解凍時間對冷凍處理后Ca2+分布的影響

為了研究解凍時間對冷凍處理后Ca2+分布的影響，筆者選擇冷凍至-7 ℃的蘆薈原生質(zhì)體為研究對象。將其解凍不同時間后，對其Ca2+濃度分布進行測量。圖5為蘆薈原生質(zhì)體解凍后1、3和5 h后，其破裂時產(chǎn)生的Ca2+脈沖信號的情況。可以觀察到經(jīng)冷凍處理后的原生質(zhì)體的Ca2+濃度脈沖前沿處的“凹陷”現(xiàn)象在解凍5 h后依然沒有消失，原生質(zhì)體中的Ca2+濃度分層的現(xiàn)象依然存在。這說明，冷凍造成的原生質(zhì)體內(nèi)Ca2+流動的降低，或者說原生質(zhì)體對Ca2+濃度的調(diào)控能力的下降，并不會在原生質(zhì)體解凍后馬上恢復(fù)，而是會持續(xù)相當長的時間。

2.4 ZnO NPs預(yù)處理對冷凍原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響

圖6為經(jīng)不同濃度ZnO NPs預(yù)處理后再進行冷凍(溫度降至-7 ℃)的蘆薈原生質(zhì)體，在低滲液中破裂時產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。圖中(a)～(d)的ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。

由圖6可知，不同濃度ZnO NPs預(yù)處理后原生質(zhì)體破裂時的Ca2+濃度脈沖曲線在前沿處也都出現(xiàn)了“凹陷”現(xiàn)象。但與未經(jīng)ZnO NPs預(yù)處理的情況相比，經(jīng)處ZnO NPs理后Ca2+濃度脈沖前沿處的凹陷程度都明顯減小，凹陷深度H為(1.5±0.78) mV。明顯小于冷凍脅迫下未加ZnO NPs的凹陷深度(16.9±2.4) mV，相差約為15.4 mV，統(tǒng)計分析表明二者存在顯著差異(P<0.01)。這說明，二者中的Ca2+濃度分布情況有明顯差異，Ca2+濃度分布發(fā)生變化。雖然大量研究都已表明，ZnO NPs對植物細胞具毒性[37-39]，如破壞膜的完整性，DNA鏈斷裂[40]，抑制葉綠素的形成[41]等。但至少從筆者的研究結(jié)果來看，ZnO NPs預(yù)處理對抵抗冷凍所造成的Ca2+流動性下降，維持細胞對Ca2+濃度分布的調(diào)控能力方面具有一定的積極作用。與前面的情形一樣，Na+濃度脈沖的形狀仍沒有明顯的變化，沒有出現(xiàn)前沿凹陷在現(xiàn)象。

圖5 解凍后1 h(a)、3 h(b)和5 h(c)后蘆薈原生質(zhì)體破裂時產(chǎn)生的Ca2+脈沖信號Fig. 5 The Ca2+ pulse signal produced when the protoplasts of Aloe vera are breaking down after 1 h (a), 3 h (b) and 5 h (c) of thawing

圖6 不同濃度ZnO NPs預(yù)處理后冷凍脅迫下原生質(zhì)體破裂時的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。Fig. 6 Pulses of Ca2+ and Na+ concentrations of breaking Aloe vera protoplasts treated with different concentrations of ZnO NPsNote: (a)～(d), the concentrations of ZnO NPs were 30, 50, 70, and 90 mg·L-1.

2.5 ZnO NPs對冷凍后原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響

圖7為蘆薈原生質(zhì)體先經(jīng)冷凍處理(溫度降至-7 ℃)后，再用不同濃度的ZnO NPs進行后處理，最后將其放入低滲液中所測得的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。

圖7 ZnO NPs處理解凍后原生質(zhì)體破裂后Ca2+、Na+信號脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。Fig. 7 Ca2+ and Na+ pulse signal of Aloe vera protoplasts treated with ZnO NPs after thawingNote: (a)～(d), ZnO NPs concentrations are 30, 50, 70, and 90 mg·L-1.

由圖中可以看出一個十分有趣的現(xiàn)象。解凍后再經(jīng)不同濃度ZnO NPs處理的原生質(zhì)體在低滲液中破裂時，不但Na+濃度脈沖的前沿處沒有出現(xiàn)凹陷，Ca2+濃度脈沖前沿處的“凹陷”也消失了。這說明，ZnO NPs處理使得蘆薈原生質(zhì)體中由于冷凍造成的Ca2+濃度分層消失了，ZnO NPs的加入使得Ca2+濃度分布又發(fā)生了新的變化，造成這一現(xiàn)象的具體原因目前還不是十分清楚。

2.6 ZnO NPs對未經(jīng)冷凍的蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響

為了進一步探究冷凍前后ZnO NPs處理可使?jié)舛让}沖前沿凹陷深度減小甚至消失這一問題，了解原生質(zhì)體內(nèi)部Ca2+、Na+濃度分布的變化情況。筆者檢測了不同濃度ZnO NPs處理3和18 h的未經(jīng)冷凍的蘆薈原生質(zhì)體破裂過程中產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖情況，檢測結(jié)果如圖8和圖9所示。

由圖8可知，當ZnO NPs濃度為30、50和70 mg·L-1時，經(jīng)3 h處理后，蘆薈原生質(zhì)體破裂時產(chǎn)生的Ca2+、Na+信號中均未出現(xiàn)前沿凹陷的現(xiàn)象。而當ZnO NPs濃度為90 mg·L-1時，發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度脈沖的前沿有輕微的凹陷。另一個值得注意的現(xiàn)象是，圖8(b)～(d)中，在脈沖上升段的開始處，其上升趨勢更加陡峭。而且，隨著處理時間的增加，這種趨勢更加明顯，如圖9所示。

從圖9中可以明顯看出，(a)～(d)中4組脈沖信號的上升段的開始處，脈沖上升速度極快，與其后部分的上升速度有明顯區(qū)別。筆者統(tǒng)計了未經(jīng)ZnO NPs處理、經(jīng)ZnO NPs分別處理3和18 h的Ca2+濃度脈沖上升部分時間T1和該部分前1/3處時間T1/3，如圖10所示。

經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)ZnO NPs處理與ZnO NPs處理的Ca2+濃度脈沖其從原生質(zhì)體破裂到達到最大值所用的時間T1基本一致，而在上升的前1/3處所用的時間T1/3相差明顯。

這一明顯區(qū)別表明，與冷凍造成的原生質(zhì)體內(nèi)靠近細胞膜處Ca2+濃度下降不同。經(jīng)ZnO NPs處理后的蘆薈原生質(zhì)體中，靠近細胞膜處的很小范圍內(nèi)，Ca2+濃度有較為明顯的上升趨勢。這說明，Ca2+濃度分布與未經(jīng)ZnO NPs處理時相比發(fā)生了變化，猜想可能是ZnO NPs使得蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+在細胞膜附近分布較集中，從而導(dǎo)致細胞膜破裂后，在脈沖前沿形成較明顯的濃度變化。可能正是這一現(xiàn)象，使得經(jīng)ZnO NPs預(yù)處理的蘆薈原生質(zhì)體，在冷凍后其Ca2+濃度脈沖前沿處的凹陷變淺；也會使先冷凍再用ZnO NPs進行后處理的蘆薈原生質(zhì)體的Ca2+濃度脈沖前沿凹陷消失。這當中的具體機制值得深入研究。經(jīng)過不同時間的ZnO NPs處理，Na+濃度脈沖的形狀依然沒有明顯變化，沒有出現(xiàn)前沿凹陷在現(xiàn)象。

圖8 不同濃度的ZnO NPs處理3 h后的蘆薈原生質(zhì)體破裂時的Ca2+、Na+濃度脈沖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。Fig. 8 Ca2+ and Na+ concentration pulses of breaking Aloe vera protoplasts after treatment with different concentrations of ZnO NPs for 3 hNote: (a)～(d), ZnO NPs concentrations are 30, 50, 70, and 90 mg·L-1.

圖9 不同濃度ZnO NPs處理18 h后的原生質(zhì)體破裂時的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。Fig. 9 Pulse of Ca2+ and Na+ concentration of Aloe vera protoplasts after 18 h treatment with different concentrations of ZnO NPsNote: (a)～(d), ZnO NPs concentrations were 30, 50, 70, and 90 mg·L-1.

圖10 未處理、ZnO NPs處理3和18 h的Ca2+濃度脈沖上升部分時間T1和T1/3Fig. 10 Ca2+ concentration pulse rise time T1 and T1/3 in untreated, treated by ZnO NPs for 3 h and 18 h

綜上，使用Ca2+離子選擇性微電極檢測了經(jīng)冷凍處理后的蘆薈原生質(zhì)體在低滲液中破裂時產(chǎn)生的Ca2+濃度脈沖信號。研究了冷凍溫度、解凍時間和ZnO NPs處理等因素對蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+分布的影響。發(fā)現(xiàn)蘆薈原生質(zhì)體被冷凍至-7 ℃以下時，其Ca2+脈沖信號前沿處發(fā)生明顯的“凹陷”，Ca2+分布出現(xiàn)分層現(xiàn)象。靠近細胞中心濃度較高而細胞膜附近濃度較低。這說明，冷凍造成蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+的流動性下降，原生質(zhì)體對Ca2+濃度分布的調(diào)控能力降低。這一現(xiàn)象在原生質(zhì)體解凍5 h后仍未消失。

經(jīng)過ZnO NPs預(yù)處理后再進行冷凍的原生質(zhì)體，其脈沖凹陷深度明顯減小；而當用ZnO NPs對解凍后的原生質(zhì)體進行后處理時,Ca2+分層現(xiàn)象消失。這可能是由于ZnO NPs處理使得蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+分布趨近于細胞膜附近導(dǎo)致的。這表明，盡管ZnO NPs對植物細胞具有一定的毒性，但其在防止冷凍造成的Ca2+流動性下降，維持細胞Ca2+分布的調(diào)控能力方面，仍然具有一定的積極作用。