富血小板血漿（PRP）對大鼠光老化皮膚膠原蛋白、TGF-β及MMP-1表達(dá)的影響

吳文伯 陳敏亮 吳焱秋 李光磊

[摘要]目的：通過測定注射富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）后大鼠光老化皮膚Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，轉(zhuǎn)化因子β（TGF-β），基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）的表達(dá)量，觀察PRP對大鼠光老化皮膚的改善作用。方法：通過紫外線照射大鼠背部皮膚建立皮膚光老化模型。將模型動(dòng)物隨機(jī)分為5組，A-PRP注射組注射激活的PRP（A-PRP）;N-PRP注射組注射未激活的PRP（N-PRP）;生理鹽水注射組注射生理鹽水;空白對照組僅照射建模;正常大鼠組僅剃除毛發(fā)。干預(yù)4周后，通過免疫組化法對大鼠皮膚Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量進(jìn)行半定量分析;通過Western bolt法對大鼠皮膚TGF-β、MMP-1表達(dá)量進(jìn)行測定。結(jié)果：Ⅰ型膠原表達(dá)：A-PRP注射組較N-PRP注射組、生理鹽水注射組、空白對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ⅲ型膠原表達(dá)：A-PRP注射組顯著高于生理鹽水注射組、空白對照組（P<0.05），與N-PRP注射組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TGF-β表達(dá)：A-PRP注射組顯著高于N-PRP注射組、生理鹽水注射組、空白對照組（P<0.05）;MMP-1表達(dá)：A-PRP注射組顯著低于生理鹽水注射組、空白對照組（P<0.05），與N-PRP注射組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：注射PRP可以提高光老化大鼠皮膚Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和TGF-β表達(dá)，降低MMP-1表達(dá)，其中A-PRP對Ⅰ型膠原和TGF-β表達(dá)的促進(jìn)作用優(yōu)于N-PRP。

[關(guān)鍵詞]富血小板血漿;光老化;Ⅰ型膠原;Ⅲ型膠原;TGF-β;MMP-1

[中圖分類號]R758.1? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）04-0064-04

Abstract： Objective? The effect of PRP on photoaging skin of mice was observed by measuring the expression of type Ⅰand type Ⅲ collagen， TGF-β， MMP-1 in the skin of mice after PRP injection. Methods? ?Skin photoaging model was established by irradiating the skin of the back of rats with UV light. A-PRP injection group was injected with activated PRP （A-PRP）. N-PRP injection group was injected with inactive PRP （N-PRP）. Saline injection group was injected with normal saline. Blank control group was irradiated only with UV. Normal rat group only shave the hair. After injection for 4 weeks， the content of collagen type Ⅰ and Ⅲ in rat skin was semi-quantitatively analyzed by immunohistochemistry. The expression of TGF-β and MMP-1 in rat skin was determined by Western blot. Results? The expression of type Ⅰ collagen in A-PRP injection group was significantly higher than that in N-PRP injection group， saline injection group and blank control group， the differences were statistically significant（P<0.05）. The expression of type Ⅲ collagen in A-PRP injection group was significantly higher than that in group saline injection group and blank control group（P<0.05）， and there was no significant difference between A-PRP injection group and N-PRP injection group（P>0.05）. The expression of TGF-β in A-PRP injection group was significantly higher than that in N-PRP injection group， saline injection group and blank control group（P<0.05）， the expression of MMP-1 was significantly lower in A-PRP injection group than that in saline injection group and blank control group（P<0.05）. The expression of MMP-1 in A-PRP injection group and N-PRP injection group had no statistical significance（P>0.05）. Conclusion? Injection of PRP can enhance the expression of type Ⅰ collagen， type Ⅲ collagen and TGF-β and decrease the expression of MMP-1 in the photo-aged rat skin. The effect of A-PRP on the expression of type Ⅰ collagen and TGF-β is better than that of N-PRP.

Key words： platelet-rich plasma（PRP）; photoaging; type Ⅰ collagen; type Ⅲ collagen; TGF-β; MMP-1

皮膚老化分為內(nèi)源性老化和外源性老化，內(nèi)源性老化是機(jī)體固有的老化，受激素水平等內(nèi)源性因素影響;外源性老化是皮膚在外界環(huán)境因素作用下產(chǎn)生的老化，其中紫外線照射是最主要的影響因素，因此外源性老化也稱為光老化[1]。相關(guān)研究表明，紫外線照射可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1表達(dá)，加快Ⅰ型膠原分解，使Ⅰ、Ⅲ型膠原比例下降，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)老化表現(xiàn)[2]。

PRP是自體血小板濃縮物，血小板含量是全血的3～8倍，其中富含包括TGF-β在內(nèi)的多種生長因子[3]。TGF-β能夠有效刺激成纖維細(xì)胞和間葉母細(xì)胞的遷移和增殖分化，促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的合成[4]。PRP在骨科、頜面外科、口腔科等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，目前，隨著皮膚光老化相關(guān)研究的深入，PRP在改善皮膚光老化中的研究和應(yīng)用也受到關(guān)注[5]。本課題將探討PRP對光老化皮膚Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，TGF-β及MMP-1表達(dá)的影響。

1? 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑：UVA紫外線燈管（飛利浦公司）;UVB紫外線燈管（飛利浦公司）;紫外線強(qiáng)度測定儀（臺灣路昌）;脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）;包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）;病理切片機(jī)（德國徠卡）;顯微鏡（日本尼康）;凝血酶凍干粉（長春雷允上藥業(yè)有限公司）;枸櫞酸鈉注射液（天津金耀氨基酸有限公司）;CollagenⅠ抗體（Abcam公司）Collagen Ⅲ抗體（Abcam公司）;TGF-β抗體（Abcam公司）;MMP-1抗體（Abcam公司）;牛血清蛋白Ⅴ（Solarbio公司）。

1.1.2 動(dòng)物：選取6周齡雄性F344大鼠為模型動(dòng)物，數(shù)量50只，其中30只用于實(shí)驗(yàn)，20只用于采血。購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮膚光老化模型建立：大鼠5只一籠，于20℃～25℃室溫常規(guī)飼養(yǎng)，室內(nèi)光照與晝夜相符。首先進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，剃除大鼠背部毛發(fā)，于自制照射箱中進(jìn)行照射，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況和文獻(xiàn)報(bào)道的照射方案，每周照射5d，累計(jì)照射60d[6-8]。起始每天照射15min，每隔10d增加5min，自31d起保持每天30min照射至建模結(jié)束。UVA強(qiáng)度：1 500μW/cm?，累計(jì)約135J/cm?;UVB強(qiáng)度：150μW/cm?，累計(jì)約13.5J/cm?。建模完成后采集皮膚圖像和組織標(biāo)本，對光老化模型進(jìn)行評價(jià)。

1.2.2 富血小板血漿的制備：4%水合氯醛溶液腹腔麻醉大鼠后，剃除胸部毛發(fā)后常規(guī)消毒，使用預(yù)先吸入0.3ml枸櫞酸鈉溶液的5ml注射器穿刺至左心室，抽取動(dòng)脈全血3ml，合計(jì)60ml，置于5ml離心管中離心。首次以200g離心10min，吸取全部上清液及交界面下3mm液體，置于另一離心試管中進(jìn)行再次離心，200g離心10min，棄去上3/4液體，剩余1ml搖勻，既得PRP，取少量用于血小板計(jì)數(shù)。所制得的PRP隨機(jī)分為2組，一組以凝血酶、10%氯化鈣混合物予以激活，得到凝膠狀的A-PRP;另一組不予激活，為N-PRP。

1.2.3 PRP注射治療大鼠光老化皮膚：完成建模后，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后實(shí)施干預(yù)。模型大鼠隨機(jī)進(jìn)行分組，每組6只。分別為A-PRP注射組，N-PRP注射組，生理鹽水注射組，空白對照組，除上述4組外，另隨機(jī)抽取6只正常大鼠為正常大鼠組。

4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，于照射區(qū)域標(biāo)定3cm×3cm大小區(qū)域，胰島素針抽取1ml注射物，進(jìn)行真皮層內(nèi)注射，每只大鼠均勻注射20個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.5ml，A-PRP注射組行A-PRP注射，N-PRP注射組行N-PRP注射，生理鹽水注射組注射生理鹽水，空白對照組及正常大鼠組不注射。

1.2.4 免疫組化法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)：注射4周后，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，處死后取皮膚標(biāo)本。SP二步法對Ⅰ、Ⅲ型膠原進(jìn)行染色，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取3張切片，每張切片高倍鏡下觀察3個(gè)視野，合計(jì)每組54個(gè)視野。以Image Pro Plus 6.0軟件對切片圖像進(jìn)行分析，檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的平均光密度值，取每組平均值進(jìn)行比較。

1.2.5 Western bolt法檢測TGF-β、MMP-1表達(dá)：以Image J圖像分析軟件對各組條帶吸光度值進(jìn)行分析，從而測定TGF-β、MMP-1的表達(dá)情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 大鼠光老化模型建立結(jié)果：累計(jì)照射60d后，大鼠背部皮膚出現(xiàn)深大的靜態(tài)皺紋和色素沉著，組織學(xué)觀察可見大鼠皮膚真皮厚度顯著減低，表皮不規(guī)則增厚，膠原纖維數(shù)量減少、排列紊亂，炎性細(xì)胞大量浸潤，符合皮膚光老化特征。

2.2 免疫組化檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)結(jié)果：各組標(biāo)本均可見不同程度的Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維染色，膠原纖維染色呈灰褐色。Ⅰ型膠原染色可見，A-PRP注射組改善最為明顯，膠原纖維排列規(guī)律、緊密;N-PRP注射組優(yōu)于生理鹽水注射組，空白對照組但少于A-PRP注射組;空白對照組和正常大鼠組差異不明顯。

Ⅰ型膠原纖維平均光密度值檢測結(jié)果顯示：A-PRP注射組（4.63）高于生理鹽水注射組（3.86）、空白對照組（3.94），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;A-PRP注射組（4.63）高于N-PRP注射組（4.24），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;A-PRP注射組（4.63）與正常大鼠組（5.07）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

Ⅲ型膠原纖維染色結(jié)果變化趨勢與Ⅰ型膠原基本相同，A-PRP注射組（4.43）顯著高于生理鹽水注射組（3.97）、空白對照組（3.94），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但A-PRP注射組（4.43）、N-PRP注射組（4.32）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。A-PRP注射組（4.43）與正常大鼠組（4.76）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 Western bolt法檢測TGF-β、MMP-1表達(dá)結(jié)果：通過條帶吸光度值分析TGF-β和MMP-1的表達(dá)。A-PRP注射組較生理鹽水注射組、空白對照組TGF-β表達(dá)顯著增高（P<0.01），MMP-1表達(dá)顯著下降（P<0.01）;A-PRP注射組較N-PRP注射組TGF-β表達(dá)顯著增高（P<0.05），MMP-1表達(dá)無顯著差異（P>0.05）;與正常大鼠組比較，A-PRP注射組TGF-β表達(dá)無顯著差異（P>0.05），MMP-1表達(dá)顯著增高（P<0.05）。

3? 討論

真皮中的膠原纖維主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維，其中Ⅰ型占80%，是維持皮膚張力的主要部分，Ⅲ型膠原纖維是幼稚的膠原纖維，主要構(gòu)成網(wǎng)狀纖維[9-10]。既往的研究表明，紫外線照射首先可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-1、TNF-α等炎癥因子，這些炎癥因子通過激活NF-κB通路和MAPK通路上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs的表達(dá)。MMPs是一類鋅依賴的蛋白酶家族，在細(xì)胞外基質(zhì)的分解和改建中發(fā)揮著重要作用。MMP-1可以特異性的將Ⅰ型膠原蛋白初步分解，并且其分解產(chǎn)物也能夠抑制Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，因此MMP-1的增加被認(rèn)為是皮膚光老化過程中的核心環(huán)節(jié)[7，11-12];其次，紫外線可以造成皮膚組織活性氧ROS堆積，造成細(xì)胞的凋亡和DNA的損傷，誘發(fā)基因突變甚至皮膚腫瘤的發(fā)生;最后，紫外線還能夠上調(diào)AP-1，抑制TGF-β/Smad通路，TGF-β是抑制皮膚光老化的最主要生長因子之一，TGF-β能夠刺激成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和透明質(zhì)酸的合成，同時(shí)TGF-β還能夠下調(diào)蛋白酶的表達(dá)并增強(qiáng)其抑制物的活性，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解[13]。

PRP是自體血經(jīng)過離心后獲得的血小板濃縮物，血小板α顆粒內(nèi)含有TGF-β、PDGF、VEGF、IGF、EGF等大量生長因子和細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)細(xì)胞趨化和新生血管形成、促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)合成等組織修復(fù)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著核心作用[14]。當(dāng)PRP被激活后，α顆粒內(nèi)的生長因子和細(xì)胞因子大量快速釋放，在TGF-β等因子的趨化作用下，炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和其他未分化細(xì)胞聚集于給藥區(qū)域，炎性細(xì)胞吞噬變性壞死的組織成分，為成纖維細(xì)胞和未分化細(xì)胞的粘附提供有利環(huán)境;成纖維細(xì)胞等粘附于基質(zhì)后，生長因子與細(xì)胞表面受體結(jié)合，通過信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化并上調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、透明質(zhì)酸以及其他細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成，增強(qiáng)MMPs抑制物TIMP的表達(dá)，抑制MMPs對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用[4]。PRP根據(jù)是否通過外源激活物激活可分為A-PRP和N-PRP，在體外，如開放性創(chuàng)面、竇道等使用PRP必須經(jīng)過激活，而在體內(nèi)注射PRP是否需要激活仍然存在爭議[15]。

本課題中，A-PRP注射組和N-PRP注射組相比生理鹽水注射組和空白對照組，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白TGF-β表達(dá)顯著升高，MMP-1表達(dá)顯著下降，其中Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β表達(dá)A-PRP高于N-PRP，而Ⅲ型膠原蛋白和MMPs表達(dá)兩者無顯著差異。綜合以上結(jié)果，說明PRP能夠通過促進(jìn)光老化皮膚Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和TGF-β表達(dá)，抑制MMPs表達(dá)而對光老化皮膚起到改善作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Amano S.Characterization and mechanisms of photoageing-related changes in skin. Damages of basement membrane and dermal structures[J].Exp Dermatol，2016，25（Suppl 3）：14-19.

[2]Naylor EC，Watson RE，Sherratt MJ.Molecular aspects of skin ageing[J].Maturitas，2011，69（3）：249-256.

[3]Foster TE，Puskas BL，Mandelbaum BR，et al.Platelet-rich plasma： from basic science to clinical applications[J].Am J Sports Med，2009，37（11）：2259-2272.

[4]Fabi S，Sundaram H.The potential of topical and injectable growth factors and cytokines for skin rejuvenation[J].Facial Plast Surg，2014，30（2）：157-171.

[5]Abuaf OK，Yildiz H，Baloglu H，et al.Histologic evidence of new collagen formulation using platelet rich plasma in skin rejuvenation： a prospective controlled clinical study[J].Ann Dermatol，2016，28（6）：718-724.

[6]Cho JM，Lee YH，Baek RM，et al.Effect of platelet-rich plasma on ultraviolet b-induced skin wrinkles in nude mice[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg，2011，64（2）：e31-39.

[7]Kim HH，Lee MJ，Lee SR，et al.Augmentation of UV-induced skin wrinkling by infrared irradiation in hairless mice[J].Mech Ageing Dev，2005，126（11）：1170-1177.

[8]楊汝斌，萬屏，劉玲，等.SD大鼠皮膚光老化動(dòng)物模型建立方法的探索[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2011，25（3）：199-202.

[9]劉瑋.皮膚光老化[J].臨床皮膚科雜志，2003，32（7）：424-426.

[10]Song H，Zhang S，Zhang L，et al.Effect of orally administered collagen peptides from bovine bone on skin aging in chronologically aged mice[J].Nutrients，2017，9（11）：1209.

[11]Romanhole RC，Ataide JA，Moriel P，et al.Update on ultraviolet A and B radiation generated by the sun and artificial lamps and their effects on skin[J].Int J Cosmet Sci，2015，37（4）：366-370.

[12]Pittayapruek P，Meephansan J，Prapapan O，et al.Role of matrix metalloproteinases in photoaging and photocarcinogenesis[J].Int J Mol Sci，2016，17（6）：868.

[13]葉希韻.紫外線致皮膚光老化研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué)，2015，40（11）：2-5.

[14]Piccin A，Di Pierro AM，Canzian L，et al.Platelet gel： a new therapeutic tool with great potential[J].Blood Transfus，2017，15（4）：333-340.

[15]Gentile P，Cole JP，Cole MA，et al.Evaluation of not-activated and activated PRP in hair loss treatment： role of growth factor and cytokine concentrations obtained by different collection systems[J].Int J Mol Sci，2017，8（2）：408.

[收稿日期]2017-12-18