• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    血清4型禽腺病毒fiber-2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性分析

    2019-04-17 06:13:28陸吉虎張雪花唐應(yīng)華侯繼波
    關(guān)鍵詞:桿狀病毒效價(jià)質(zhì)粒

    梅 梅,陸吉虎,張雪花,唐應(yīng)華,盧 宇,侯繼波*

    (1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所,江蘇 南京210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京210014;3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 教育部禽類(lèi)預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州225009;4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚(yáng)州225009)

    I群禽腺病毒(Fowl adenovirus group I)是一類(lèi)能夠感染雞、鴨、鵝、火雞、鴿等多種禽類(lèi)的DNA病毒[1],感染雞的I群禽腺病毒包含12個(gè)血清型,其中血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,F(xiàn)AdV-4)致病力強(qiáng),能引起雞的心包積液綜合征(Hydropericardium syndrome,HPS),病雞常表現(xiàn)食欲不振、羽毛粗亂、嗜睡等癥狀,死亡率30%~90%[2-3];剖檢病變常以心包積有淡黃色液體、肝臟出血為主[4]。近年來(lái),我國(guó)山東、安徽、吉林、遼寧、湖北、江西、江蘇等地大面積暴發(fā)該病,給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6],然而目前尚無(wú)商品疫苗及有效預(yù)防措施[7]。

    FAdV-4為無(wú)囊膜病毒,表面呈二十面體對(duì)稱(chēng)[8],fiber-2蛋白是病毒表面重要結(jié)構(gòu)蛋白,由尾部、莖部和頭部組成[9],fiber-2蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合,以協(xié)助病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞,其對(duì)病毒毒力及組織拓?fù)湫杂兄匾挠绊慬10]。因此,本研究擬利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和懸浮培養(yǎng)工藝克隆和表達(dá)FAdV-4 fiber-2蛋白,并對(duì)其進(jìn)行初步的免疫效力評(píng)價(jià),為研制FAdV-4亞單位疫苗研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 FAdV-4由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存;Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen公司;Sf9細(xì)胞、High Five細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存;pMD19-T質(zhì)粒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker、T4連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒小提質(zhì)粒試劑盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit、BAC基因組提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司;轉(zhuǎn)染試劑盒、FITC標(biāo)記羊抗雞IgG(IgG-FITC)、HRP標(biāo)記羊抗雞IgG(IgG-HRP)購(gòu)自Invitrogen公司;FAdV-4陽(yáng)性血清、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞、疫苗增強(qiáng)劑CVCVA5由本研究室制備;SPF雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物公司,并由本實(shí)驗(yàn)室孵化出雛。

    1.2 病毒基因組提取和fiber-2基因的擴(kuò)增 根據(jù)NCBI登錄的FadV-4纖突(fiber-2)基因序列(HQ709232.1)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物:F-F1:5'-TATA ACTAGTATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACA/F-F2:5'-TATTTTCGAATTACGGGAGGGAGGCCGC TGGACA-3'。參考文獻(xiàn)[4]提取FadV-4基因組,以其為模板采用Touch-down PCR擴(kuò)增fiber-2基因。PCR反應(yīng)條件為:95℃5 min;95℃60 s、64℃60 s、72℃90 s,10個(gè)循環(huán);95℃60 s、62℃60 s、72℃90 s,10個(gè)循環(huán);95℃60 s、60℃60 s、72℃90 s,10個(gè)循環(huán)后,72℃10 min。

    1.3 重組桿狀病毒rBV-fiber-2的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增獲得的fiber-2基因與桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1連接后構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-fiber-2,經(jīng)酶切并測(cè)序鑒定。

    將鑒定正確的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFast-Bac1-fiber-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2,經(jīng)藍(lán)白斑篩選3代,提取質(zhì)粒后,利用特異性引物F-F2/通用引物M13經(jīng)PCR鑒定。

    將重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞,27℃培養(yǎng)120 h或至出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)后,收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清,4℃,1 000 r/min,離心5 min,收獲上清,4℃避光保存,即為第一代重組桿狀病毒rBV-fiber-2。

    1.4 重組桿狀病毒rBV-fiber-2的間接免疫熒光(IFA)鑒定 將獲得的重組桿狀病毒rBV-fiber-2感染Sf9細(xì)胞,96 h后吸去上清,PBS洗滌,4%多聚甲醛室溫固定后,以FAdV-4陽(yáng)性血清(1∶200)為一抗,以羊抗雞IgG-FITC(1∶400)為二抗,IFA檢測(cè)重組病毒中fiber-2蛋白的表達(dá);同時(shí)設(shè)野生桿狀病毒(BV-WT)感染的Sf9和正常Sf9細(xì)胞為陰性對(duì)照。

    1.5 重組桿狀病毒的western blot鑒定 將重組桿狀病毒rBV-fiber-2感染Sf9細(xì)胞96 h,收獲細(xì)胞和上清,1 000 r/min,離心5 min,取10 μL上清經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后,以FAdV-4陽(yáng)性血清(1∶400)為一抗,以羊抗雞IgG-HRP(1∶2 500)為二抗,western blot法檢測(cè)重組fiber-2蛋白的表達(dá);同時(shí)設(shè)野生桿狀病毒(BV-WT)感染的Sf9細(xì)胞為陰性對(duì)照。

    1.6 重組桿狀病毒rBV-fiber-2的TCID50測(cè)定 將重組桿狀病毒rBV-fiber-2按10倍倍比稀釋(101~109)后感染96孔板中長(zhǎng)成單層的Sf9細(xì)胞,每孔100 μL,每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔,27℃培養(yǎng)120 h,4%多聚甲醛室溫固定30 min,經(jīng)1.5的IFA測(cè)定并經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算病毒效價(jià)。

    1.7 重組fiber-2蛋白瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)效價(jià)的測(cè)定 將懸浮細(xì)胞該密度調(diào)整至1×106個(gè)/mL,將重組桿狀病毒MOI 1接種High Five細(xì)胞,27℃,170 r/min,搖床培養(yǎng)96 h,超聲裂解,1 000 r/min,離心5 min,收獲上清,即為重組fiber-2蛋白。

    將fiber-2蛋白10倍倍比稀釋(21~25)后,采用AGP進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,同時(shí)設(shè)PBS和野生桿狀病毒BV-WT作陰性對(duì)照。

    1.8 重組fiber-2蛋白免疫原性試驗(yàn) 按照常規(guī)方法將重組fiber-2蛋白制備成油乳劑滅活疫苗。將SPF雞分成3組,第一組為重組fiber-2油乳劑疫苗組,第二組為fiber-2油佐劑疫苗配伍免疫增強(qiáng)劑CVCVA5組,均經(jīng)頸部皮下注射,免疫劑量均為0.5 mL/只,第三組為生理鹽水對(duì)照組。分別于免疫后14 d、21 d、28 d采血測(cè)定各組雞血清抗體AGP效價(jià)。

    2 結(jié)果

    2.1 重組桿狀病毒穿梭載體rBacmid-fiber-2的鑒定結(jié)果 將fiber-2基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1中構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFast-Bac1-fiber-2,經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2,利用PCR對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,獲得的目的條帶大小約1 500 bp,與預(yù)期相符(圖1)。表明正確構(gòu)建了重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2。

    圖1 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant baculoviral shuttler plasmid rBacmid-fiber-2 by PCR

    2.2 重組桿狀病毒的IFA鑒定結(jié)果 將重組桿狀病毒rBV-fiber-2感染Sf9細(xì)胞后經(jīng)IFA檢測(cè)。結(jié)果顯示,rBV-fiber-2感染的Sf9細(xì)胞呈現(xiàn)亮綠色熒光,野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞和正常Sf9細(xì)胞均無(wú)亮綠色熒光(圖2),表明正確構(gòu)建了重組桿狀病毒rBV-fiber-2,且FAdV-4fiber-2基因在Sf9細(xì)胞中得到了表達(dá)。

    2.3 重組桿狀病毒的western blot鑒定結(jié)果 將重組桿狀病毒rBV-fiber-2感染Sf9細(xì)胞后采用western blot鑒定。結(jié)果顯示,rBV-fiber-2感染的Sf9細(xì)胞上清在約62 ku處出現(xiàn)一條特異性的蛋白條帶,與預(yù)期相符,陰性對(duì)照未出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶(圖3),進(jìn)一步表明正確構(gòu)建了重組桿狀病毒rBV-fiber-2,F(xiàn)AdV-4 fiber-2蛋白在Sf9細(xì)胞中得到正確表達(dá),且具有較好的反應(yīng)原性。

    2.4 重組fiber-2蛋白AGP效價(jià)測(cè)定結(jié)果 采用AGP檢測(cè)經(jīng)懸浮細(xì)胞制備的重組fiber-2蛋白的效價(jià),結(jié)果顯示當(dāng)重組蛋白稀釋度為21~24時(shí)均可以與FAdV-4陽(yáng)性血清產(chǎn)生可見(jiàn)沉淀線,而稀釋度為25的重組蛋白孔、PBS對(duì)照孔和野生桿狀病毒對(duì)照孔均未產(chǎn)生沉淀線(圖4)。表明重組fiber-2蛋白與FAdV-4陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng),且AGP效價(jià)為1∶16。

    圖2 重組桿狀病毒的IFA鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of fiber-2 in Sf9 cells by IFA

    圖3 重組桿狀病毒的western blot鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of fiber-2 by western blot

    圖4 AGP測(cè)定重組fiber-2蛋白的效價(jià)Fig.4 Titer of fiber-2 tested by AGP

    2.5 免疫后SPF雞血清抗體AGP效價(jià)測(cè)定結(jié)果采用AGP檢測(cè)免疫后SPF雞血清抗體效價(jià)。結(jié)果顯示,fiber-2油佐劑疫苗組和fiber-2油佐劑疫苗配伍增強(qiáng)劑組90%的SPF雞均可以產(chǎn)生特異性抗體,且隨免疫時(shí)間的延長(zhǎng),其血清抗體AGP效價(jià)升高。免疫后28 d,fiber-2油佐劑疫苗組SPF雞血清抗體AGP平均效價(jià)達(dá)4.6 log2(1∶24),fiber-2油佐劑疫苗配伍增強(qiáng)劑組SPF雞血清抗體AGP平均效價(jià)達(dá)6.7 log2(1∶104),陰性對(duì)照組SPF雞血清抗體與滅活抗原無(wú)反應(yīng),不產(chǎn)生沉淀線(圖5)。表明重組fiber-2蛋白具有較好免疫原性,免疫增強(qiáng)劑CVCVA5可以加強(qiáng)該重組蛋白的免疫原性,且當(dāng)抗原AGP效價(jià)達(dá)1∶16時(shí),可有效誘導(dǎo)機(jī)體抗體的產(chǎn)生。

    圖5 免疫沉淀試驗(yàn)測(cè)定血清抗體AGP效價(jià)Fig.5 Titer of sera tested by AGP

    3 討論

    I群FAdV-4 fiber蛋白是其主要結(jié)構(gòu)蛋白,通過(guò)非共價(jià)鍵與病毒五鄰體蛋白結(jié)合,展示于病毒粒子表面;fiber蛋白包括fiber-1和fiber-2兩個(gè)亞基[11]。研究表明,fiber蛋白與病毒毒力相關(guān)[12],其通過(guò)與細(xì)胞受體的相互作用,及其在病毒衣殼與宿主細(xì)胞間的粘附過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[13-14]。fiber-2蛋白被認(rèn)為是具有保護(hù)性的免疫原,其具有誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的能力[15-16],產(chǎn)生的中和抗體能夠?qū)ο俨《靖腥咎峁┯行У谋Wo(hù)[15]。

    桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和懸浮細(xì)胞放大培養(yǎng)工藝技術(shù),具有抗原表達(dá)快、產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn),表達(dá)的蛋白與天然蛋白功能相似。因此,本研究通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和表達(dá)I群FAdV-4 fiber-2蛋白,利用懸浮放大培養(yǎng)工藝大量表達(dá)該重組蛋白,表達(dá)的fiber-2蛋白經(jīng)IFA、western blot鑒定,結(jié)果顯示重組fiber-2蛋白與FAdV-4陽(yáng)性血清能發(fā)生特異性免疫反應(yīng),蛋白分子量大小62 ku左右,與2014年Schachner A表達(dá)的重組fiber-2蛋白大小相近[15]。本研究中,通過(guò)AGP檢測(cè)fiber-2重組蛋白效可達(dá)1∶16,表明本研究所用懸浮細(xì)胞放大培養(yǎng)工藝制備的fiber-2蛋白含量較高,足以同陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)并產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)抗原抗體反應(yīng)沉淀線,這一結(jié)果在其他研究公開(kāi)發(fā)表論文中未見(jiàn)報(bào)道。

    以重組fiber-2蛋白為抗原免疫SPF雞,利用AGP于免疫后14 d可檢測(cè)到特異性抗體的產(chǎn)生,免疫后28 d特異性抗體平均AGP效價(jià)達(dá)1∶24。血清抗體的分泌表明重組蛋白抗原進(jìn)入機(jī)體后能夠有效刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答,證明桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組fiber-2蛋白具有較好的免疫原性,且產(chǎn)生的抗體能夠與FAdV-4發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng),產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)沉淀物,進(jìn)一步表明抗原有效刺激免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體。配伍免疫增強(qiáng)劑組SPF雞抗體平均AGP效價(jià)可達(dá)1∶104,與單獨(dú)油佐劑疫苗組差異顯著,表明本研究中配伍的免疫增強(qiáng)劑能顯著提高重組fiber-2蛋白的免疫效力,促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答,提高抗體分泌水平。

    綜上,本研究結(jié)果表明重組fiber-2蛋白具有較好免疫原性,其不僅可以作為FAdV-4亞單位疫苗候選抗原,同時(shí)重組fiber-2蛋白的表達(dá)也為深入研究FAdV-4的致病機(jī)理提供基礎(chǔ)材料。

    猜你喜歡
    桿狀病毒效價(jià)質(zhì)粒
    桿狀病毒載體滅活方法的研究進(jìn)展
    情緒效價(jià)的記憶增強(qiáng)效應(yīng):存儲(chǔ)或提取優(yōu)勢(shì)?
    南美白對(duì)蝦白斑綜合癥桿狀病毒病(WSSV)的危害及預(yù)防措施
    應(yīng)用HyD在仔豬斷奶早期可提高維生素D的效價(jià)
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類(lèi)
    《豬流行性腹瀉病毒N蛋白桿狀病毒表達(dá)與間接ELISA方法建立》圖版
    凡納濱對(duì)蝦對(duì)蝦桿狀病毒PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    如何提高抗生素效價(jià)管碟測(cè)定法的準(zhǔn)確性
    黑人欧美特级aaaaaa片| 天天影视国产精品| 色网站视频免费| 一区二区三区精品91| 一本色道久久久久久精品综合| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 91成人精品电影| 黄色一级大片看看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 一区二区三区精品91| 黑人猛操日本美女一级片| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日韩,欧美,国产一区二区三区| freevideosex欧美| 亚洲国产精品一区三区| 国产69精品久久久久777片| 久久婷婷青草| 男女边摸边吃奶| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲av综合色区一区| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲人成77777在线视频| 欧美bdsm另类| 国精品久久久久久国模美| 99热全是精品| 亚洲性久久影院| 国产黄色免费在线视频| 成人漫画全彩无遮挡| 国内精品宾馆在线| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲国产精品国产精品| 在线天堂最新版资源| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日韩三级伦理在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 99香蕉大伊视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 水蜜桃什么品种好| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产激情久久老熟女| 99久国产av精品国产电影| 丁香六月天网| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久久视频综合| 国产精品一区www在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 蜜臀久久99精品久久宅男| 伦理电影免费视频| 成人二区视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久久人人人人人| 国产成人精品福利久久| 桃花免费在线播放| a 毛片基地| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av日韩在线播放| 成人黄色视频免费在线看| 天堂8中文在线网| 国产69精品久久久久777片| 99re6热这里在线精品视频| 久久99蜜桃精品久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩在线高清观看一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄色毛片三级朝国网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品国产露脸久久av麻豆| 成人国语在线视频| 在现免费观看毛片| 欧美激情 高清一区二区三区| av播播在线观看一区| 黄片播放在线免费| 亚洲精品一区蜜桃| 中文天堂在线官网| 一级毛片电影观看| 18禁动态无遮挡网站| 岛国毛片在线播放| 久久久久视频综合| 国产日韩欧美视频二区| 成年人免费黄色播放视频| 观看av在线不卡| 在线观看免费高清a一片| 九九爱精品视频在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 成人国语在线视频| a级毛片黄视频| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 制服人妻中文乱码| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久国产精品麻豆| 99热网站在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 伦精品一区二区三区| 国产精品一国产av| 亚洲欧美清纯卡通| 国产又色又爽无遮挡免| 国产一区二区三区av在线| 黑人高潮一二区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费高清在线观看日韩| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人一区二区在线| 日韩精品有码人妻一区| 五月天丁香电影| 久久这里有精品视频免费| 视频在线观看一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 97在线人人人人妻| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲成人手机| 午夜免费观看性视频| 丝袜人妻中文字幕| 好男人视频免费观看在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲色图综合在线观看| 国产又爽黄色视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 日日爽夜夜爽网站| 新久久久久国产一级毛片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 91久久精品国产一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲av电影在线进入| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲国产日韩一区二区| 国产男人的电影天堂91| 蜜桃国产av成人99| 日本-黄色视频高清免费观看| 午夜久久久在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 多毛熟女@视频| a级毛色黄片| 九草在线视频观看| 久久久久视频综合| 香蕉精品网在线| 亚洲成人av在线免费| 国产成人精品婷婷| 内地一区二区视频在线| 午夜日本视频在线| 美女内射精品一级片tv| 国产免费又黄又爽又色| 日韩中字成人| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久久欧美国产精品| 午夜av观看不卡| 亚洲情色 制服丝袜| 少妇熟女欧美另类| 大陆偷拍与自拍| 一级a做视频免费观看| 亚洲av综合色区一区| 欧美日韩综合久久久久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 水蜜桃什么品种好| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品国产色婷婷电影| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久97久久精品| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产一区二区在线观看av| 熟女人妻精品中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品国产三级国产专区5o| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 大片电影免费在线观看免费| 久久人人97超碰香蕉20202| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 高清在线视频一区二区三区| 国产 一区精品| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩一区二区视频免费看| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲综合精品二区| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| videosex国产| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 乱码一卡2卡4卡精品| 午夜日本视频在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产成人精品在线电影| 亚洲国产精品一区三区| 日韩视频在线欧美| 中文字幕人妻熟女乱码| 99热6这里只有精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 天堂8中文在线网| 午夜影院在线不卡| 日本av免费视频播放| 欧美人与性动交α欧美软件 | 9191精品国产免费久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 伦精品一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 性色av一级| 久久人妻熟女aⅴ| 免费大片18禁| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| av电影中文网址| 久久亚洲国产成人精品v| 精品一区二区免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 丁香六月天网| 午夜av观看不卡| 曰老女人黄片| 99视频精品全部免费 在线| 青青草视频在线视频观看| 国产高清三级在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美最新免费一区二区三区| 久久影院123| 久久久a久久爽久久v久久| 男人操女人黄网站| a级毛色黄片| 日本黄大片高清| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲人成网站在线观看播放| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 黄色视频在线播放观看不卡| 天堂中文最新版在线下载| 日本爱情动作片www.在线观看| 精品一区二区三卡| 亚洲av.av天堂| 亚洲av综合色区一区| av网站免费在线观看视频| av卡一久久| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美精品国产亚洲| 丝袜喷水一区| 亚洲国产av影院在线观看| 国产69精品久久久久777片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 美女内射精品一级片tv| 国产精品.久久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99热国产这里只有精品6| 久久人人爽人人片av| 国产有黄有色有爽视频| 午夜91福利影院| 91精品三级在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 婷婷成人精品国产| 男女边摸边吃奶| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品.久久久| 两个人看的免费小视频| 赤兔流量卡办理| 日韩大片免费观看网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 蜜桃国产av成人99| 日本av免费视频播放| 狂野欧美激情性bbbbbb| 永久免费av网站大全| 精品少妇内射三级| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 看免费av毛片| 欧美人与善性xxx| 有码 亚洲区| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩伦理黄色片| 青春草国产在线视频| 国产成人精品无人区| 精品久久久精品久久久| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲色图综合在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 成人影院久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产色婷婷99| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 99久久人妻综合| 婷婷色综合大香蕉| 免费看av在线观看网站| 成人手机av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品一区二区三区视频在线| 满18在线观看网站| 成年人午夜在线观看视频| 国产av码专区亚洲av| 国产精品久久久久久av不卡| 色94色欧美一区二区| 综合色丁香网| 亚洲久久久国产精品| www.熟女人妻精品国产 | 精品少妇久久久久久888优播| 久热这里只有精品99| 久久久久视频综合| 免费少妇av软件| av免费在线看不卡| 在线观看人妻少妇| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 色吧在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产极品天堂在线| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 免费日韩欧美在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩电影二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 99久久精品国产国产毛片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成人国产av品久久久| 免费看光身美女| 国产麻豆69| 水蜜桃什么品种好| 国产白丝娇喘喷水9色精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产在视频线精品| 97在线人人人人妻| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲av综合色区一区| 宅男免费午夜| 亚洲av男天堂| 我要看黄色一级片免费的| 国产免费又黄又爽又色| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 午夜免费鲁丝| av在线app专区| 欧美日韩综合久久久久久| 2018国产大陆天天弄谢| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 岛国毛片在线播放| 亚洲美女视频黄频| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 99视频精品全部免费 在线| 有码 亚洲区| 三级国产精品片| 伦精品一区二区三区| 一区二区av电影网| 热re99久久国产66热| 国产不卡av网站在线观看| 成人国产麻豆网| 久久久久久久国产电影| 久久久久久伊人网av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 91成人精品电影| 一本色道久久久久久精品综合| 国产高清三级在线| 精品久久国产蜜桃| 亚洲,欧美精品.| 亚洲情色 制服丝袜| 99国产精品免费福利视频| 午夜免费鲁丝| 90打野战视频偷拍视频| av电影中文网址| 亚洲第一区二区三区不卡| 五月天丁香电影| 母亲3免费完整高清在线观看 | 三上悠亚av全集在线观看| 精品国产一区二区久久| videos熟女内射| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 免费少妇av软件| 一级a做视频免费观看| 久久久欧美国产精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 伦精品一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 九草在线视频观看| 亚洲综合精品二区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲av在线观看美女高潮| 我的女老师完整版在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 丰满乱子伦码专区| 在线精品无人区一区二区三| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久久久网色| 国产极品天堂在线| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 男女无遮挡免费网站观看| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲国产精品999| av在线播放精品| 老司机影院毛片| 亚洲四区av| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久精品区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲精品乱久久久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 黄片播放在线免费| 亚洲人成77777在线视频| av不卡在线播放| 久久久亚洲精品成人影院| 久久精品久久久久久久性| av福利片在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 97在线视频观看| 伦精品一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产熟女欧美一区二区| 97精品久久久久久久久久精品| 一区二区三区精品91| 亚洲精品国产av蜜桃| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲第一av免费看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 黄色一级大片看看| av不卡在线播放| 这个男人来自地球电影免费观看 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 波多野结衣一区麻豆| 欧美成人午夜免费资源| 高清av免费在线| 久久av网站| 在线观看免费高清a一片| 免费观看在线日韩| 国产精品国产三级国产专区5o| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品一国产av| 99久久人妻综合| 大片电影免费在线观看免费| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 成人无遮挡网站| 国产福利在线免费观看视频| 妹子高潮喷水视频| 99热网站在线观看| 少妇的逼水好多| 久久97久久精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美bdsm另类| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久久久网色| 波多野结衣一区麻豆| videos熟女内射| 久久久精品94久久精品| 黄色一级大片看看| 久久久久网色| 免费观看a级毛片全部| 精品亚洲成国产av| 国产激情久久老熟女| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 2022亚洲国产成人精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 免费高清在线观看视频在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲精品美女久久av网站| 美国免费a级毛片| 妹子高潮喷水视频| 亚洲伊人久久精品综合| 午夜视频国产福利| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产免费福利视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 最新中文字幕久久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 久久国产精品大桥未久av| 97人妻天天添夜夜摸| 免费观看a级毛片全部| av在线老鸭窝| av一本久久久久| 亚洲在久久综合| 国产精品久久久久成人av| 亚洲av国产av综合av卡| 99热国产这里只有精品6| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 999精品在线视频| 波多野结衣一区麻豆| 晚上一个人看的免费电影| 欧美精品一区二区免费开放| 超碰97精品在线观看| 国产精品一国产av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美bdsm另类| 高清毛片免费看| 少妇人妻久久综合中文| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品亚洲成国产av| 精品午夜福利在线看| 亚洲三级黄色毛片| √禁漫天堂资源中文www| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品女同一区二区软件| 欧美+日韩+精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线天堂中文资源库| 日日爽夜夜爽网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 一级毛片我不卡| 最近中文字幕2019免费版| 日本欧美国产在线视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产一区二区三区av在线| 免费黄频网站在线观看国产| 色视频在线一区二区三区| 大话2 男鬼变身卡| 国产成人欧美| 国产男女内射视频| 色94色欧美一区二区| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲综合色惰| 人妻一区二区av| 日本欧美国产在线视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 最新的欧美精品一区二区| 十八禁高潮呻吟视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| 免费av中文字幕在线| 国产免费现黄频在线看| 国产乱来视频区| 黑人高潮一二区| 免费大片黄手机在线观看| 在现免费观看毛片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 热99久久久久精品小说推荐| 9191精品国产免费久久| 日本与韩国留学比较| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲av中文av极速乱| 日本91视频免费播放| 国产成人av激情在线播放| 亚洲精品aⅴ在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲欧洲日产国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美3d第一页| 国产激情久久老熟女| 久久国产精品大桥未久av| 热re99久久精品国产66热6| 国产亚洲欧美精品永久| 伦理电影大哥的女人| 97精品久久久久久久久久精品| 色吧在线观看| 看免费成人av毛片| 少妇 在线观看| 久久久久视频综合| 国产精品.久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美精品国产亚洲| 欧美最新免费一区二区三区| 热re99久久精品国产66热6| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久99精品国语久久久| 少妇精品久久久久久久| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 一级爰片在线观看| 美女福利国产在线| 国产极品天堂在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久亚洲国产成人精品v| 在现免费观看毛片| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲,欧美,日韩| 久久久久精品性色| 成人国产av品久久久|