小鼠腦干3β羥基類固醇脫氫酶1免疫陽性神經(jīng)元信號檢測方法的優(yōu)化

曹曉娟，李 強(qiáng)，范奎奎，潘 登，劉昊東，王 昆，海日汗，杜晨光,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014109；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊050000)

類固醇激素對生活在各種環(huán)境中的脊椎動物適應(yīng)性表型的表達(dá)至關(guān)重要[1]。通常，僅通過測量循環(huán)激素水平很難發(fā)現(xiàn)激素合成的潛在機(jī)制，因?yàn)檠褐械念惞檀妓讲⒉豢偸桥c組織中的激素水平一致；一些循環(huán)激素需要通過局部表達(dá)的類固醇代謝酶轉(zhuǎn)化為更活躍的代謝物[2-3]。在這些酶中，3β羥基類固醇脫氫酶1(3β-HSD1)在類固醇生成途徑中處于關(guān)鍵位置，在性腺和腎上腺中研究較多。證實(shí)其可將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為黃體酮和脫氫表雄酮(DHEA)，再轉(zhuǎn)化為雄烯二酮，進(jìn)而合成雄激素(睪酮)[4]。同時，3β-HSD1也在其它脊椎動物組織中表達(dá)，包括肝臟、心臟、主動脈、腎臟、脊髓和大腦。然而，它的功能最近才得到充分的重視。這種酶對于將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為孕酮、DHEA轉(zhuǎn)化為雄烯二酮是必不可少的，而雄烯二酮又是產(chǎn)生更強(qiáng)大的雄激素的底物，即，睪酮(T)和5a二氫睪酮，它們與雄激素受體緊密結(jié)合發(fā)揮多重生理作用。同時，類固醇激素與肥胖、肥胖引起的高血壓和2型糖尿病等疾病息息相關(guān)[4-6]。

腦作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，其包含能量代謝、生殖、內(nèi)分泌等多種調(diào)節(jié)中樞，通過下丘腦-垂體-腎上腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸兩條經(jīng)典途徑調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌等諸多穩(wěn)態(tài)[7]。對鳥類的研究表明，3β-HSD1在大腦中的表達(dá)和活動，影響鳥類的神經(jīng)行為功能。例如在鳥類大腦中，3β-HSD1與雌激素合成芳香化酶協(xié)同作用，將DHEA轉(zhuǎn)化為雌激素。這些雌激素進(jìn)而激活神經(jīng)雌激素受體來調(diào)節(jié)社會行為，例如以循環(huán)睪酮為基礎(chǔ)，在非繁殖季節(jié)表現(xiàn)出的雌激素依賴性攻擊行為[8-10]。

目前，鮮有文章報道3β-HSD1在小鼠腦內(nèi)的分布情況。本實(shí)驗(yàn)以小鼠腦組織為檢測對象，采用免疫熒光技術(shù)檢測3β-HSD1在小鼠腦內(nèi)的分布情況。但在預(yù)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)常規(guī)的腦組織處理方式難以在小鼠腦組織內(nèi)檢測到3β-HSD1陽性熒光信號。為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過采用不同的固定液預(yù)先灌注小鼠，取其腦組織經(jīng)上述不同固定液固定后制作冰凍切片，封閉前預(yù)處理[1%TritonX-100+0.4%SDS穿孔、10 mmol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)及配合使用抗體信號增強(qiáng)劑(ASE)降低背景]后，經(jīng)免疫組化方法檢測3β-HSD1在小鼠腦組織中的分布以及不同固定液對其在小鼠腦組中的陽性熒光信號檢測結(jié)果的影響，以期選擇最佳的固定液，優(yōu)化該免疫組化方法，為進(jìn)一步研究3β-HSD1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的功能，提供檢測手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 C57BL/6小鼠購自北京維通利華生物科技有限公司，經(jīng)自群繁育后(避免近交)，獲得適應(yīng)現(xiàn)有飼養(yǎng)條件的6周齡～8周齡小鼠。固定液[4%多聚甲醛(4%PFA)、20%甲醇+0.2%丙酮、4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉]及腦組織切片通透液及封閉前預(yù)處理液[1%triton X-100、30%蔗糖、20 mM檸檬酸鈉、抗體信號增強(qiáng)劑[9](Antibody signal enhancer，ASE，pH=7.4)]由本實(shí)驗(yàn)室配置。標(biāo)準(zhǔn)驢血清白蛋白購自Solarbio公司；兔源3β-HSD1單克隆抗體(MAb)、兔源GAPDH MAb、Alexa標(biāo)記的驢抗兔IgG購自Abcam公司；IR800標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自Jackson公司。

1.2 小鼠腦組織處理 用于免疫組化試驗(yàn)的12只小鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉深度麻醉，使用灌注泵經(jīng)心肺以3.5 mL/min灌注3 min生理鹽水約10 mL，后將其分為3組，4只/組，分別以5 mL/min灌注3種固定液(4%多聚甲醛、20%甲醇+0.2%丙酮、4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉)40 min約200 mL，取各組小鼠腦組織置于相應(yīng)固定液中后固定過夜，修塊后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液中直至完全沉降。使用冰凍切片機(jī)對腦組織冠狀面連續(xù)切片，厚度為30 μm，漂片法洗滌，4℃保存，并加入疊氮化鈉(NaN3)防腐。

用于western blot試驗(yàn)的3只小鼠經(jīng)斷頸迫殺，參照鼠腦立體定位圖譜[8]快速將經(jīng)免疫組化試驗(yàn)檢測的有3β-HSD1熒光信號區(qū)域的腦干中縫蒼白核(RPa)，巨細(xì)胞網(wǎng)狀核(GRN)及臂旁核(PB)取下并凍存于-80℃。

1.3 不同固定液對小鼠腦組織內(nèi)3β-HSD1陽性信號影響的檢測 先前通過文獻(xiàn)查閱及相關(guān)試劑比例的嘗試性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在免疫組化試驗(yàn)中，不同抗原固定方式對陽性神經(jīng)元信號的清晰度及飽滿度有很大的影響[7]。同時適當(dāng)濃度的檸檬酸鈉在石蠟切片和冰凍切片中的抗原修復(fù)中均有積極作用，但尚未有相關(guān)文章證實(shí)將檸檬酸鈉融入多聚甲醛中會對神經(jīng)元熒光信號的檢測有積極作用，為此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了嘗試。通過摸索比較，篩選出3種固定液(4%多聚甲醛、20%甲醇+0.2%丙酮、4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉)。

將1.2經(jīng)上述不同固定液灌注小鼠所得腦組織的冰凍切片依次使用本實(shí)驗(yàn)室摸索的封閉前預(yù)處理方式(1%TritonX-100+0.4%SDS-4℃-4 h、10 mmol/L檸檬酸鈉95℃10 min、ASE 4℃2 h)處理。3%標(biāo)準(zhǔn)驢血清蛋白室溫封閉1 h，分別以兔源抗3β-HSD1 MAb(1∶200)為一抗，以Alexa647標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶2 000)為二抗。經(jīng)免疫組化檢測3β-HSD1在小鼠腦組織中的分布及不同固定液對3β-HSD1陽性神經(jīng)元信號及神經(jīng)元形態(tài)的影響。

1.4 小鼠腦組織中3β-HSD1的western blot檢測將小鼠腦組織的PB、GRN和RPa區(qū)域材料進(jìn)行腦組織蛋白提取[9-10]后，經(jīng)5%～12%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別以兔源抗3β-HSD1 MAb(1∶1 000)和兔源抗GAPDH MAb(1∶5 000)為一抗，以IR800標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶20 000)為二抗，經(jīng)westen blot檢測3β-HSD1在小鼠腦干PB、GRN及Rpa內(nèi)的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同固定液對小鼠腦組織3β-HSD1陽性熒光信號影響的檢測結(jié)果 在使用免疫熒光技術(shù)檢測3β-HSD1在小鼠腦組織中的神經(jīng)元分布時，組織處理方式對于檢測3β-HSD1的陽性熒光信號影響較大。從抗原的保存效率來看，組織的冰凍切片比石蠟切片可以更有效的保留抗原完整性，因此使用腦組織的冰凍切片經(jīng)免疫熒光染色在科研或病理診斷的應(yīng)用越來越廣泛[11]。冰凍切片需經(jīng)過固定、脫水、切片、通透、抗原修復(fù)、降噪、抗體孵育等多步流程，其中組織的固定、通透以及抗原修復(fù)對于免疫熒光最終染色結(jié)果影響較大，而固定的目的在于終止組織內(nèi)酶的活性，避免胞體本身的解體，保持其抗原性，在此基礎(chǔ)上將抗原固定在原位[12-13]。目前國內(nèi)外較常用的固定液有適當(dāng)比例的福爾馬林、多聚甲醛、丙酮、甲醇等。然而在檢測某些特定抗體信號時，常規(guī)的固定液對最終結(jié)果的檢測影響較大[14]，但目前尚未有一種標(biāo)準(zhǔn)的固定劑可以完全適用于所有的抗原固定[15]。為此需適當(dāng)調(diào)整固定液內(nèi)的成分以獲得較優(yōu)的染色結(jié)果。

本研究用到的封閉前預(yù)處理液中的Triton X-100和SDS均是一種非離子表面活性劑，在免疫熒光預(yù)處理步驟中常常被稀釋至一定比例用作細(xì)胞破膜劑，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合；ASE包含50 mmol/L甘氨酸、0.05%吐溫20、0.1%TritonX-100和1%BSA，經(jīng)鑒定其作為抗體稀釋液可以增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合效率并降低背景色[4]；檸檬酸鈉是免疫組化試驗(yàn)時用到的較為常見的一種抗原修復(fù)液，將腦組織切片內(nèi)加入適當(dāng)比例的檸檬酸鈉經(jīng)加熱煮沸的方式可暴露出被甲醛的醛基遮蔽的部分抗原[16]。但使用檸檬酸鈉熱修復(fù)組織切片后會導(dǎo)致染色結(jié)果背景色偏高，通過使用ASE[4]可以降低背景色。因此本研究采用的封閉前預(yù)處理方式不僅降低了免疫組化試驗(yàn)中的背景色，而且可以使抗原充分暴露。適宜的固定液能夠獲得較優(yōu)的抗原保存效率，并結(jié)合后續(xù)的預(yù)處理方式使得抗原的暴露更充分，抗原的空間結(jié)構(gòu)更完整。

本實(shí)驗(yàn)中小鼠腦組織經(jīng)3種固定液灌注及固定后所得腦組織切片統(tǒng)一經(jīng)過相同的封閉前預(yù)處理后，經(jīng)免疫組化試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示：4%多聚甲醛固定液組，小鼠腦內(nèi)(前腦、腦干)未檢測到3β-HSD1陽性熒光信號(圖1A～圖1C)；20%甲醇+0.2%丙酮固定液組小鼠后腦腦干的PB、GRN及Rpa核團(tuán)內(nèi)均檢測到3β-HSD1陽性熒光信號的分布，但陽性神經(jīng)元信號形態(tài)模糊(圖1D～圖1F)；4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉固定液組小鼠上述核團(tuán)內(nèi)檢測到3β-HSD1陽性熒光信號的分布，且該陽性熒光信號清晰、神經(jīng)元形態(tài)飽滿圓潤(圖1G～圖1I)。圖1中D～F和G～I(xiàn)分別是與A～C位置相近的RPa、GRN和PB掃描結(jié)果圖。

上述結(jié)果表明，4%多聚甲醛+10 mmol/L檸檬酸鈉固定液灌注小鼠并輔以后續(xù)封閉前預(yù)處理方式，對檢測小鼠后腦腦干內(nèi)PB、GRN及Rpa核團(tuán)內(nèi)3β-HSD1陽性熒光信號分布的檢測有積極意義。因此，對于一些未知敏感性及表達(dá)位置的組織抗原，應(yīng)進(jìn)行多種固定劑及預(yù)處理方式的篩選，才能得到最佳的染色效果，以免造成假陽性或假陰性結(jié)果，從而影響檢測結(jié)果。

圖1 不同固定液的免疫組化試驗(yàn)檢測3β-HSD1在小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元的分布檢測結(jié)果Fig.1 Effects of different fixation methotls on the distribution of 3 beta-HSD1 neurons in mouse brain

2.2 小鼠腦組織中3β-HSD1蛋白表達(dá)的western blot檢測結(jié)果 本研究通過western blot進(jìn)一步印證免疫組化結(jié)果，檢測上述核團(tuán)內(nèi)3β-HSD1蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，3β-HSD1在小鼠腦干的RPa、GRN及PB內(nèi)均有表達(dá)(圖2)。Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，表明本研究優(yōu)化的免疫組化試驗(yàn)可靠，驗(yàn)證了3β-HSD1在小鼠腦干RPa、GRN及PB內(nèi)神經(jīng)元的分布結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化試驗(yàn)檢測顯示3β-HSD1在小鼠腦組織內(nèi)的RPA、GRN和PB均有分布，western blot進(jìn)一步證實(shí)了以上3個核團(tuán)內(nèi)均有3β-HSD1蛋白的表達(dá)。研究表明二型糖尿病和瘦素受體基因敲除小鼠中，類固醇激素如整體膽固醇水平、脂聯(lián)素和甘油三酯等的合成增高，通過檢測其類固醇激素合成調(diào)節(jié)因子結(jié)果顯示，3β-HSD1 mRNA表達(dá)量顯著增加[13]?；?β-HSD1在類固醇激素合成過程中的作用，以及腦組織內(nèi)RPA、GRN和PB均涉及到激素的合成調(diào)控過程[17-18]，推測3β-HSD1可能在上述3個核團(tuán)內(nèi)參與類固醇類激素的合成過程。

圖2 3β-HSD1蛋白在小鼠腦干RPA、GRN、PB核團(tuán)內(nèi)表達(dá)的western blot檢測結(jié)果Fig.2 Expression of 3beta-HSD1 protein in RPA,GRN and PB nuclei of mice brain stem

本研究通過對檢測3β-HSD1在小鼠腦干中分布的免疫組化試驗(yàn)中的固定液成分以及預(yù)處理方式的改良，促進(jìn)了該實(shí)驗(yàn)中抗原抗體結(jié)合效率，降低了背景著色，提高了染色結(jié)果的清晰度，證實(shí)了3β-HSD1在小鼠腦干神經(jīng)元核團(tuán)內(nèi)的分布，為研究腦干內(nèi)3β-HSD1的功能提供技術(shù)手段。