鯽魚類志賀鄰單胞菌的鑒定及其致病機制研究

傅 芳，談永萍，王 利,*，張 樺

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用重點實驗室，四川 成都610041；2.西南民族大學 生命科學與技術(shù)學院，四川 成都610041)

類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)屬弧菌科鄰單胞菌屬，且為其唯一種屬。該菌是一種機會致病菌，其作為病原菌存在于動物體與水環(huán)境中，尤其發(fā)生在魚體中，被認為是多種水產(chǎn)動物消化道炎癥的新病原[1-2]。類志賀鄰單胞菌可單獨或混合感染中華鱉、暗紋東方豚等水生動物[3-4]，這給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失，也給消費者帶來了一定的安全隱患?，F(xiàn)已從鱸鯉[2]、江鱈[5]、青魚[6]等多種水產(chǎn)動物中分離鑒定出類志賀鄰單胞菌，但未見類志賀鄰單胞菌對鯽魚致病性的研究報道。

鯽魚(Carassius auratus)屬鯉形目鯉科鯽屬動物，是我國常見的淡水魚類，廣泛分布于各地水域，其肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)價值高。由于高密度的集中養(yǎng)殖及不適當管理，病害頻繁暴發(fā)，細菌性疾病成為鯽魚養(yǎng)殖過程中的常見病[7]。近年來大量關(guān)于鯽魚細菌性疾病的研究被報道，主要包括維氏氣單胞菌[8]、金黃桿菌[9]、維隆氣單胞菌[10]等。成都市某養(yǎng)殖場出現(xiàn)少量患病鯽魚，主要癥狀表現(xiàn)為腹部紅腫出血、腹鰭腐爛、肛門腫大等。因此，本研究從患病鯽魚中分離出F01菌株，并對其進行鑒定，研究該菌株對鯽魚的致病性及其致病機制等，以期為該菌導(dǎo)致的疾病防控提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 患病鯽魚取自四川省成都市某養(yǎng)殖場，體長(12±2)cm。人工感染試驗所用鯽魚購自成都市另一未發(fā)病養(yǎng)殖場，魚體色正常、體表無損傷、活力較好，平均體長為(14±2)cm，暫養(yǎng)3 d后用于后續(xù)試驗。

LB培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；細菌微量生化反應(yīng)管、藥敏試紙均購自杭州微生物試劑有限公司；血清學指標檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；1.1×T3 Super PCR Mix、DL2000 DNA Marker均購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 細菌分離鑒定 無菌條件下采集發(fā)病魚肝臟、脾臟等組織樣本，十字交叉剪開組織后用接種針穿刺于組織內(nèi)，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，28℃下倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)12 h，進行革蘭氏染色觀察，并參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》中的細菌鑒定方法，采用細菌微量生化鑒定管對待測菌株進行各項生化指標測定。

同時采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-CTAC GGCTACCTTGTTACGA-3')進行PCR擴增，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，對測序結(jié)果進行Blast同源性比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3 藥物敏感試驗 按照美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準，采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，測量抑菌圈直徑，分析分離菌藥物敏感性。

1.4 分離菌動物回歸試驗 將分離菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)18 h，7 200 r/min離心10 min，棄上清后經(jīng)滅菌生理鹽水漂洗3次。取暫養(yǎng)3 d的健康鯽魚，隨機分為4組，每組12尾。設(shè)3個實驗組，分別注射不同濃度的菌懸液(A組注射菌液濃度為4.75×108cfu/mL，B組濃度為4.75×106cfu/mL，C組濃度為4.75×104cfu/mL)，0.3 mL/尾，對照組(D組)腹腔注射等量滅菌生理鹽水。試驗周期為10 d，每日觀察記錄各組鯽魚發(fā)病癥狀。試驗結(jié)束后對未死亡的魚剖檢觀察肝、脾等器官病變情況；取心、肝、脾、腎、肌、鰓6種組織，按常規(guī)方法制作切片用于病理組織學觀察；對試驗中死亡病魚進行細菌分離鑒定，并通過SPSS 24.0計算分離菌半數(shù)致死量LD50。

1.5 患病魚血清學指標檢測 在注射無菌生理鹽水或不同濃度菌懸液10 d后，分別在A、B、C、D 4組中隨機取3尾尾靜脈采血，分離血清后利用堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)和丙二醛(MDA)試劑盒分別測定各組鯽魚血清學指標。

1.6 患病魚免疫因子檢測 感染10 d后迫殺感染鯽魚，分別無菌采集對照組(D組)及實驗組(A組、B組、C組)脾臟、頭腎組織于液氮中快速冷凍，各組織剪取100 mg加入1 mL RNAiso Plus提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及BioSpec-nano分別檢測RNA的完整性和提取質(zhì)量。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，采用熒光定量RT-PCR檢測鯽魚HSP70、IL-8、TLR22基因在脾臟、頭腎中的轉(zhuǎn)錄水平，以beta-actin作為內(nèi)參基因，引物詳見表1。擴增體系(10 μL)均為：模板cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 2.2 μL，TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ5.2 μL；擴增程序分別為：95℃3 min；95℃10 s，53.6℃(beta-actin、HSP70)/52.8℃(IL-8、TLR22)20 s，72℃20 s，循環(huán)39次；溶解曲線65℃～95℃每5 s增加0.5℃。

表1 檢測內(nèi)參基因及各免疫因子的熒光定量RT-PCR引物信息Table 1 Primers used in fluorescence quantitative RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 分離菌的鑒定結(jié)果 分離的菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈白色不透明狀、凸起狀圓形、表面光滑濕潤的菌落。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果顯示，病原菌呈革蘭氏陰性。參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》鑒定結(jié)果顯示，該菌能發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶，硝酸鹽等，不發(fā)酵木糖、阿拉伯糖、甘露醇，不產(chǎn)尿素、明膠不液化等。

以菌株基因組DNA為模板，PCR擴增分離菌的16S rDNA基因，結(jié)果顯示擴增得到了1 431 bp的目的基因，測定的菌株序列提交至GenBank，序列號為MK397781。序列分析結(jié)果顯示，16S rDNA基因序列與類志賀鄰單胞菌16S rDNA基因序列相似性高達99%。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，分離株與類志賀鄰單胞菌聚為一族(圖1)。上述結(jié)果表明分離菌株為類志賀鄰單胞菌，將其命名為F01。

圖1 基于16S rDNA的分離菌株進化分析Fig.1 Phylogenetic tree of Plesiomonas shigelloides

2.2 藥物敏感試驗 藥物敏感性測試結(jié)果顯示，在23種供試藥物中，分離得到的F01菌株對頭孢曲松、頭孢呋辛、氧氟沙星等7種抗生素敏感，對頭孢氨芐、頭孢唑啉、丁胺卡那等5種抗生素中度敏感，對哌拉西林、克林霉素、多西環(huán)素等11種抗生素耐藥(表2)。結(jié)果表明，可選用頭孢菌素類、喹諾酮類等藥物治療由類志賀鄰單胞菌引起的鯽魚細菌性疾病。

2.3 動物回歸試驗結(jié)果 用分離得到的F01菌株感染健康鯽魚，結(jié)果顯示在注射4.75×108cfu/mL菌懸液4 d后鯽魚開始死亡。各濃度菌懸液對鯽魚的死亡率結(jié)果分析顯示：A組的累積死亡率為66.67%，B組為25.00%，C組為8.33%；對照組(D組)鯽魚未見異常(表3)。經(jīng)計算，F(xiàn)01菌株的半數(shù)致死量LD50為2.09×107cfu/mL。注射F01菌株的患病鯽魚主要表現(xiàn)為攝食量減少，體表粘液增加，腹部紅腫出血且含有大量腹水，鰭條出血腐爛，肛門紅腫；解剖可見肝臟出血，脾臟、腎臟有出血點，與自然發(fā)病的鯽魚癥狀一致。從人工感染鯽魚中重新分離菌株進行分子鑒定，結(jié)果顯示與感染所用的類志賀鄰單胞菌一致。以上結(jié)果表明可確定該菌株為患病鯽魚的病原菌。

表2 F01菌株的藥敏試驗結(jié)果Table 2 Antibiotic sensitivity test results of strain F01

表3 F01菌株的回歸感染試驗結(jié)果Table 3 Regression infection test results of strain F01

2.4 患病魚組織病理變化 F01菌株感染鯽魚后，其病理組織學變化主要表現(xiàn)在心、肝、脾、腎、肌和鰓組織(圖2)：心肌細胞腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂，并伴有肌纖維斷裂現(xiàn)象；肝細胞腫脹變性，肝小葉界限模糊，并伴有大面積出血點；脾臟組織有少量鐵黃素沉積，白髓萎縮，所占面積減小，脾髓充血；腎臟結(jié)構(gòu)紊亂，細胞腫脹變性，腎腔狹窄并出現(xiàn)透明管型，腎臟組織充滿淋巴細胞，并伴有多處出血點，有明顯的炎癥反應(yīng)；肌肉細胞間隙增大，結(jié)締組織疏松；鰓細胞數(shù)量增多、腫脹，有增生和脫落現(xiàn)象。

2.5 患病魚血清學指標的測定結(jié)果 對感染不同濃度F01菌株鯽魚血清學指標進行檢測，結(jié)果顯示：在AKP活力檢測中，實驗組鯽魚均顯著高于對照組(p<0.05)，且B組活力最高，與A、C組無顯著差異；在LZM活性測定中，B組鯽魚活性最高，且顯著高于對照組(p<0.05)，但其均與A、C組無顯著差異；在MDA活力檢測中，實驗組鯽魚均顯著低于對照組(p<0.05)，且B組含量最低(表4)。結(jié)果表明，不同濃度F01菌株感染鯽魚后均能使其血清中AKP活力、LZM活性顯著增高，MDA活力顯著降低，且B組菌株作用最為明顯。

圖2 感染鯽魚組織病理變化Fig.2 Histopathological changes of infected Carassius auratus

2.6 患病魚免疫因子轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果 對感染不同濃度F01菌株的鯽魚脾臟、頭腎組織免疫因子轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。結(jié)果顯示：其免疫因子HSP70、IL-8和TLR22基因在脾臟組織中轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對照組(p<0.05)，且均在B組中的轉(zhuǎn)錄水平最高；在頭腎組織中，免疫因子HSP70、IL-8和TLR22基因在B組鯽魚中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于A、C組(p<0.05)；且3種免疫因子在感染鯽魚脾臟組織中轉(zhuǎn)錄水平明顯高于頭腎組織(圖3)。表明F01菌株感染鯽魚后免疫因子HSP70、IL-8和TLR22基因在脾臟中的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上升，且B組菌株作用最為明顯，與血清學指標分析結(jié)果一致。

表4 感染鯽魚血清學指標檢測結(jié)果Table 4 Serological index results of infected Carassius auratus

3 討論

類志賀鄰單胞菌為條件致病菌，可在水生動物及各種哺乳動物腸道內(nèi)定植，能引發(fā)人類腹瀉、敗血癥等癥狀或疾病[11]。本實驗中臨床表現(xiàn)與張效平等[5]，葉鍵等[6]使用類志賀鄰單胞菌感染江鱈、青魚的臨床癥狀相似。組織病理結(jié)果與人工感染尼羅羅非魚[12]、鱘魚[13]相似。表明該菌感染魚類的臨床表現(xiàn)和組織病理變化均較為類似，這為類志賀鄰單胞菌對鯽魚的病理損傷研究提供參考資料。

圖3 各組鯽魚各臟器各免疫因子轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果Fig.3 Transcript levels of genes in different tissues of Carassius auratusin each group

對類志賀鄰單胞菌藥敏研究顯示，從瀕死黃顙魚中分離出的該菌對先鋒VI、菌必治和舒普深等16種藥物均高度敏感[14]，從患病大鯢中分離到的該菌對頭孢他啶、頭孢噻肟和氯霉素等18種藥物敏感[15]。以上研究結(jié)果與本文存在較大差異，本研究發(fā)現(xiàn)該菌株僅對頭孢曲松、頭孢呋辛和新霉素等7種抗生素高度敏感，這可能是由于養(yǎng)殖過程中抗生素不科學使用導(dǎo)致該病原菌已產(chǎn)生多重耐藥，以及可能與菌株來源和各地抗生素藥物使用不同等原因有關(guān)。藥敏試驗結(jié)果充分說明，在該病害的防治過程中，應(yīng)參考分離株的耐藥性結(jié)果，合理使用抗生素，才能達到科學有效的治療目的。

血清中的AKP、LZM和MDA是反應(yīng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物非特異性免疫應(yīng)答的有力指標，可識別病原體，使病毒失活，并在一定程度上反映魚體細胞損傷程度，在魚類非特異性免疫中起重要作用。感染鯽魚血清學指標結(jié)果可為其免疫應(yīng)答研究提供重要的參考價值。研究顯示殺鮭氣單胞菌感染大西洋鮭后其AKP活力顯著升高[16]，這與本實驗中F01菌株感染鯽魚后的結(jié)果相符；嗜水氣單胞菌感染中華鱉后LZM活性有所上升[17]，這也與本實驗中的分離菌感染鯽魚后的結(jié)果一致；維氏氣單胞菌感染西伯利亞鱘后MDA活力顯著降低[18]，這與本實驗中F01菌株感染鯽魚后的結(jié)果相類似。綜上所述，不同濃度分離菌感染鯽魚后均能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)為鯽魚血清AKP、LZM活性上升、MDA活力下降，在一定程度上刺激了鯽魚的非特異性免疫。

HSP70、IL-8與TLR22作為免疫反應(yīng)中的重要細胞因子，參與機體先天性免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)，可識別病原微生物，消除應(yīng)激產(chǎn)生的胞內(nèi)異常蛋白，介導(dǎo)T、B細胞增殖、分化，增強機體自身免疫反應(yīng)。研究顯示嗜水氣單胞菌感染魚后HSP70基因相對轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[19]，與本實驗結(jié)果一致；小林三代蟲感染金魚后IL-8具有較高的表達量[20]，與本實驗結(jié)果相類似；嗜水氣單胞菌感染后TLR22在脾臟和頭腎中的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)[21]，與本實驗結(jié)果相符。綜上所述，F(xiàn)01菌株感染鯽魚后HSP70、IL-8和TLR22基因在其脾臟、頭腎中的轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生了變化，且在脾臟中的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。這些血清學指標顯示該菌株對鯽魚的病理損傷結(jié)果一致，均表明該菌刺激了鯽魚的免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究為在分子水平探究類賀鄰單胞菌致病機制奠定基礎(chǔ)。