甜茶苷和甜茶多酚同時(shí)提取工藝優(yōu)化

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(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)新國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,湖南長(zhǎng)沙 410128)

隨著科學(xué)技術(shù)及社會(huì)的發(fā)展,人民生活水平不斷提高,生活品質(zhì)不斷改善,食品結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。高熱量食品特別是糖類物質(zhì)的過(guò)量攝入引起的肥胖癥、糖尿病、齲齒、高血壓等疾病已成為一大社會(huì)問(wèn)題,使得人們對(duì)新型甜味劑的開(kāi)發(fā)越來(lái)越重視。廣西甜茶(RubussuavissmusS.Lee)是薔薇科懸鉤子屬的一種有刺灌木,含有一種無(wú)毒、高糖度、低熱能的甜味物質(zhì)——甜茶苷(Rubusoside),又稱甜葉懸鉤子苷、甜茶素[1-2]。甜茶苷甜度是蔗糖的300倍,具有降血糖[3]、降血脂[4]、防齲齒[5]等多種功效,在飲料、醫(yī)藥、糖果、護(hù)膚品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。此外,甜茶葉中還存在含量較高的多酚類物質(zhì)[7]。甜茶多酚是高效的抗氧化劑[8],還具有抗過(guò)敏[9]、抗菌抗病毒[10]、提高免疫力[11]等多種作用。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的甜茶中活性成分的提取方法主要有有機(jī)溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法和酶解法等[12-15],甜茶中有效成分的提取研究已相對(duì)成熟,但多以提取單一成分或一類成分為主,關(guān)于甜茶中多種活性成分的同時(shí)提取工藝鮮有報(bào)道。

本文從資源的綜合利用、降低生產(chǎn)成本和適合規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的角度,選擇以水為溶劑同時(shí)提取甜茶苷和甜茶多酚,在單因素的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對(duì)甜茶苷和甜茶多酚的同時(shí)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到廣西甜茶中甜茶苷和甜茶多酚的提取最佳工藝參數(shù),為廣西甜茶的開(kāi)發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣西甜茶干葉 由長(zhǎng)沙世唯生物科技有限公司提供;甜茶苷標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC>98%) 北京嘉世玉和化工技術(shù)研究院;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)、福林酚試劑 上海源葉生物科技有限公司;乙腈(色譜純) 德國(guó)Merck公司;蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制;其余試劑 均為分析純。

Agilent 1260液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司;UVmini-1240型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;AUW220D型分析天平 日本島津公司;PL203電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;YB-1500A型高速多功能粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆明市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜茶水提液的制備 將甜茶干葉粉碎,過(guò)30目篩,稱取5 g于250 mL錐形瓶中,加入一定量蒸餾水,置于磁力攪拌器中(100 r/min)于一定溫度下攪拌，提取一定時(shí)間后,抽濾,收集甜茶水提液。

1.2.2 測(cè)定方法

1.2.2.1 甜茶苷的HPLC測(cè)定方法 a.色譜條件:選擇乙腈-水作為流動(dòng)相,利用儀器的二極管陣列全波長(zhǎng)紫外掃描功能進(jìn)行掃描后得到的最大吸收值為205 nm,因此選擇205 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。檢測(cè)器:Aglient 1260;色譜柱:Ultimate XB-C18(4.6×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;色譜乙腈和水的體積比為33∶67;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):205 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

b.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:精密稱取干燥恒重的甜茶苷5 mg,加適量蒸餾水溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,配成濃度為1 mg/mL的甜茶苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確移取甜茶苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL,分別用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中,得到濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述色譜條件測(cè)定。以甜茶苷濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

c.含量測(cè)定:移取1 mL甜茶苷水提液于25 mL容量瓶中,蒸餾水定容,搖勻。按上述色譜條件進(jìn)行分析。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中甜茶苷的質(zhì)量濃度,并按公式(1)計(jì)算甜茶苷提取率。

式(1)

式中:X為待測(cè)溶液中甜茶苷濃度(mg/mL)；V為樣品溶液總體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為所取甜茶干粉中甜茶苷的總量(mg)。

1.2.2.2 甜茶多酚的測(cè)定方法 a.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:精密稱取干燥恒重的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,加適量蒸餾水溶解后定容至25 mL容量瓶中,再準(zhǔn)確吸取5 mL,加蒸餾水稀釋至25 mL,搖勻,配成濃度為0.04 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。準(zhǔn)確移取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5 mL于25 mL棕色容量瓶中,加入1 mol/L Folin-Ciocalteu試劑2 mL和15% Na2CO3溶液7.5 mL,以蒸餾水定容至刻度,配制成1.6×10-3、3.2×10-3、4.8×10-3、6.4×10-3、8.0×10-3mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,30 ℃下靜置1 h,在波長(zhǎng)770 nm處測(cè)定吸光度。以甜茶多酚濃度(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

b.含量測(cè)定:精確吸取甜茶多酚水提液1 mL于25 mL棕色容量瓶中,加入1 mol/L Folin-Ciocalteu試劑2 mL和15% Na2CO3溶液7.5 mL,以蒸餾水稀釋至刻度,30 ℃下靜置1 h。測(cè)定到顯色,在波長(zhǎng)770 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出甜茶多酚濃度,按公式(2)計(jì)算水提液中甜茶多酚提取率。

式(2)

式中:c為水提液中甜茶多酚濃度(ug/mL);v為樣品溶液總體積(mL);n為稀釋倍數(shù);m為所取甜茶干粉中總多酚的總量(mg)。

1.2.3 甜茶葉中甜茶苷及甜茶多酚的總量的檢測(cè) 精密稱取3份5 g甜茶(30目篩)粉末于250 mL錐形瓶中,加入130 mL蒸餾水,超聲提取(水浴溫度30 ℃,功率180 W)45 min,提取3次,抽濾得濾液,將濾液合并,按1.2.2測(cè)定方法檢測(cè)濾液中的甜茶苷和甜茶多酚的總量[16]。

1.2.4 甜茶水提單因素實(shí)驗(yàn) 甜茶干葉粉(30目),選擇液料比為30∶1 mL/g,提取時(shí)間為30 min,考察提取溫度(10、30、50、70、90 ℃)對(duì)甜茶苷和甜茶總多酚提取率的影響;選擇提取溫度為70 ℃,提取時(shí)間為30 min,考察料液比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)對(duì)甜茶苷和甜茶總多酚提取率的影響。選擇液料比為30∶1 mL/g,提取溫度為70 ℃考察提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對(duì)甜茶苷和甜茶總多酚提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 以提取溫度(A)、液料比(B)和時(shí)間(C)為考察因素,以甜茶苷提取率和甜茶多酚提取率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理,采用Design-Expert 8.0.6軟件分別設(shè)計(jì)3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的水平編碼值見(jiàn)表1、表2。

表1 甜茶苷的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Levels and factors used in response surface methodology of rubusoside

表2 甜茶總多酚的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 2 Levels and factors used in response surface methodology of total polyphenols in sweet tea

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平行三次后取平均值,采用Origin 8.5軟件和Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.1.1 甜茶苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用高效液相色譜法檢測(cè)水提液中甜茶苷的含量[17],獲得甜茶苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見(jiàn)公式(3)。

Y=5137.5X+27.01

式(3)

式中:X為甜茶苷質(zhì)量濃度(mg/mL);Y為所對(duì)應(yīng)的峰面積。相關(guān)系數(shù)R2=0.999,說(shuō)明甜茶苷的濃度在0.02～0.1 mg/mL范圍內(nèi),甜茶苷濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 甜茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定水提液中甜茶多酚的含量[18]。獲得甜茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見(jiàn)公式(4)。

y=0.0999x+0.0952

式(4)

式中:x為多酚質(zhì)量濃度(以沒(méi)食子酸計(jì))(mg/mL);y為對(duì)應(yīng)的吸光度;相關(guān)系數(shù)R2=0.997,說(shuō)明甜茶多酚的濃度在1.6×10-3～8.0×10-3mg/mL范圍內(nèi),甜茶多酚濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2 甜茶葉中甜茶苷及甜茶多酚的總量

按照1.2.3提取方法,當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí),甜茶粉末中甜茶苷和甜茶多酚已提取完全,測(cè)量5 g甜茶粉末中甜茶苷的總量M為207.5 mg(RSD=0.72%,n=3),甜茶多酚總量m為518.13 mg(RSD=1.23%,n=3)。

2.3 單因素對(duì)甜茶苷及多酚提取效果的影響

2.3.1 提取溫度對(duì)甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響 由圖1可知,在溫度低于70 ℃時(shí),甜茶苷的提取率隨溫度的升高明顯增加;當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí),甜茶苷的提取率趨于穩(wěn)定。因此,選擇用70 ℃提取甜茶苷。甜茶多酚的提取率在10～50 ℃時(shí)急劇上升,之后下降并趨于平穩(wěn)?？赡茉蚴窃诘蜏胤秶鷥?nèi)隨著溫度的升高,甜茶多酚在水中的擴(kuò)散加快;當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),酚類物質(zhì)易被氧化,導(dǎo)致多酚提取率反而減少[19]。因此,選擇50 ℃為甜茶多酚的提取溫度。

圖1 提取溫度對(duì)甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on the extraction rate of rubusoside and polyphenols in sweet tea

2.3.2 液料比對(duì)甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響 由圖2可知,在液料比低于25∶1 mL/g時(shí),甜茶苷提取率隨著料液比的增加明顯增加;當(dāng)液料比 25∶1 mL/g時(shí),甜茶苷的提取率已達(dá)到30∶1 mL/g時(shí)的98.8%,即繼續(xù)增加提取溶劑對(duì)甜茶苷的溶出影響不大。從節(jié)約生產(chǎn)成本的角度考慮,本文選擇液料比為25∶1 mL/g提取甜茶苷。甜茶多酚的提取率隨料液比的增大而增加,特別是液料比20∶1 mL/g以下,甜茶多酚提取率隨料液比的增大而增加明顯;當(dāng)液料比超過(guò)20∶1 mL/g時(shí),甜茶多酚提取率已達(dá)30∶1 mL/g時(shí)的95.8%,繼續(xù)增加溶液多酚的溶出的效果不再明顯[20];因此,選擇20∶1 mL/g為提取甜茶多酚的料液比。

圖2 料液比對(duì)甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響Fig.2 Effects of liquid-material ratio on the extraction rate of rubusoside and polyphenols in sweet tea

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)甜茶苷和總多酚提取率的影響 由圖3可知,隨著提取時(shí)間的增加,甜茶苷的提取率逐漸提高,特別是30 min以下,甜茶苷提取率增加明顯。而當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)30 min時(shí),甜茶苷提取率的曲線變化不明顯,這是由于此時(shí)甜茶苷已被大部分溶出,繼續(xù)增加溶液甜茶苷的溶出的效果不再明顯。因此,選擇30 min為甜茶苷的提取時(shí)間。在提取溫度為50 ℃時(shí),提取時(shí)間30 min以內(nèi),水提液中甜茶多酚顯著增加(p<0.05);當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)30 min后,甜茶多酚的提取率反而逐漸降低。這是由于甜茶粉末中的酚類物質(zhì)在30 min時(shí)就已提取完全,隨著提取時(shí)間的增加,酚類物質(zhì)受光熱等條件的影響被氧化分解,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而含量降低[21],因此選擇30 min為甜茶多酚的提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)甜茶苷和甜茶多酚提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the extraction rate of rubusoside and polyphenols in sweet tea

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化甜茶提取工藝

2.4.1 甜茶苷的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。應(yīng)用Design-Expert.8.0.6軟件對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,得到回歸模型方差分析結(jié)果,見(jiàn)表4;同時(shí)擬合得到的二次回歸方程為:甜茶苷提取率(%)=88.72+1.42A+2.95B+0.87C-1.19AB-0.26AC-0.36BC-7.13A2-6.03B2-5.21C2。

表4 水提甜茶苷的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model for the extraction of rubusoside

表3 提取甜茶苷響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis for the extraction of rubusoside

根據(jù)回歸模型作出兩因素交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖,可以直觀的考察因素之間的交互作用對(duì)甜茶苷提取率的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度和液料比對(duì)甜茶苷提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot showing the interactive effects of temperature and liquid-material ratio on the extraction of rubusoside

響應(yīng)曲面坡度的陡峭程度反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度,等高線的密集形狀反映各因素交互作用的顯著程度。由圖4可知,液料比與提取溫度的響應(yīng)面坡度均陡峭,說(shuō)明液料比與提取溫度對(duì)甜茶苷的提取率的影響均顯著(p<0.05),液料比的響應(yīng)面曲線坡度與提取溫度相比略陡,表明液料比對(duì)甜茶苷提取率的影響高于提取溫度;等高線呈橢圓形,表明液料比與提取溫度的交互作用顯著,上述結(jié)論與p值結(jié)果一致。

2.4.2 甜茶多酚的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及方差分析 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表5。應(yīng)用Design-Expert.8.0.6軟件對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,得到回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表6;同時(shí)擬合得到的二次回歸方程為:甜茶多酚提取率(%)=78.26+1.67A+5.21B+0.57C+1.07AB+0.77AC+0.15BC-5.20A2-0.047B2+0.60C2。

表6 水提甜茶多酚的回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of regression model for the extraction of polyphenols in sweet tea

表5 提取甜茶多酚響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 5 Experimental design and results for response surface analysis for the extraction of polyphenols in sweet tea

由表6可知,模型F=2.80,p=0.0003<0.05,說(shuō)明模型顯著;失擬項(xiàng)p=0.2083>0.05為不顯著,說(shuō)明響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)擬合回歸方程具有顯著意義,該模型可以用于預(yù)測(cè)甜茶多酚的提取過(guò)程。表中一次項(xiàng)A達(dá)到顯著水平(p<0.05)、B達(dá)到極顯著水平(p<0.01),二次項(xiàng)A2達(dá)到極顯著水平(p<0.01),C、B2、C2、AB、AC和BC對(duì)甜茶多酚提取率的影響不顯著(p>0.05)。由F值可知,三種因素對(duì)甜茶多酚提取率的影響次序?yàn)锽液料比>A提取溫度>C提取時(shí)間。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn),回歸模型預(yù)測(cè)的甜茶苷水提工藝的最佳條件為:提取溫度71.57 ℃,液料比為26.17∶1 mL/g,提取時(shí)間為30.73 min。此條件下得到的甜茶苷提取率理論上可達(dá)89.15%?？紤]到實(shí)際操作的可行性,實(shí)際工藝條件為:提取溫度72 ℃,液料比為26∶1 mL/g,提取時(shí)間為31 min。在此條件下,甜茶苷提取率為89.16%(RSD=0.71%,n=3),與模型預(yù)測(cè)值相符。此時(shí),甜茶多酚的提取率可達(dá)80.66%(RSD=1.45%,n=3)。

回歸模型預(yù)測(cè)的甜茶多酚水提的最佳條件為:提取溫度57.40 ℃,液料比為24.98∶1 mL/g,提取時(shí)間為36.31 min。此條件下得到的甜茶多酚提取率理論上可達(dá)84.57%?？紤]到實(shí)際操作的可行性,改進(jìn)工藝條件為:提取溫度57 ℃,液料比為25∶1 mL/g,提取時(shí)間為36 min。在此條件下,甜茶多酚提取率為85.32%(RSD=1.42%,n=3),與預(yù)測(cè)值基本吻合,說(shuō)明優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案可行。此時(shí),甜茶苷的提取率可達(dá)83.58%(RSD=2.24%,n=3)。

綜上,考慮到甜茶的綜合利用及能源的節(jié)約,選取提取溫度為57 ℃,液料比為25∶1 mL/g,提取時(shí)間36 min作為提取甜茶活性物質(zhì)的條件。

3 結(jié)論

本文利用甜茶干葉為原料,同時(shí)提取甜茶苷和甜茶多酚,采用響應(yīng)曲面法對(duì)甜茶苷和甜茶多酚的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。確定了單獨(dú)提取甜茶苷的最佳條件為:提取溫度72 ℃,液料比為26∶1 mL/g,提取時(shí)間為31 min,此條件下甜茶苷提取率達(dá)89.16%(RSD=0.71%,n=3),甜茶多酚提取率可達(dá)80.66%(RSD=1.45%,n=3)。單獨(dú)提取甜茶多酚的最佳條件為:提取溫度57 ℃,液料比為25∶1 mL/g,提取時(shí)間為36 min,此條件下甜茶多酚提取率達(dá)85.32%(RSD=1.42%,n=3),甜茶苷提取率達(dá)83.58%(RSD=2.24%,n=3)。從甜茶資源的綜合利用角度及能源的節(jié)約考慮,選擇后者作為提取參數(shù)。本文通過(guò)分別建立數(shù)學(xué)模型,模型均呈現(xiàn)顯著性,具有很好的預(yù)測(cè)性,為甜茶葉深加工和綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。