正常皮膚與病理性瘢痕組織中HIF-1α和促炎細(xì)胞因子水平比較及兩者相關(guān)性研究

李麗 王林

[摘要]目的：研究正常皮膚和瘢痕組織中乏氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和促炎細(xì)胞因子的水平及二者相關(guān)性。方法：選取2015年3月-2017年3月在筆者醫(yī)院切除的四肢瘢痕疙瘩組織標(biāo)本為瘢痕疙瘩組;增生性瘢痕組織標(biāo)本為增生性瘢痕組;普通瘢痕組織標(biāo)本為普通瘢痕組，同期因四肢外傷切除的正常皮膚組織作為正常組。研究采用HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，RT-qPCR檢測(cè)病理性瘢痕組織和正常皮膚組織中HIF-1α及促炎細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：瘢痕疙瘩觀察組及增生性瘢痕組浸潤(rùn)水平明顯高于普通瘢痕組及正常皮膚組（P<0.05），普通瘢痕組與正常皮膚組浸潤(rùn)水平無(wú)明顯差異（P<0.05），瘢痕疙瘩組浸潤(rùn)水平明顯高于增生性瘢痕組（P<0.05）。瘢痕疙瘩組及增生性瘢痕組中HIF-1α、IL-6、IL-8、hs-CRP的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常皮膚對(duì)照組（P<0.05），瘢痕疙瘩組HIF-1α、IL-6、IL-8、hs-CRP的mRNA表達(dá)量顯著高于增生性瘢痕組（P<0.05）。HIF-1α的表達(dá)與炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8、hs-CRP呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：病理性瘢痕組織中HIF-1α和促炎細(xì)胞因子水平顯著高于正常皮膚，且HIF-1α和促炎細(xì)胞因子的水平呈正相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]正常皮膚;病理性瘢痕組織;瘢痕疙瘩;增生性瘢痕;乏氧誘導(dǎo)因子-1α;促炎細(xì)胞因子

[中圖分類號(hào)]R619+.6? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）04-0071-03

Abstract： Objective? To study the levels of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） and pro-inflammatory cytokines in normal skin and scar tissue and their correlation. Methods? The keloid tissue of the extremities excised from the author's hospital from March 2015 to March 2017 was selected as the keloid group; the hypertrophic scar tissue specimen was the hyperplastic scar group; the common scar tissue specimen was the common non-pathological scar group. The normal skin tissue removed by extremity trauma was used as the normal group. The inflammatory cell infiltration was observed by HE staining. The protein expression levels of HIF-1α and proinflammatory cytokines were detected by RT-qPCR in pathological scar tissue and normal skin tissue. Results? The infiltration level of the keloid group and the hypertrophic scar group was significantly higher than that of the normal scar group and the normal skin group. （P<0.05）. There was no significant difference in the infiltration level between the normal scar group and the normal skin group（P<0.05）. The level of infiltration in the observation group was significantly higher than that in the hypertrophic scar observation group（P<0.05）. The mRNA expression levels of HIF-1α，IL-6，IL-8 and hs-CRP in the keloid group and the hypertrophic scar group were significantly higher than the normal skin control group（P<0.05）， the mRNA expression levels of HIF-1α，IL-6，IL-8 and hs-CRP in the keloid group were significantly higher than those in the hypertrophic scar group（P<0.05）; the expression of HIF-1α was positively correlated with proinflammatory cytokines IL-6， IL-8 and hs-CRP（P<0.05）. Conclusion? The levels of HIF-1α and proinflammatorycytokines in pathological scars were significantly higher than those in normal skin， and the levels of HIF-1 α and proinflammatory cytokines were positively correlated.

Key words： normal skin; pathological scar tissue; keloid; hypertrophic scar; HIF-1α; proinflammatory cytokines

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是一種人類所特有的真皮纖維化病變，主要以成纖維細(xì)胞異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積及各類膠原纖維排列紊亂為特征[1]，病理性瘢痕一直是外科修復(fù)領(lǐng)域研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。各種細(xì)胞因子參與調(diào)控病理性瘢痕的形成，如白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）及超敏C反應(yīng)蛋白（Hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）等炎癥因子，炎癥反應(yīng)與病理性瘢痕的形成過(guò)程密不可分[1-2]，病理性瘢痕常在乏氧狀態(tài)下形成，且乏氧誘導(dǎo)因子（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）也會(huì)顯著表達(dá)[3]，本文通過(guò)研究正常皮膚和病理性瘢痕組織中HIF-1α和促炎細(xì)胞因子的水平及二者相關(guān)性，以探討病理性瘢痕與炎癥的關(guān)系。

1? 資料和方法

1.1 一般資料：選擇2015年3月-2017年3月于筆者醫(yī)院切除四肢上的瘢痕疙瘩組織標(biāo)本為瘢痕疙瘩組，共41例，其中男19例，女22例，年齡25～57歲，平均年齡（36.89±9.54）歲;選取39例增生性瘢痕組織標(biāo)本為增生性瘢痕組，其中男20例，女19例，年齡25～57歲，平均年齡（36.89±9.54）歲;選擇25例因外傷切除四肢正常皮膚組織患者為正常組，其中男13例，女12例，年齡22～56歲，平均年齡（34.73±8.52）歲;同期選取22例普通瘢痕組織為普通瘢痕組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①排除垂體、腎上腺疾病，傳染病，皮膚病及免疫性疾病者;②入院前未長(zhǎng)時(shí)間服用抑制瘢痕增生藥物等治療者;③經(jīng)專業(yè)臨床醫(yī)生鑒定為病理性瘢痕者，增生時(shí)間為6～12個(gè)月。四組患者年齡、性別、BMI值等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本次研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HE染色：除去目的組織的脂肪，制作石蠟切片，水化后蘇木精液染色5min，洗去，1%鹽酸乙醇水化，水洗，0.5%伊紅液染色1～3min，稍洗，再用乙醇、石炭酸二甲苯、二甲苯替代品分別洗滌，然后封片鏡檢。選取高倍顯微鏡下每張切片炎性細(xì)胞數(shù)最多的5個(gè)視野，計(jì)算分析炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.2 RT-PCR法[4]：各取100mg增生性瘢痕組織，瘢痕疙瘩和正常皮膚組織，加入1ml Trizol裂解液后充分研磨，混勻，激烈振蕩，冰浴5min，得到組織懸液后加入200μl氯仿，充分震蕩后靜置，待液體分層后在4℃下以12 000r/min的速度離心10min。吸取上層澄清液后加入等體積異丙醇，輕微震蕩后冰浴5min，在4℃下12 000r/min的速度離心10min。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA，沉淀2次，晾干，用30μl DEPC-H2O溶解RNA沉淀，產(chǎn)物在-20℃下保存用于后續(xù)研究。取DEPC溶解的RNA標(biāo)本，采用cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：94℃ 2min，1個(gè)循環(huán);94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，分別擴(kuò)增HIF-1α、IL-6、IL-8，根據(jù)所得PCR反應(yīng)曲線計(jì)算HIF-1α、IL-6、IL-8和hs-CRP的mRNA表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件記錄分析數(shù)據(jù)，組間計(jì)量資料采用單因素方差分析，計(jì)量資料間相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)及浸潤(rùn)情況：正常皮膚成纖維細(xì)胞較少，瘢痕組織內(nèi)可見編織狀排列的大片致密嗜伊紅染，同質(zhì)性粗大膠原纖維，排列紊亂，成纖維細(xì)胞增多。瘢痕疙瘩組炎性細(xì)胞數(shù)為（162.86±27.54）個(gè)，增生性瘢痕組炎性細(xì)胞數(shù)為（112.53±21.35）個(gè)，普通瘢痕組炎性細(xì)胞數(shù)為（58.76±22.35）個(gè)，正常皮膚組炎性細(xì)胞數(shù)為（43.69±16.78）個(gè)，瘢痕疙瘩組及增生性瘢痕組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)水平較正常皮膚組和普通瘢痕組明顯升高（P<0.05），且瘢痕疙瘩組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)水平高于增生性瘢痕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 四組HIF-1α及促炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量：瘢痕疙瘩組及增生性瘢痕組的HIF-1α、IL-6、IL-8和hs-CRP的mRNA表達(dá)量顯著高于正常皮膚組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;瘢痕疙瘩組HIF-1α、IL-6、IL-8、hs-CRP的mRNA表達(dá)量顯著高于增生性瘢痕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 促炎細(xì)胞因子與HIF-1α的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HIF-α的表達(dá)與促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8、hs-CRP呈正相關(guān)（r分別為0.435、0.521和0.578，P<0.05）。

3? 討論

瘢痕是機(jī)體創(chuàng)傷愈合過(guò)程中用來(lái)填補(bǔ)損傷后缺損的失去正?；钚缘钠つw組織，瘢痕組織產(chǎn)生過(guò)多則成為病理性瘢痕，病理性瘢痕又分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是創(chuàng)傷愈合后最常見的并發(fā)癥之一，瘢痕攣縮可導(dǎo)致不同程度的功能障礙，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。兩種類型的病理性瘢痕實(shí)質(zhì)上都是以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞增殖、活性增強(qiáng)，從而產(chǎn)生大量的膠原蛋白，使真皮層細(xì)胞外基質(zhì)成分在組織中大量沉積，難以被機(jī)體吸收或重塑的病理狀態(tài)[5]。

病理性瘢痕往往容易發(fā)生感染，皮膚受損后創(chuàng)面一般會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，并處于微缺氧狀態(tài)，已有研究表明瘢痕疙瘩常伴隨慢性炎癥[6]，且微缺氧狀態(tài)可能與炎癥存在一定的相關(guān)性[7]。IL-6、IL-8、hs-CRP是促進(jìn)炎癥的關(guān)鍵因子，IL-6又稱前炎癥細(xì)胞因子，可刺激T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，IL-8是一種含有99個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[8]，可與中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞表面受體結(jié)合誘導(dǎo)其釋放大量溶酶體及過(guò)氧化物[9]，hs-CRP是急性炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物，在正常人體內(nèi)含量極低。2010年，Clogan等[10]人曾報(bào)道過(guò)組織乏氧會(huì)引起水腫，使炎性細(xì)胞因子水平增高。乏氧誘導(dǎo)因子是構(gòu)成HIF-1蛋白亞型的敏感型亞基，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)受到氧濃度的控制[11]，局部組織所處的缺氧微環(huán)境會(huì)使HIF-1α的蛋白表達(dá)水平增大，以上顯示局部組織發(fā)生病理性瘢痕與HIF-1α和促炎細(xì)胞因子存在密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩和增生性瘢痕組織HIF-1α的mRNA表達(dá)含量顯著高于正常皮膚組，表明HIF-1α的高表達(dá)與病理性瘢痕形成有關(guān)，這與胡強(qiáng)等[13]人的報(bào)道一致。HIF-1α的mRNA含量高表達(dá)原因應(yīng)該為病理性瘢痕在乏氧環(huán)境下，機(jī)體損傷時(shí)代謝旺盛，以修復(fù)損傷的組織細(xì)胞，使耗氧量增高，氧氣減少，誘導(dǎo)HIF-1α因子的表達(dá)[12-13]。在缺氧條件下HIF-1α轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核來(lái)調(diào)節(jié)多種靶細(xì)胞基因的表達(dá)[14]，調(diào)控纖維細(xì)胞增殖及凋亡。

病理性瘢痕組織中存在大量的炎性細(xì)胞，瘢痕疙瘩和增生性瘢痕組織中HIF-1α、IL-6、IL-8、hs-CRP促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)含量顯著高于正常皮膚組，說(shuō)明促炎細(xì)胞因子的表達(dá)與瘢痕形成有關(guān)[8]，炎癥反應(yīng)增加細(xì)胞的異常分化與過(guò)度增殖，參與并促進(jìn)病理性瘢痕的形成[15]，Simonart等[16]人發(fā)現(xiàn)亞抑菌劑量的四環(huán)素通過(guò)抗炎作用防止痤瘡形成瘢痕。且Pearson相關(guān)性分析顯示HIF-1α分別與IL-6、IL-8、hs-CRP呈正相關(guān)，病理性瘢痕組織中HIF-1α因子能夠促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，增加炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，這與葉飛輪[14]及張明子[5]等人研究結(jié)果一致。

綜上所述，病理性瘢痕組織中HIF-1α和促炎細(xì)胞因子的水平與正常皮膚相比顯著升高，且HIF-1α和促炎細(xì)胞因子的水平呈正相關(guān)，病理性瘢痕中HIF-1α水平的升高加劇了炎癥反應(yīng)，病理性瘢痕的形成與炎癥反應(yīng)的發(fā)生交叉影響著人體纖維細(xì)胞的增殖分化[17]及后續(xù)病情發(fā)展。

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[收稿日期]2018-12-17