甘草超濾液中甘草酸的絡(luò)合萃取研究

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(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)作為藥食兼用品種,其性味甘平,歸心、肺、脾、胃經(jīng),具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效[1]。甘草酸是甘草中的主要有效成分之一[2]?，F(xiàn)代研究證實(shí)甘草酸具有抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗癌、保肝等多種作用[3]。此外甘草酸還是天然甜味劑,其甜度為蔗糖的200～300倍,可廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品、卷煙等行業(yè),應(yīng)用非常廣泛[4-5]。

目前通常采用水浸提,經(jīng)酸沉得甘草酸粗品,再用重結(jié)晶、大孔樹脂吸附等方法純化甘草酸的生產(chǎn)工藝[6]。該工藝周期長(zhǎng)、純化過(guò)程復(fù)雜,成本高,而且甘草酸得率低,浪費(fèi)藥材資源。針對(duì)上述問(wèn)題,本文將超濾作為前置技術(shù),處理甘草水提取液,再采用絡(luò)合萃取技術(shù)萃取分離甘草超濾液中的甘草酸。

絡(luò)合萃取技術(shù)分離極性有機(jī)物稀溶液的實(shí)施關(guān)鍵為絡(luò)合萃取體系的選定,主要包括絡(luò)合劑、稀釋劑選擇及混合絡(luò)合萃取劑組成研究等內(nèi)容。本文以前期課題組在研究甘草水提取液超濾工藝的基礎(chǔ)上[7],擬通過(guò)改變混合絡(luò)合萃取劑組成(絡(luò)合劑、稀釋劑種類)及各組分的體積分?jǐn)?shù),研究萃取劑組成對(duì)甘草超濾液中甘草酸絡(luò)合萃取效果的影響,為采用超濾-絡(luò)合萃取技術(shù)制備較高純度甘草酸提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草藥材 蘭州市黃河藥材市場(chǎng);甘草酸銨對(duì)照品(批號(hào)110731-201619)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào)111610-201607) 中國(guó)食品藥品檢定研究院;磷酸三丁酯(TBP) 煙臺(tái)市雙雙化工有限公司;三烷基氧化磷(TRPO) 溧陽(yáng)市凱信化工有限公司;磺化煤油 廣東正茂石化有限公司;石油醚 天津市進(jìn)豐化工有限公司；乙腈 國(guó)產(chǎn)色譜純;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Agilent-1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;ABT100-5M電子天平 德國(guó)KERN公司;MX-RL-Pro LCD數(shù)控旋轉(zhuǎn)混勻儀 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司;DD-5M 湘儀離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;SJM陶瓷超濾設(shè)備超濾膜(50 nm) 合肥世杰膜工程有限公司;BDS HYPERSIL-C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm) 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;AKRY-UP-1816型超純水機(jī) 成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甘草的提取 稱取一定量甘草藥材(已切片,厚度2～4 mm),采用普通加熱回流提取法,每次用藥材質(zhì)量8倍量的0.75%(V/V)的氨水提取1 h,重復(fù)提取3次,合并提取液。放置過(guò)夜(12 h)后取上清液,剩余藥液經(jīng)3 000 r/min常溫離心15 min,收集上清液,合并上清液,在孔徑50 nm、壓力0.12 MPa、溫度25 ℃的條件下用無(wú)機(jī)陶瓷膜超濾,得甘草超濾液,置搪瓷方盤水浴(94 ℃)濃縮至甘草生藥量為0.2 g/mL,冷卻至室溫,備用[7]。

1.2.2 甘草超濾液中甘草酸及甘草苷的萃取 取10 mL 1.2.1中得到的甘草超濾液于50 mL離心管中,再加入10 mL按比例配好的絡(luò)合萃取劑,將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上常溫萃取12 h(25 r/min),取出,常溫離心10 min(4000 r/min),取1 mL下層萃余液于50 mL容量瓶中,用70%乙醇定容。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 不同稀釋劑對(duì)甘草酸萃取效果的影響 根據(jù)稀釋劑的物理、化學(xué)特性,本文選擇惰性溶劑磺化煤油、非極性溶劑石油醚作為稀釋劑。以甘草酸的萃取率和甘草酸與甘草苷的分離率為指標(biāo),分別以TRPO和TBP為絡(luò)合劑,與各稀釋劑構(gòu)成二元混合萃取劑對(duì)甘草超濾液進(jìn)行萃取。在一定濃度范圍內(nèi),絡(luò)合劑濃度越高越有利于生成絡(luò)合物,但超過(guò)該濃度范圍會(huì)形成中間相[6,9]。為避免中間相的產(chǎn)生,結(jié)合文獻(xiàn)和甘草超濾液自身特性,先將絡(luò)合劑與稀釋劑按10%(V/V)絡(luò)合劑+90%(V/V)稀釋劑的比例混合,按1.2.2中方法制備樣品并進(jìn)行測(cè)定分離率及萃取率,考察稀釋劑種類對(duì)萃取效果的影響。

1.2.3.2 不同絡(luò)合劑對(duì)甘草酸萃取效果的影響 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇磺化煤油為稀釋劑,分別與不同濃度(10%、20%、30%、40%、50%、60%,V/V)的TBP和不同濃度(5%、10%、15%,V/V)的TRPO構(gòu)成二元混合萃取劑,對(duì)甘草超濾液進(jìn)行萃取。按1.2.2中方法制備樣品并進(jìn)行測(cè)定,考察絡(luò)合劑種類和濃度對(duì)甘草酸萃取效果的影響。

1.2.4 三元絡(luò)合萃取劑對(duì)甘草酸萃取率的影響 為了進(jìn)一步提高甘草酸的萃取率,將TRPO+TBP+磺化煤油構(gòu)建為三元絡(luò)合萃取劑,以甘草酸的萃取率為指標(biāo),通過(guò)析因?qū)嶒?yàn)考察TBP、TRPO在絡(luò)合萃取甘草酸時(shí)是否具有協(xié)同作用。將TBP和TRPO的濃度確定為析因?qū)嶒?yàn)的兩個(gè)因素,每個(gè)因素取3個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以期優(yōu)選出最佳的混合萃取劑。實(shí)驗(yàn)因素、水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 析因?qū)嶒?yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of factorial experiment

1.2.5 甘草酸和甘草苷的含量測(cè)定

1.2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取甘草酸銨和甘草苷對(duì)照品適量,精密稱量,加70%乙醇制成含甘草酸銨0.216 μg/μL、甘草苷0.0225 μg/μL的混合對(duì)照品溶液,備用[8]。

1.2.5.2 甘草超濾液供試品溶液的制備 精密量取1.2.1中得到的甘草超濾液1 mL于50 mL容量瓶中,加70%乙醇定容,搖勻,備用。

1.2.5.3 色譜條件 色譜柱為BDS HYPERSIL-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);進(jìn)樣量10 μL;以乙腈為流動(dòng)相A,以0.05%(V/V)磷酸溶液為流動(dòng)相B,按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;流速1 mL/min;柱溫26 ℃;測(cè)定波長(zhǎng)237 nm[8]。

表2 梯度洗脫表Table 2 The table of gradient elution

1.2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 分別精密吸取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL混合對(duì)照品溶液,注入高效液相色譜儀測(cè)定,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)作回歸曲線,得甘草酸回歸方程:Y=140.5X-24.746,R2=0.9999,線性范圍0.216～4.320 μg;甘草苷回歸方程:Y=35.121X+18.267,R2=1,線性范圍0.0225～0.45 μg。

1.2.5.5 甘草超濾液樣品定量測(cè)定 將1.2.5.2中方法制備的甘草超濾液樣品按1.2.5.3中條件進(jìn)行測(cè)定,并按回歸方程計(jì)算甘草酸和甘草苷量。

1.2.6 萃取率與分離率的計(jì)算

萃取率(%)=100-[萃余液中甘草酸量(甘草苷量)/甘草超濾液中甘草酸量(甘草苷量)]×100

分離率(%)=|甘草酸萃取率(%)-甘草苷萃取率(%)|

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同稀釋劑對(duì)甘草酸萃取效果的影響 由表3和表4可知,以磺化煤油為稀釋劑時(shí),絡(luò)合劑TRPO、TBP對(duì)甘草酸的萃取率均高于以石油醚為稀釋劑時(shí)的萃取率,同時(shí)以磺化煤油為稀釋劑時(shí)，甘草苷與甘草酸的分離率也高于石油醚。因此選擇磺化煤油作為稀釋劑。

表3 不同稀釋劑對(duì)TRPO萃取甘草酸的影響Table 3 Effects of different diluents on the extraction of glycyrrhizic acid by TRPO

表4 不同稀釋劑對(duì)TBP萃取甘草酸的影響Table 4 Effects of different diluents on the extraction of glycyrrhizic acid by TBP

2.1.2 不同絡(luò)合劑對(duì)甘草酸萃取效果的影響 由表5可知,10%～50%(V/V)濃度范圍內(nèi)隨著TBP濃度增加,甘草酸的萃取率呈上升趨勢(shì),但60% TBP對(duì)甘草酸的萃取率低于50% TBP。這可能是由于TBP濃度增大時(shí),萃取相粘度隨之增大,當(dāng)TBP 濃度達(dá)到60%左右時(shí),開始出現(xiàn)乳化現(xiàn)象所致,故選擇60% TBP作為下一步析因?qū)嶒?yàn)第一個(gè)因素的最大水平。由表6可知,5% TRPO對(duì)甘草酸的萃取率最高,但在5%～15% TRPO范圍內(nèi),隨著體系中TRPO的濃度增大,甘草酸的萃取率逐漸降低,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)TRPO的濃度梯度為3%、6%、9%。另外,在表5中,50% TBP+50%磺化煤油對(duì)甘草酸的萃取率最高,為30.73%,但甘草苷與甘草酸的分離率僅為10.43%;而在表6中,15% TRPO+85%磺化煤油對(duì)甘草苷的萃取率高達(dá)99.59%,但對(duì)甘草酸的萃取率僅有8.28%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TBP與TRPO各有優(yōu)勢(shì),TBP更適用于萃取甘草酸,而TRPO更適用于萃取甘草苷,若既要絡(luò)合萃取出超濾液中的甘草酸,又要實(shí)現(xiàn)與甘草苷的分離,則需二者配合使用,因此TBP和TRPO均有作為絡(luò)合劑的可能。

表5 TBP濃度對(duì)甘草酸萃取及分離效果的影響Table 5 Effects of TBP concentration on extraction and separation of glycyrrhizic acid

表6 TRPO濃度對(duì)甘草酸萃取及分離效果的影響Table 6 Effects of TRPO concentration on extraction and separation of glycyrrhizic acid

2.2 三元絡(luò)合萃取劑對(duì)甘草酸萃取率的影響

由表7可知,對(duì)超濾液中甘草酸的萃取率最高的萃取劑組合為2/2組,即6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油,最高萃取率為32.98%±0.04%,高于兩元絡(luò)合萃取劑。由表8分析結(jié)果可看出,TRPO濃度、TBP濃度、以及TRPO與TBP的交互作用都對(duì)甘草酸的萃取率有極顯著影響(p<0.01)。

表8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表Table 8 Variance analysis table of experimental results

表7 不同萃取劑組合對(duì)甘草酸萃取率的影響(n=3)Table 7 Effects of different extractant combinations on extraction yield of glycyrrhizic acid(n=3)

因此,本文擬用兩步萃取法制備甘草酸,即先用對(duì)甘草苷的單次萃取率和甘草酸與甘草苷的分離率均最高的15% TRPO+85%磺化煤油作為萃取相,萃取甘草超濾液中的甘草苷,將甘草酸盡可能多的留在水相中,再用三元混合萃取劑6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油萃取已經(jīng)移取甘草苷的萃余水液,得到純度較高的甘草酸。

3 討論

3.1 在甘草酸的絡(luò)合萃取中超濾甘草提取液的必要性

甘草水提取液中含有大量水溶性淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等大分子雜質(zhì),這些水溶性大分子的存在會(huì)顯著增大料液粘度,而粘度是油水乳化的主要影響因素之一,萃取過(guò)程中油水乳化程度隨粘度的增大而增加[10]。同時(shí)由于甘草酸有微弱的表面活性作用,因此在對(duì)甘草水提取液的萃取過(guò)程中乳化現(xiàn)象非常嚴(yán)重。乳化現(xiàn)象是將萃取技術(shù)用于甘草水提取液中甘草酸分離時(shí)必須解決的問(wèn)題。

本文將超濾作為絡(luò)合萃取的前處理技術(shù),在絡(luò)合萃取前將甘草水提取液進(jìn)行超濾處理,在目標(biāo)成分得到有效保留的情況下,可以除去其中的大量水溶性大分子雜質(zhì),使料液粘度顯著降低,乳化現(xiàn)象大為改善,使甘草酸的絡(luò)合萃取過(guò)程可以順利進(jìn)行,絡(luò)合萃取劑的使用濃度顯著提高[6],有效提高了絡(luò)合萃取效率。

3.2 絡(luò)合萃取法萃取分離甘草酸的優(yōu)勢(shì)

甘草酸是一種在水中溶解性較好的極性較大有機(jī)物,要將它和甘草水提取液中極性接近的黃酮類物質(zhì)分開,如采用傳統(tǒng)的物理萃取需要采用極性較大的有機(jī)溶劑,不但有機(jī)溶劑在水中的溶解損失較大,而且很難達(dá)到精確分離。

絡(luò)合萃取是一種化學(xué)萃取的方法,其基本原理是根據(jù)待分離溶質(zhì)的Lewis酸堿性質(zhì),選擇合適的絡(luò)合萃取劑與極性較大有機(jī)物形成絡(luò)合物,并在有機(jī)相中得到富集,絡(luò)合萃取過(guò)程中的化學(xué)反應(yīng)有較高的選擇性[11]。富集于有機(jī)相的絡(luò)合物可在反萃取過(guò)程中分解重新得到極性較大有機(jī)物,達(dá)到分離純化的目的。在萃取過(guò)程中水相中為極性有機(jī)物,有機(jī)相中為該有機(jī)物的絡(luò)合物,為兩種不同物質(zhì)。萃取過(guò)程的推動(dòng)力是待分離成分和絡(luò)合劑間的化學(xué)鍵能,因此即使料液中待分離成分濃度很低,絡(luò)合萃取的分配系數(shù)也會(huì)很大[12]。該技術(shù)對(duì)于分離極性較大的有機(jī)物稀溶液具有很高的應(yīng)用價(jià)值。采用絡(luò)合萃取不但有利于甘草酸和黃酮類物質(zhì)的高效分離,而且通過(guò)反萃取可實(shí)現(xiàn)絡(luò)合萃取劑的循環(huán)使用,有效解決物理萃取方法萃取劑損失大、產(chǎn)品溶劑殘留、工藝成本高等技術(shù)缺陷。

3.3 稀釋劑的選擇

稀釋劑是絡(luò)合萃取劑的主要組成成分,具有調(diào)節(jié)混合萃取劑粘度、密度及界面張力等參數(shù),降低混合萃取劑萃水量的作用,因此稀釋劑的選擇是研究絡(luò)合萃取工藝的主要內(nèi)容[13]。本文分別以磺化煤油和石油醚為稀釋劑,考察了不同類型稀釋劑對(duì)甘草超濾液中甘草酸萃取效果的影響,發(fā)現(xiàn)以磺化煤油為稀釋劑時(shí),對(duì)甘草酸的萃取率以及甘草苷與甘草酸的分離率均高于石油醚。

絡(luò)合萃取效率與混合萃取劑對(duì)萃合物的溶解能力正相關(guān)[13]。本文研究表明以磺化煤油為稀釋劑對(duì)甘草酸有較好的萃取效率,說(shuō)明磺化煤油不但可以有效降低絡(luò)合萃取劑的粘度,減小傳質(zhì)阻力,而且對(duì)甘草酸萃合物有很好的溶解能力。此外磺化煤油在水中不溶,以其為稀釋劑組成的混合絡(luò)合萃取劑的水溶性小,萃取過(guò)程中溶劑流失少,通過(guò)萃取劑再生循環(huán)使用可有效降低生產(chǎn)成本。

3.4 三元絡(luò)合萃取劑的協(xié)同效應(yīng)

在以TBP為絡(luò)合萃取劑，磺化煤油為稀釋劑時(shí),在TBP的使用濃度50%時(shí)甘草酸的萃取率30.73%。由析因設(shè)計(jì)得到的6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油對(duì)甘草酸的單次萃取率為32.98%±0.04%。顯示三元絡(luò)合萃取劑對(duì)甘草酸的萃取有協(xié)同作用,可在一定程度上提高萃取效率。

4 結(jié)論

選用的兩種絡(luò)合萃取劑對(duì)甘草酸和甘草苷均有一定的絡(luò)合萃取作用,為制備純度較高的甘草酸,擬用兩步萃取法,由于15% TRPO+85%磺化煤油的混合萃取液對(duì)甘草超濾液中甘草苷的單次萃取率為99.59%,甘草酸與甘草苷的分離率為91.31%;故可先用該混合萃取劑萃取甘草超濾液中的甘草苷,將甘草酸留在水相中。再用實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出的三元混合萃取劑6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油萃取已經(jīng)移取甘草苷的萃余水液,得到純度較高的甘草酸。該兩步絡(luò)合萃取法既能得到甘草酸,同時(shí)還可收集到副產(chǎn)品甘草苷。