香加皮精多糖的單糖組成、熱重和熱裂解分析

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(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院,河南省香精香料與調(diào)香工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450002)

多糖為單糖的聚合物,在理化性質(zhì)方面具有無毒副作用、熱穩(wěn)定、大比表面積、緩釋性、乳化性、吸水性、保濕性等特征[1-3],因此,多糖被廣泛開發(fā)用于藥物緩釋、面膜保濕、煙草保潤等領(lǐng)域[4-11]。有研究表明,多糖作為保潤劑的同時(shí)還具有卷煙加香效果,許春平等[12]對(duì)從香料煙中提取的多糖在氮?dú)夥諊逻M(jìn)行熱裂解產(chǎn)物分析,發(fā)現(xiàn)香料煙多糖可以分解出99種成分,如5-甲基-2-糠醛、糠醛、吡咯等;黃芳芳等[13]對(duì)銅藻多糖進(jìn)行熱裂解分析發(fā)現(xiàn),銅藻多糖可以裂解成多種雜環(huán)類、酮類和醛類物質(zhì),感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,添加銅藻多糖的樣品在改善回甜感、圓潤感、柔和度方面均有提升;楊君等[14]將裂片石莼多糖添加到卷煙中進(jìn)行感官評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)添加后對(duì)感官質(zhì)量有總體提升,煙氣透發(fā)性變好,煙氣變細(xì)膩等。這些文獻(xiàn)表明,多糖加熱可以裂解成多種豐富的化學(xué)成分。然而,由于不同植物的多糖組成、分子量大小均有差異,因此熱裂解產(chǎn)物會(huì)有所不同。

香加皮(Cortex Periplocae),源于蘿藦科植物杠柳(PeriplocasepiumPunge.)的干燥根皮,常用傳統(tǒng)中藥,對(duì)于祛風(fēng)濕、心悸氣短、腰膝酸軟、強(qiáng)筋骨、慢性心力衰竭等有非常好的效果[15-17]。研究發(fā)現(xiàn),香加皮含有豐富的化學(xué)成分,如萜類、糖苷類、多糖類等[18-19]。然而,關(guān)于香加皮多糖的研究較少,盡管已有少數(shù)文獻(xiàn)[19]對(duì)香加皮多糖進(jìn)行初步分離并檢測,初步判斷有甘露糖和乳糖。但對(duì)香加皮精多糖的組成、熱重和熱裂解未進(jìn)行更深一步的研究。本實(shí)驗(yàn)在前期研究香加皮多糖的提取、純化、結(jié)構(gòu)鑒定和抗氧化活性的基礎(chǔ)上[20],進(jìn)一步研究了香加皮精多糖的單糖組成、熱重性質(zhì)和熱裂解產(chǎn)物,以期為香加皮多糖在更廣泛的使用上提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香加皮精多糖 實(shí)驗(yàn)室自制[20];標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%):阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、肌醇六乙酸酯 北京索萊寶科技有限公司;三氟乙酸、二氯甲烷、鹽酸羥胺、醋酸酐 天津市大茂化學(xué)試劑廠。

BF-2000型氮吹儀、ZRT-B型熱重分析儀 北京京儀高科有限公司;Agilent 7890B-5977A型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國安捷倫科技有限公司;5250-T型熱裂解儀 美國CDS。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精多糖單糖組分的定量分析 香加皮精多糖CPP1、CPP2和CPP3由本實(shí)驗(yàn)室提前制備,香加皮原料經(jīng)過脫脂、脫色、透析等處理得到香加皮粗多糖,香加皮粗多糖經(jīng)過離子交換色譜DEAE-52纖維素和葡聚糖凝膠色譜 Sephadex G-100進(jìn)行分離純化,分別得到香加皮精多糖CPP1、CPP2和CPP3。其具體制備方法見文獻(xiàn)[20]。制備好的精多糖通常置于-18 ℃冰箱中保存,實(shí)驗(yàn)之前取出并在50 ℃烘箱中干燥2 h。

1.2.1.1 精多糖的酸水解 采用三氟乙酸水解法對(duì)精多糖進(jìn)行水解[21-22]。分別準(zhǔn)確稱取三種香加皮精多糖各10 mg置于10 mL具塞比色管中,加入8 mL濃度為2 mol/L三氟乙酸(TFA),放入110 ℃烘箱下充分反應(yīng)4 h進(jìn)行水解。反應(yīng)結(jié)束后,冷卻至室溫,在反應(yīng)液中滴入少量甲醇,低壓旋轉(zhuǎn)蒸干(50 ℃、0.09 MPa、15 min),如此反復(fù)3次使TFA完全揮發(fā)干凈。

1.2.1.2 衍生化處理 采用柱前衍生化方法[23]，向水解后的香加皮多糖中加入0.5 mL吡啶和5 mg鹽酸羥胺,放入90 ℃烘箱中反應(yīng)0.5 h,然后取出靜置冷卻至室溫25 ℃,再加入0.5 mL醋酸酐,繼續(xù)在90 ℃條件下進(jìn)行乙?；磻?yīng)0.5 h,用氮吹儀吹干,得到糖腈乙酸酯衍生物,準(zhǔn)確加入1.0 mL二氯甲烷溶解后采用GC-MS進(jìn)行檢測。所有的單糖標(biāo)準(zhǔn)品按照同樣的方法進(jìn)行衍生化處理,用內(nèi)標(biāo)法定量多糖樣品中的單糖組分,肌醇六乙酸酯作為內(nèi)標(biāo)物。

GC-MS條件為程序升溫,柱溫130 ℃保持6 min,以4 ℃/min至240 ℃,保持20 min,載氣為He,進(jìn)樣口溫度250 ℃,分流比1∶50,柱流速1 mL/min。質(zhì)譜條件:EI(70eV),接口溫度250 ℃,離子源溫度250 ℃,掃描范圍:m/z 50～550,掃描速率:2.9 scan/s。

1.2.1.3 定量分析 采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)單糖組成進(jìn)行定性和定量分析[24]。根據(jù)內(nèi)標(biāo)物(肌醇六乙酸酯)、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的質(zhì)量以及內(nèi)標(biāo)物、標(biāo)準(zhǔn)品和被測組分的峰面積求出樣品中單糖的含量[25-27]。單糖含量按以下公式計(jì)算,然后再計(jì)算各單糖的摩爾比。

式中:Ai-樣品中某單糖峰面積;AIi-樣品中加入的內(nèi)標(biāo)物峰面積;AIs-標(biāo)準(zhǔn)樣品中加入的內(nèi)標(biāo)物的峰面積;As-某單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積;ms-某單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量,mg;mIs-標(biāo)準(zhǔn)樣品中加入的內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量,mg;mIi-樣品中加入的內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量,mg;m-稱取糖樣品的質(zhì)量,mg。

1.2.2 精多糖的熱重分析 按照文獻(xiàn)[28]方法測試熱重。準(zhǔn)確稱取2.00 mg精多糖,使用熱重儀在氮?dú)猸h(huán)境下精多糖溫度由25 ℃高到900 ℃,升溫速率為10 ℃/min,進(jìn)行熱重分析測定。

1.2.3 精多糖熱裂解產(chǎn)物分析 取分別稱量好的干燥的精多糖放入石英管中,用石英棉堵住兩端,隨后將石英管放入熱裂解儀中,在氮?dú)猸h(huán)境下進(jìn)行熱裂解實(shí)驗(yàn)。熱裂解和GC-MS條件[29]為:

熱裂解條件:起始溫度:30 ℃,熱裂解溫度:300、600 ℃和900 ℃,升溫速率為10 ℃/min,升到目標(biāo)溫度后保持時(shí)間10 s;

氣相色譜條件:色譜柱:DB-5MS 彈性石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:280 ℃;進(jìn)樣量:1 μL;分流比:50∶1;載氣:氮?dú)?升溫程序:以2 ℃/min升溫至50 ℃后保持2 min,再以2 ℃/min升至180 ℃,再以8 ℃/min速度升溫至280 ℃,保持10 min;傳輸線溫度為280 ℃。

質(zhì)譜條件:電離方式:EI;電子能量:70 eV;電子倍增器電壓:1600 V;質(zhì)量掃描范圍:30～500 amu;離子源溫度:230 ℃;四極桿溫度:150 ℃。利用NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索,以匹配度≥80%者定性,使用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香加皮精多糖的單糖組成

經(jīng)過對(duì)三個(gè)精多糖的乙?；苌疓C-MS檢測,結(jié)果顯示三個(gè)樣品均含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。段漓童等[19]曾經(jīng)用薄層色譜和紙色譜的方法初步鑒別出香加皮多糖中含有乳糖和甘露糖。之所以與該文獻(xiàn)有差別,可能是原料來源不同和檢測方法不同造成的。實(shí)驗(yàn)得到各單糖組分之間的摩爾比,具體單糖組成的摩爾比見表1,其中CPP1中以葡萄糖和半乳糖為主,摩爾占比分別為76%和15%;CPP2中以半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖為主,摩爾占比分別為55%、17%和15%;CPP3中以葡萄糖、半乳糖和鼠李糖為主,摩爾占比為44%、34%和16%，GC-MS圖譜見圖1。

圖1 各多糖的單糖組成GC-MS圖Fig.1 GC-MS profile of aldononitrile acetate derivatives of monosaccharide composition注:單糖標(biāo)準(zhǔn)品(a):1:鼠李糖;2:阿拉伯糖;3:甘露糖;4:葡萄糖;5:半乳糖;6:內(nèi)標(biāo);7:乳糖;CPP1(b);CPP2(c)和CPP3(d)。

表1 香加皮精多糖單糖組分的摩爾占比(%)Table 1 Major monosaccharide composition of the CPPs(%)

2.2 香加皮多糖熱重分析

熱穩(wěn)定性是物質(zhì)重要的理化性質(zhì)之一,在多糖研究中常用熱重分析儀在25～600 ℃或者25～900 ℃范圍內(nèi),在空氣或者保護(hù)氣如氮?dú)饣驓鍤鈿夥罩羞M(jìn)行熱穩(wěn)定性分析[28-30]。文獻(xiàn)研究表明[31-33],多糖一般在300 ℃以前穩(wěn)定性較好,無明顯的失重;無論是空氣還是保護(hù)氣氣氛環(huán)境,多糖在300～400 ℃之間都有明顯的失重發(fā)生;并在高于400 ℃以后失重速率逐漸降低;也由于卷煙燃燒區(qū)氧氣含量極低,溫度可達(dá)900 ℃。因此,為了模擬卷煙燃燒區(qū)過程,對(duì)香加皮精多糖選用25～900 ℃下的氮?dú)鈿夥罩羞M(jìn)行研究。

2.2.1 CPP1熱重分析 從香加皮多糖CPP1的熱重曲線上可以看出(圖2),整體CPP1的熱重曲線分為四個(gè)階段。第一階段為從25 ℃升至300 ℃,這一階段CPP1的失重率為7.67%。本階段失去的是精多糖中的自由水即游離水。這部分水分靠分子間作用力即范德華力吸附,因此吸附力較弱。第二階段在300～340 ℃,本階段有明顯的失重現(xiàn)象,失重率約68.63%。表明精多糖在本階段受熱大量分解。第三階段在340～520 ℃之間,在這個(gè)階段失重速率緩慢降低,表明精多糖逐漸分解完全。第四階段在520～900 ℃,本階段幾乎無失重顯現(xiàn),說明精多糖在此之前已大部分分解。整體來看可知CPP1的熱失重區(qū)間主要集中在300～520 ℃,總失重率約為95%。

圖2 CPP1的熱失重曲線Fig.2 Thermogravimetric curves of CPP1

2.2.2 CPP2的熱重分析 多糖CPP2的熱重曲線(圖3)與CPP1整體趨勢(shì)一致,但各階段的溫度節(jié)點(diǎn)有差異。CPP2熱重曲線同樣分為四個(gè)階段。第一階段在25～250 ℃,水分的散失主要集中在120 ℃以前,在此之后失重率變化很小,同樣說明CPP2中主要含有自由水,幾乎不含結(jié)合水。第二階段在250～350 ℃之間,本階段有明顯的失重臺(tái)階,失重率約66%。表明樣品在本階段受熱大量分解,溫度節(jié)點(diǎn)與CPP1是不同的。第三階段在350～540 ℃,本階段精多糖失重率平緩下降,說明精多糖分解速率快速減慢且慢于第三階段。第四階段為550～900 ℃,幾乎無失重現(xiàn)象。可以看出CPP2同樣在前三階段多糖已基本分解完全,總失重率約為88%。

圖3 CPP2的熱失重曲線Fig.3 Thermogravimetric curves of CPP2

2.2.3 CPP3的熱重分析 多糖CPP3的熱重曲線(圖4)與CPP1和CPP2在800 ℃以前整體趨勢(shì)一致,但各階段的溫度節(jié)點(diǎn)有差異。CPP3熱重曲線也可分為四個(gè)階段。第一階段在25～250 ℃,水分的散失主要集中在120 ℃以前,在此之后失重率變化很小,同樣說明CPP3中主要含有自由水,幾乎不含結(jié)合水。第二階段在250～350 ℃之間,本階段有明顯的失重臺(tái)階,失重率為70.52%。表明精多糖在本階段大量受熱分解。第三階段在350～560 ℃,本階段精多糖失重率平緩下降,說明精多糖分解速率減慢。第四階段在560～900 ℃,不同的是,在本階段的560～580 ℃之間有個(gè)小的失重臺(tái)階,失重率為4.85%,這是前兩個(gè)多糖中沒有出現(xiàn)過的,其具體原因還需進(jìn)一步探究。之后在580～900 ℃,這一階段比較平穩(wěn),已無明顯的失重現(xiàn)象。可以看出CPP3在前三階段多糖已基本分解完全,總失重率約為86%。

圖4 CPP3的熱失重曲線Fig.4 Thermogravimetric curves of CPP3

分析可知,盡管精多糖在實(shí)驗(yàn)之前已經(jīng)在50 ℃下干燥2 h,但是仍然含有部分游離水,說明多糖對(duì)水有一定的吸附能力,這與文獻(xiàn)中多糖的熱重曲線是類似的[28]。CPP1、CPP2和CPP3熱重曲線的總體規(guī)律一致,均有四個(gè)階段。但三個(gè)精多糖的熱重結(jié)果差異明顯,CPP2和CPP3的熱解溫度區(qū)間在250～350 ℃,而CPP1在300～340 ℃,說明CPP2和CPP3比CPP1起始分解溫度低;從最終保留率看,CPP1為5%,CPP2為12%,CPP3為14%,說明CPP1分解更徹底,而CPP2和CPP3較難以分解完全。在這一過程中,三個(gè)精多糖隨溫度變化的重量損失情況能被反映出來,但熱裂解產(chǎn)物需要進(jìn)一步通過GC-MS進(jìn)行檢測。

2.3 香加皮多糖熱裂解產(chǎn)物分析

由于卷煙燃吸是在缺氧條件下進(jìn)行的,為了模擬卷煙燃吸過程,研究者常在氮?dú)夥諊驴疾煜懔匣蚨嗵堑臒崃呀猱a(chǎn)物[29-30]。300、600和900 ℃分別代表了卷煙燃吸過程的三個(gè)溫度區(qū)[34-38],本試驗(yàn)于該三個(gè)溫度下進(jìn)行熱裂解,詳細(xì)熱裂解產(chǎn)物見表2。

表2 不同溫度下三個(gè)香加皮精多糖的熱裂解產(chǎn)物Table 2 Thermal cracking products of three scented polysaccharides at different temperatures

續(xù)表

根據(jù)香加皮多糖CPP1熱裂解圖和裂解產(chǎn)物(表2)可知,在300 ℃時(shí),由于裂解溫度較低,CPP1裂解不充分,裂解產(chǎn)物很少,識(shí)別出的化合物僅有7種,主要為糠醛、壬醛和5-羥甲基糠醛等,其中以糠醛含量為最高,達(dá)到15.23%。在600 ℃時(shí),裂解產(chǎn)物明顯增多,識(shí)別出23種化合物,含量較高的主要有糠醛、1,4:3,6-脫氫-α-右旋葡萄糖、2,4,5-三羥基嘧啶、麥芽醇、2-甲基-1,3-環(huán)戊二酮、5-甲基糠醛、棕櫚酸6等,其中以含量最高的前兩種為糠醛和2,4,5-三羥基嘧啶,分別達(dá)到23.44%和11.41%。在900 ℃時(shí),裂解產(chǎn)物更多更復(fù)雜,識(shí)別出36種化合物,含量較高的主要有糠醛、角鯊烯、苯乙烯、5-甲基糠醛、2-甲基-1,3-環(huán)戊二酮、3-羥基-2-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮等,其中以含量最高的前兩種為糠醛和角鯊烯,分別達(dá)到13.68%和4.56%。

如表2，與CPP1熱裂解產(chǎn)物類似,CPP2和CPP3在300 ℃下裂解產(chǎn)物很少,均只識(shí)別出6種。在600 ℃時(shí)分別識(shí)別出30和29種,900 ℃下分別識(shí)別出31和33種。從三個(gè)多糖的裂解產(chǎn)物可以看出,總體上300 ℃時(shí)裂解產(chǎn)物較少,這是因?yàn)槎嗵穷愇镔|(zhì)在這個(gè)溫度以下穩(wěn)定性較好。同時(shí)熱重分析也表明,在300 ℃之前,熱失重較小,多糖裂解不充分,因此裂解產(chǎn)物較少。此溫度下裂解產(chǎn)物包含了糠醛、5-甲基糠醛、丙醛、2-甲基-1,3-環(huán)戊二酮、苯乙酸苯乙酯、2,5-二甲酰基呋喃等多種雜環(huán)類物質(zhì)。這類物質(zhì)也是卷煙煙氣中常見物質(zhì),具有閾值低、香氣豐富等特點(diǎn),表明香加皮精多糖的裂解產(chǎn)物與煙氣協(xié)調(diào)性較好,可以豐富卷煙香氣。在600和900 ℃下裂解產(chǎn)物較多,同時(shí)熱失重明顯,裂解充分,裂解產(chǎn)物均以糠醛、5-甲基糠醛、2-甲基-1,3-環(huán)戊二酮、苯乙酸苯乙酯、2-甲基呋喃等較多,與文獻(xiàn)[9,12-13]報(bào)道基本一致,這是糖類物質(zhì)裂解產(chǎn)物的特征物質(zhì)。

從分析鑒定的結(jié)果來看,香加皮多糖的熱裂解產(chǎn)物主要可以分為四大類:

雜環(huán)類化合物,主要是一些吡啶、吡嗪、吲哚等化合物,如糠醛、5-甲基糠醛、吲哚、3-甲基吡咯、2-甲基吡啶等。這類物質(zhì)可能是葡萄糖殘基、半乳糖殘基分解的產(chǎn)物。而吡咯、吡啶、糠醛等雜環(huán)類物質(zhì)一般具有焦香、焦甜香,卷煙中添加的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物也屬于此類物質(zhì)[39],這類物質(zhì)閾值較低,可以提高卷煙香氣量,而且煙草和煙氣中就含有大量的此類物質(zhì)[40-43],因此與煙氣協(xié)調(diào)性較高。

酮類、醛類、酯類、烯類和酸類化合物，如3-戊酮、2-甲基環(huán)戊烯-1-酮、苯乙烯、2H-吡喃-二酮、3-羥基-2-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、苯乙酸苯乙酯、棕櫚酸、硬脂酸等。酮類、醛類、烯類和酯類化合物一般具有甜香、果香,在卷煙中有醇和煙氣口感的作用;羧酸類可以調(diào)節(jié)卷煙煙氣pH,減少卷煙刺激性。這類物質(zhì)也是煙草和煙氣中常見的種類[12,44-45],能為豐富卷煙香氣起到積極的貢獻(xiàn)。

酚類物質(zhì)，如苯酚、鄰甲酚、對(duì)甲苯酚、對(duì)乙基苯酚等。酚類化合物可以產(chǎn)生酚樣和藥草香氣,也是煙草和煙氣中的常見物質(zhì)[46]。

苯類物質(zhì)，如苯、甲苯、聯(lián)苯、2-甲基苯并呋喃、萘等。在高溫燃燒區(qū)由于處于缺氧狀態(tài),有機(jī)物無法直接燃燒而發(fā)生聚合反應(yīng)和自由基反應(yīng),形成穩(wěn)定性好的苯及同系物、稠環(huán)化合物,同時(shí)也形成一些雜環(huán)的芳香族化合物[47]。

3 結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)室制備得到的三個(gè)香加皮精多糖具有相似的單糖組成,而其組分含量的不同則影響了熱穩(wěn)定性鏈接結(jié)構(gòu),是造成熱分析結(jié)果有差別的原因。通過對(duì)三種多糖的熱重分析發(fā)現(xiàn),三種多糖均在第三階段大量分解,CPP1在第三階段520 ℃結(jié)束后,失重率可以達(dá)到95%。CPP2在第三階段550 ℃結(jié)束后,失重率達(dá)到88%。CPP3在560 ℃失重率達(dá)到86%。三個(gè)多糖的分解溫度均低于煙支燃燒的熱解區(qū)溫度的400～700 ℃,處于蒸餾區(qū)溫度范圍內(nèi),說明香加皮多糖適合用作卷煙加香材料。對(duì)三種多糖的熱裂解產(chǎn)物研究發(fā)現(xiàn),600和900 ℃時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量對(duì)煙草香味有貢獻(xiàn)的熱解產(chǎn)物,說明多糖在卷煙燃吸中能夠起到增香補(bǔ)香的效果。