雙歧桿菌復(fù)合微膠囊的工藝優(yōu)化、表征及功能特性分析

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(廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣東廣州 511436)

雙歧桿菌是人體腸道中的益生菌,其制品的益生作用比單純服用雙歧因子制劑效果更好[1],但活菌數(shù)需超過(guò)106CFU/g或106CFU/mL才能有效地發(fā)揮作用。然而,雙歧桿菌對(duì)氧、酸性環(huán)境極為敏感,保持活性較困難[2]。此外,胃液中較低的pH和氧化還原電位、小腸中的高濃度膽汁溶液都會(huì)使其活性大幅度降低[3]。微膠囊技術(shù)是一種能保持益生菌存活率的方法,可提高益生菌在加工、儲(chǔ)藏及通過(guò)人體消化道期間對(duì)氧、胃酸和膽汁的耐受性[4]。微膠囊壁材的選擇對(duì)于微膠囊產(chǎn)品的性能起決定性作用,在制備益生菌微膠囊過(guò)程中使用單一壁材,難以達(dá)到微膠囊化的所有要求。研究表明使用復(fù)合壁材包埋雙歧桿菌可增加其存活率,在微膠囊制備過(guò)程中具有特定優(yōu)勢(shì)。因此,深入研究復(fù)合微膠囊對(duì)益生菌的保護(hù)作用十分必要。

已有研究證實(shí),以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材,制備出的雙歧桿菌微膠囊，在胃酸耐受性和穩(wěn)定性上較游離的菌液均有所提高[5]。也有學(xué)者采用羧甲基殼聚糖和海藻酸鹽為壁材，制備長(zhǎng)雙歧桿菌BIOMA5920微膠囊,結(jié)果顯示,用復(fù)合壁材比用單一壁材制備的微膠囊在包埋率、腸溶性等方面更好[6]。這些研究表明復(fù)合壁材用于益生菌微膠囊的制備,具有包埋率高,腸溶性好,穩(wěn)定性高,耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)。但現(xiàn)有復(fù)合壁材制備的微膠囊仍存在定向釋放困難、菌體成活率低、粒徑均一性較差等不足[7],亟需探索具有提高活菌率、定向釋放特性、良好均一性的新型復(fù)合壁材。膳食纖維根據(jù)溶解性的不同可分為水不溶性膳食纖維和水溶性膳食纖維。水不溶性膳食纖維的主要成分是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素,在胃中不能被消化吸收,而在腸道里面可被菌群降解利用,可作為益生菌的微膠囊壁材,有望實(shí)現(xiàn)益生菌在腸道的定向釋放[8-9]。此外,膳食纖維中的多糖成分可充當(dāng)益生菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),起到培養(yǎng)基的作用,提高活菌率。因此,水不溶性膳食纖維作為益生菌微膠囊的壁材具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但單獨(dú)使用水不溶性膳食纖維凝膠性能較差,結(jié)合海藻酸鈉和卡拉膠作為微膠囊的壁材,可增加其包埋率和腸溶性。

針對(duì)上述問(wèn)題,本文擬采用香蕉皮水不溶性膳食纖維-海藻酸鈉-卡拉膠為復(fù)合壁材包埋雙歧桿菌BB12,同時(shí)在芯材中添加低聚果糖作為益生元,進(jìn)一步提高益生菌的存活率。此外,本研究還將優(yōu)化微膠囊化工藝,并對(duì)該微膠囊的結(jié)構(gòu)表征和在消化道環(huán)境中的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,以期最大限度地保持菌體的生物活性,為工業(yè)化生產(chǎn)活菌制劑提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動(dòng)物雙歧桿菌BB12(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBB-12) 丹麥科漢森公司;香蕉 廣州南沙;海藻酸鈉(Sodium alginate) 河南優(yōu)元生物科技有限公司;卡拉膠(Carrageenan) 滕州市香凝生物工程有限公司;低聚果糖(Fructo oligosaccharides) 山東欣鼎生物科技有限公司;CaCl2廣州化學(xué)試劑;NaCl 廣州化學(xué)試劑廠;PBS粉劑 廣州杰特偉生物科技有限公司;膽鹽 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;胃蛋白酶(10000 U/g)、胰蛋白酶(250 U/g) 美國(guó)Sigma公司;MRS肉湯、MRS瓊脂 廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

FD-1A-80真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;D2F-6050電熱烘干箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SPX-250B生化培養(yǎng)箱 上海銳豐儀器儀表有限公司;ZHJH-C1106B生物潔凈工作臺(tái) 上海智域分析儀器制造有限公司;ME204E電子分析天平 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;mLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本SANYO公司;Allegra x-22R離心機(jī) 美國(guó)BECKMAN COULTER公司;F30400209磁力攪拌器 意大利VELP SCIENTIFICA公司;FE20/EL20pH計(jì) 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香蕉皮中水不溶性膳食纖維的制備 參考張豐等[10]的方法進(jìn)行制備。將香蕉皮真空冷凍干燥后,使用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩(40目)。稱取香蕉皮干粉放入帶蓋的瓶子中,加入12%的NaOH溶液,料液比為2∶50 g/mL。將瓶子放入超聲清洗儀中超聲30 min后,放入61 ℃的水浴鍋中水浴90 min。取出后,在瓶中滴加鹽酸(5 mol/L)調(diào)pH至7.0左右。將瓶中液體倒入離心管中,離心管放入離心機(jī)(5000 r/min,6 min),室溫下進(jìn)行離心處理。倒掉濾液,在濾渣中加入2～3倍體積的無(wú)水乙醇脫色3 h后,抽濾,用生理鹽水沖洗3次,取出濾渣,放置在錫紙內(nèi),放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥(50 ℃,4～5 h),直至恒重,即得香蕉皮水不溶性膳食纖維。

1.2.2 雙歧桿菌微膠囊的制備

1.2.2.1 菌種活化 將121 ℃滅菌15 min后的MRS液體培養(yǎng)基冷卻,然后在培養(yǎng)基中按0.1%(v/v)接種保存于-20 ℃下的雙歧桿菌BB12,37 ℃恒溫培養(yǎng)24～36 h,進(jìn)行活化。

1.2.2.2 菌懸液制備 將已活化至第三代的雙歧桿菌菌液在4 ℃下離心(4000 r/min,10 min)后,除去上清液,收集菌泥,再加入與培養(yǎng)液等體積(30 mL)的生理鹽水混合均勻后備用。同時(shí),進(jìn)行梯度稀釋,按平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌懸液的活菌數(shù),活菌數(shù)用CFU/mL表示。

1.2.2.3 復(fù)合微膠囊的制備 稱取一定質(zhì)量的海藻酸鈉和卡拉膠,加入5 mL pH6.5的無(wú)菌PBS緩沖液,置于75～85 ℃水浴溶解。然后加入一定質(zhì)量的香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液,備用。將一定濃度的低聚果糖溶液和雙歧桿菌菌懸液以1∶1 (v/v)的比例混合,此為芯材溶液。取制備好的芯材溶液5 mL,加入等體積的壁材溶液,混合均勻。用10 mL注射器將混合液噴射到60 mL 5% CaCl2溶液中,用磁力攪拌器攪拌一定時(shí)間,形成膠囊,過(guò)濾,并用蒸餾水將膠囊沖洗3次,即得濕膠囊。將濕膠囊置于-80 ℃冷凍干燥24～48 h,可制得凍干微膠囊。

1.2.3 微膠囊包埋產(chǎn)率的測(cè)定 取1 g濕膠囊,加入9 mL pH為7.4的解囊液[PBS 緩沖液(pH7.4)][11]中,37 ℃振蕩完全崩解后,用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,稀釋至10-3,使活菌數(shù)在30～300 CFU/mL范圍內(nèi)。取0.1 mL稀釋過(guò)的菌懸液滴于MRS固體培養(yǎng)基上,用涂布器涂布均勻,密封,編號(hào),倒置,在37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48～72 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)[12]。

包埋產(chǎn)率(%)=G1×V1×M/(N0×V0×M0)×100

式中:G1:1 mL解囊液中的雙歧桿菌活菌數(shù)(CFU/mL);V1:解囊液的總體積(mL);N0:包埋前單位體積原菌液中的活菌數(shù)(CFU/mL);V0:制備微膠囊所用原菌液的體積(mL);M:所得微膠囊的總重量(g);M0:稱取微膠囊的重量(g)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以包埋產(chǎn)率為指標(biāo),分別研究香蕉皮水不溶性膳食纖維含量、海藻酸鈉濃度、卡拉膠濃度、低聚果糖濃度及攪拌時(shí)間對(duì)雙歧桿菌BB12微膠囊包埋效果的影響。

1.2.4.1 香蕉皮水不溶性膳食纖維含量 稱取海藻酸鈉和卡拉膠,溶于5 mL pH6.5的無(wú)菌PBS緩沖液,然后分別加入不同質(zhì)量的香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,所得混合液中海藻酸鈉和卡拉膠的濃度為2%和3%,水不溶性膳食纖維的含量分別為0、15%、30%、45%、60%,紫外燈照射30 min,制成壁材溶液。將雙歧桿菌菌懸液和濃度為5%的低聚果糖溶液以1∶1 (v/v)的比例混合,制成芯材溶液。將制備好的芯材溶液5 mL,加入等體積的壁材溶液,混合均勻。用10 mL注射器將混合液噴射到60 mL 5% CaCl2溶液中,用磁力攪拌器攪拌30 min,形成膠囊,并過(guò)濾,用蒸餾水將膠囊沖洗3次,即得濕膠囊。

1.2.4.2 海藻酸鈉濃度 稱取卡拉膠和海藻酸鈉,溶于5 mL pH6.5的無(wú)菌PBS緩沖液,然后加入香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液。所得混合液中卡拉膠濃度為3%,水不溶性膳食纖維含量15%,海藻酸鈉的含量分別為2%、3%、4%、5%、6%。其余步驟同1.2.4.1。

1.2.4.3 卡拉膠濃度 稱取海藻酸鈉和卡拉膠,溶于5 mL pH6.5的無(wú)菌PBS緩沖液,然后加入香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液。所得混合液中卡拉膠濃度分別為2%、3%、4%、5%、6%,水不溶性膳食纖維含量15%,海藻酸鈉的含量為2%。其余步驟同1.2.4.1。

1.2.4.4 低聚果糖濃度 稱取海藻酸鈉和卡拉膠,溶于5 mL pH6.5的無(wú)菌PBS緩沖液,然后加入香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液。所得混合液中海藻酸鈉和卡拉膠的濃度為2%和3%,水不溶性膳食纖維含量15%。將濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的低聚果糖溶液和雙歧桿菌菌懸液以1∶1 (v/v)的比例混合,此為芯材溶液。其余步驟同1.2.4.1。

1.2.4.5 攪拌時(shí)間 稱取海藻酸鈉和卡拉膠,溶于5 mL pH6.5的無(wú)菌PBS緩沖液,然后加入香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液。所得混合液中海藻酸鈉和卡拉膠的濃度為2%和3%,水不溶性膳食纖維含量15%。將雙歧桿菌菌懸液和濃度為5%的低聚果糖溶液以1∶1 (v/v)的比例混合,制成芯材溶液。取制備好的芯材溶液5 mL,加入等體積的壁材溶液,混合均勻。用10 mL注射器將混合液噴射到60 mL 5% CaCl2溶液中,然后用磁力攪拌器分別攪拌10、20、30、40、50 min,形成膠囊,過(guò)濾,并用蒸餾水將膠囊沖洗3次,即得濕膠囊。

1.2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 最陡爬坡試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)值變化梯度為爬坡方向。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)得到的各單因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)及變化方向,使響應(yīng)值快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,采用5 因素3水平的響應(yīng)面分析法,以包埋產(chǎn)率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)響應(yīng)面組合,對(duì)雙歧桿菌BB12微膠囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.7 微膠囊的表征分析

1.2.7.1 紅外光譜 稱取最優(yōu)條件下制備的凍干微膠囊、芯材、壁材單一成分及其混合物各約1 g,分別與100 mg KBr混合,在研缽中充分研磨后,壓片,置于4000～400 cm-1內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描(分辨率為4 cm-1)。

1.2.7.2 掃描電鏡 用導(dǎo)電膠將最優(yōu)條件下制備的樣品粉末黏在SEM載物臺(tái)上,樣品表面噴金,30 min后將載物臺(tái)置于SEM掃描電鏡中進(jìn)行掃描(加速電壓為20 kV,電流為75 mA)。

1.2.8 雙歧桿菌微膠囊的功能特性

1.2.8.1 耐胃酸實(shí)驗(yàn) 配制人工模擬胃液[13]:取16.4 mL鹽酸(5 mol/L)于燒杯中,加入約800 mL蒸餾水稀釋,加入10 g胃蛋白酶,攪勻后加水定容至1000 mL。參照馮超[14]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取最優(yōu)條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g和1.2.2.2得到的未包埋的雙歧桿菌原菌液1 mL,分別置于9 mL人工模擬胃液中,37 ℃恒溫?fù)u晃0、1、2 h后,棄去胃液。收集濕微膠囊,用解囊液徹底崩解后,制成菌懸液,計(jì)數(shù)。

1.2.8.2 耐膽鹽實(shí)驗(yàn) 將濃度為0%、0.3%、0.4%、0.5%的膽酸鈉溶液,121 ℃滅菌。參照肖仔君等[15]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取最優(yōu)條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g和1.2.2.2得到的未包埋的雙歧桿菌原菌液1 mL,分別置于9 mL上述溶液,37 ℃水浴3 h后,棄去膽汁。收集微膠囊,用解囊液徹底崩解后,制成菌懸液,計(jì)數(shù)。

1.2.8.3 腸道釋放性 配制人工模擬腸液[13]:取6.8 g磷酸二氫鉀加500 mL蒸餾水溶解后,用0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8;另取10 g胰蛋白酶加適量水使之溶解,將兩液混合后,加水定容至1000 mL即得。參照郝瑩等[16]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。稱取最優(yōu)條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g,置于9 mL人工模擬腸液中,放在恒溫?fù)u床中進(jìn)行處理,將恒溫?fù)u床的溫度調(diào)節(jié)為37 ℃,搖速設(shè)置成210 r/min,0、20、40、60 min后,直接吸取3～4 mL溶液,測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的透光率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 香蕉皮水不溶性膳食纖維含量對(duì)微膠囊包埋產(chǎn)率的影響 由圖1可知,未添加香蕉皮水不溶性膳食纖維的微膠囊包埋產(chǎn)率較低。而添加香蕉皮水不溶性膳食纖維的包埋產(chǎn)率升高，當(dāng)膳食纖維含量為45%時(shí)包埋產(chǎn)率達(dá)到最大值,為66.46%。香蕉皮水不溶性膳食纖維含量過(guò)低時(shí),微膠囊的囊壁厚度不均勻,穩(wěn)定性較差,使得微膠囊容易破裂,芯材易滲漏在固化液中。當(dāng)香蕉皮水不溶性膳食纖維含量超過(guò)45%并繼續(xù)增加時(shí),壁材流動(dòng)性變差,不利于形成均一穩(wěn)定的雙歧桿菌微膠囊。為優(yōu)化實(shí)驗(yàn),香蕉皮水不溶性膳食纖維最佳含量為45%。

圖1 香蕉皮水不溶性膳食纖維含量對(duì)雙歧桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率的影響 Fig.1 Effects of content of water-insoluble dietary fiber in banana peel on embedding yield of Bifidobacteria microcapsules

2.1.2 海藻酸鈉濃度對(duì)微膠囊包埋產(chǎn)率的影響 由圖2可知,在海藻酸鈉濃度在2%～3%時(shí),微膠囊的包埋產(chǎn)率會(huì)隨著海藻酸鈉濃度的增加而增大。當(dāng)海藻酸鈉濃度達(dá)到3%時(shí),包埋產(chǎn)率達(dá)到最大值65.39%。若海藻酸鈉濃度繼續(xù)增大,包埋產(chǎn)率則明顯降低。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是海藻酸鈉的濃度對(duì)形成微膠囊的機(jī)械強(qiáng)度有一定影響。海藻酸鈉濃度過(guò)低時(shí),三種壁材混合所形成的壁膜過(guò)薄,機(jī)械強(qiáng)度低,從而影響了包埋效果。海藻酸鈉濃度合適時(shí),可與固化液中的Ca2+結(jié)合充分,膜結(jié)構(gòu)致密穩(wěn)定[15]。但海藻酸鈉濃度過(guò)高時(shí),其黏度增大,微膠囊容易聚集成團(tuán),黏連較嚴(yán)重,導(dǎo)致溶液擠出困難。綜合考慮各種因素,海藻酸鈉濃度選擇3%較合適。

圖2 海藻酸鈉濃度對(duì)雙歧桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率的影響Fig.2 Effects of concentration of sodium alginate on embedding yield of Bifidobacterium microcapsules

2.1.3 卡拉膠濃度對(duì)微膠囊包埋產(chǎn)率的影響 由圖3可知,當(dāng)卡拉膠濃度在2%～4%范圍內(nèi),微膠囊的包埋產(chǎn)率與卡拉膠濃度呈正相關(guān)。這是由于卡拉膠濃度較低時(shí),其硫酸基團(tuán)所攜帶的負(fù)電荷較少[17],與溶液中其他物質(zhì)所攜帶的正電荷結(jié)合不充分,導(dǎo)致微膠囊的密度不夠。當(dāng)卡拉膠濃度超過(guò)4%并持續(xù)增加時(shí),包埋產(chǎn)率稍微降低，是因?yàn)榭ɡz在復(fù)合壁材中的比例增加,黏度增大,會(huì)給微膠囊的擠出過(guò)程帶來(lái)一定的困難。當(dāng)卡拉膠濃度從5%繼續(xù)增大,包埋產(chǎn)率隨之變大,但此時(shí)卡拉膠與其他壁材配比失衡,微膠囊擠壓到固化液中并不能形成完整的球形。考慮到微膠囊的形態(tài),卡拉膠濃度不宜過(guò)大,建議選擇濃度為4%～6%。

圖3 卡拉膠濃度對(duì)雙歧桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of concentration of carrageenan on embedding yield of Bifidobacterium microcapsules

2.1.4 低聚果糖濃度對(duì)微膠囊包埋產(chǎn)率的影響 由圖4可知,當(dāng)?shù)途酃菨舛葟?%～3%時(shí),其包埋產(chǎn)率與低聚果糖濃度呈正相關(guān)。當(dāng)?shù)途酃菨舛葹?%時(shí),微膠囊的包埋產(chǎn)率達(dá)到最大值60.10%。此時(shí),壁材和芯材所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密程度較高,在微膠囊中的雙歧桿菌活菌不易泄露出來(lái)。低聚果糖濃度繼續(xù)增加,包埋產(chǎn)率呈下降的趨勢(shì)。可能是由于低聚果糖濃度過(guò)高,改變了整個(gè)體系的濃度;導(dǎo)致滲透壓升高,使細(xì)菌活性受到影響,進(jìn)而影響包埋產(chǎn)率。綜合考慮各種因素后,低聚果糖濃度選擇3%為宜。

圖4 低聚果糖濃度對(duì)雙歧桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of concentration of fructo oligosaccharide on embedding yield of Bifidobacteria microcapsules

2.1.5 攪拌時(shí)間對(duì)微膠囊包埋產(chǎn)率的影響 由圖5可知,當(dāng)攪拌時(shí)間從10～30 min時(shí),雙歧桿菌微膠囊的包埋產(chǎn)率與攪拌時(shí)間呈正相關(guān)。原因可能是攪拌時(shí)間過(guò)短,混合溶液正負(fù)電荷作用不完全[18]。隨著攪拌時(shí)間的增加,微膠囊的交聯(lián)度增大,大量雙歧桿菌被包埋。當(dāng)攪拌時(shí)間為30 min時(shí),包埋產(chǎn)率達(dá)到最大值64.12%。但此時(shí)攪拌時(shí)間繼續(xù)增加,微膠囊的包埋產(chǎn)率又會(huì)變小。這是因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)的攪拌時(shí)間會(huì)破壞復(fù)合壁材形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),微膠囊密度發(fā)生變化,雙歧桿菌重新泄露到溶液中?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中節(jié)能的需要,選擇攪拌時(shí)間30 min為宜。

圖5 攪拌時(shí)間對(duì)雙歧桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率的影響Fig.5 Effects of mixing time on embedding yield of Bifidobacteria microcapsules

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知,第1、2、3、4、5步爬坡實(shí)驗(yàn)的包埋率分別為42.56%、48.79%、68.79%、55.02%、53.55%。在爬坡實(shí)驗(yàn)的第三步附近時(shí),微膠囊的包埋產(chǎn)率較高。因此可選擇第三步實(shí)驗(yàn)中的因素水平作為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn),即香蕉皮水不溶性膳食纖維含量45.00%、海藻酸鈉濃度3.00%、卡拉膠濃度5.50%、攪拌時(shí)間30.00 min、低聚果糖濃度3.00%。

表2 雙歧桿菌微膠囊最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design of the steepest climbing of Bifidobacteria microcapsules

2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立與分析 由表3可知,響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)共有46個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。應(yīng)用軟件Design Expert 10.0.1對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析,可得到制備雙歧桿菌微膠囊的擬合方程為:

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface

Y=77.00+7.57A-2.58B+1.63C-11.30D+1.84E-11.48AB-13.40AC-5.70AD-11.53AE+9.27BC+3.43BD+2.36BE+6.14CD+1.43CE-8.40DE-19.07A2-22.40B2-12.83C2-7.32D2-16.45E2+8.72A2B+8.09A2C+17.04A2D-14.55A2E-3.47AB2-12.21AC2-9.29AD2-12.24B2C+14.81B2D-5.66B2E-8.79BC2-5.43BD2+20.78C2D-11.71C2E

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 4 Significance checklist of regression equation coefficients

2.3.2 兩因素間交互作用分析 圖6是因素間顯著和極顯著交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖,顯示了香蕉皮水不溶性膳食纖維含量、海藻酸鈉濃度、卡拉膠濃度、低聚果糖濃度和攪拌時(shí)間中任意三個(gè)因素取零水平時(shí),其余兩個(gè)因素對(duì)微膠囊包埋產(chǎn)率的影響。

圖6 交互項(xiàng)的兩個(gè)變量對(duì)包埋產(chǎn)率影響的等高線與響應(yīng)曲面圖Fig.6 Contour lines and response surface maps of effects of two variables of the interaction term on embedding yield

響應(yīng)面能直觀反映各因素間的影響大小,曲面越陡峭,兩因素之間交互作用越強(qiáng)[20]。由圖6可知,A與B、A與C、A與E、B與C的響應(yīng)面坡度較陡,說(shuō)明交互作用較強(qiáng),其他兩因素之間交互作用則較微弱,幾乎可以忽略不計(jì)。

2.3.3 最佳包埋條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè),可得到雙歧桿菌BB12微膠囊的最佳包埋工藝為:香蕉皮水不溶性膳食纖維含量45.69%、海藻酸鈉濃度2.72%、卡拉膠5.61%、低聚果糖2.60%、攪拌時(shí)間31.13 min。此時(shí)微膠囊的理論包埋產(chǎn)率為73.06%。為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果是否與真實(shí)情況相一致,進(jìn)行了近似驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。最佳工藝條件修正為香蕉皮水不溶性膳食纖維含量46.00%、海藻酸鈉濃度2.70%、卡拉膠5.60%、低聚果糖2.60%、攪拌時(shí)間31.00 min。在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn),平均值為73.02%±0.54%,與微膠囊理論包埋產(chǎn)率的相差百分率為0.05%,表明最佳工藝條件的穩(wěn)定性較好。

2.4 微膠囊表征與分析

2.4.1 紅外光譜分析 由圖7a可知,香蕉水不溶性膳食纖維在3454 cm-1處附近有寬而強(qiáng)的吸收峰,屬于分子間或分子內(nèi)的O-H伸縮振動(dòng)峰;2851 cm-1處附近的吸收峰是糖環(huán)或支鏈上C-H(-CH2)伸縮振動(dòng)峰;1592 cm-1的吸收鋒屬于苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)峰;1156和1078 cm-1處附近的吸收峰屬于纖維素和半纖維素結(jié)構(gòu)中兩種C-O伸縮振動(dòng)峰,即C-O-H和糖環(huán)上C-O-C[21];894 cm-1處的吸收峰則是由β構(gòu)型糖苷鍵引起的吸收峰,這些吸收峰都屬于糖類的特征吸收峰[22]。由圖7b可知,海藻酸鈉在3277 cm-1處的吸收峰歸屬為-OH基的伸縮振動(dòng)峰,1607和1419 cm-1處的吸收峰分別屬于海藻酸鈉的COO-的對(duì)稱伸縮振動(dòng)和不對(duì)稱伸縮振動(dòng)[23]。由圖7c可知,卡拉膠在2926 cm-1有強(qiáng)的吸收帶,是因C-H2的存在,1232 cm-1左右為硫酸酯基中S=O伸縮振動(dòng)峰,930 cm-1為3,6-內(nèi)醚半乳糖上的SO4(直立鍵)吸收峰,在848 cm-1為C4位硫酸根的吸收峰[24]。比較水不溶性膳食纖維、海藻酸鈉與卡拉膠及壁材混合物的紅外圖譜(見(jiàn)圖7d)可發(fā)現(xiàn),壁材仍然可見(jiàn)水不溶性膳食纖維、海藻酸鈉與卡拉膠的振動(dòng)吸收,但1000～1600 cm-1范圍波形與壁材單一成分不完全重合,1419、1232、1156 cm-1處吸收峰分別左移至1415、1222、1154,2995～3791 cm-1變?yōu)槠交膶挿?可能與壁材成分之間形成了化學(xué)鍵有關(guān)。

圖7 壁材單一成分、壁材、芯材和微膠囊的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of single composition,wall,core and microcapsules注:a:香蕉皮水不溶性膳食纖維,b:海藻酸鈉,c:卡拉膠,d:壁材,e:芯材,f:微膠囊。

由圖7e可知,芯材(雙歧桿菌含蛋白質(zhì))在3000～3600 cm-1范圍有吸收峰,屬于形成氫鍵締合的-OH伸縮振動(dòng)吸收峰與-NH的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而增寬的多重吸收峰;在1653 cm-1處的吸收峰,是蛋白質(zhì)的酰胺I帶吸收峰,C=O的伸縮振動(dòng);1541 cm-1為蛋白質(zhì)的酰胺II帶吸收峰,是-NH的彎曲振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng);1240～1245 cm-1是蛋白質(zhì)的酰胺III帶的吸收峰,由C-N的伸縮振動(dòng)和N-H的彎曲振動(dòng)引起的。酰胺I帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶是蛋白質(zhì)的特征吸收峰[25]。由圖7(f)可知,微膠囊也具有3000～3600 cm-1多重吸收峰和蛋白質(zhì)的特征吸收峰;在1155～1439 cm-1范圍吸收減弱,這可能是因?yàn)锽B12進(jìn)入壁材形成的空腔后振動(dòng)受限導(dǎo)致[26]。紅外光譜吸收的變化說(shuō)明雙歧桿菌包埋在復(fù)合壁材中形成微膠囊。

2.4.2 掃描電鏡觀察 擠壓法制備的濕微膠囊,呈圓球狀,直徑為1～2 mm。濕膠囊經(jīng)冷凍干燥后,用掃描電鏡觀察。由圖8可看出,制得的雙歧桿菌微膠囊粒徑適中。整體上看,依然呈顆粒狀,但邊緣不是很工整。在較高的放大倍數(shù)下,微膠囊內(nèi)部疏松多孔,可能是由于雙歧桿菌微膠囊在真空冷凍干燥的過(guò)程中水分散失,造成微膠囊表面和內(nèi)部的空洞較多[27]。

圖8 微膠囊掃描電鏡照片F(xiàn)ig.8 SEM micrographs of microcapsule

2.5 微膠囊功能特性分析

2.5.1 耐胃酸性質(zhì) 由表5可知,微膠囊在未經(jīng)人工胃液浸泡前,活菌數(shù)是9.09×106CFU/g;經(jīng)人工胃液浸泡2 h后,活菌數(shù)下降到0.77×106CFU/g,僅下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)。而雙歧桿菌菌液的活菌數(shù)在人工胃液浸泡前后則發(fā)生巨大變化,活菌數(shù)從43.00×106CFU/g下降到0.00 CFU/g,表明人工胃液對(duì)未微膠囊化的雙歧桿菌有很強(qiáng)的損害作用,而雙歧桿菌微膠囊卻能較好地抵御胃酸。這是因?yàn)殡p歧桿菌周圍的凝膠體系為菌體提供了一道屏障。

表5 在模擬胃液中菌液和微膠囊活菌數(shù)的變化Table 5 Changes in the number of viable bacteria of bacterial fluid and microcapsules in simulated gastric fluid

海藻酸鈉是一種pH敏感性凝膠,在低pH下較為穩(wěn)定[28];卡拉膠線性大分子內(nèi)的結(jié)構(gòu)排列及其大分子鏈節(jié)的荷電性,使得它具有強(qiáng)烈的反應(yīng)性、可形成凝膠及高粘度溶液等優(yōu)異性能[29];水不溶性膳食纖維則可以起到增強(qiáng)壁材的作用[30]。三者復(fù)合形成的壁材可減少胃酸對(duì)菌體的傷害,使得微膠囊化的雙歧桿菌對(duì)胃酸的耐受力增強(qiáng)。

2.5.2 耐膽鹽性質(zhì) 由圖9可知,隨著膽鹽濃度的提高,菌液和微膠囊的活菌數(shù)均下降,表明膽鹽溶液對(duì)雙歧桿菌有很強(qiáng)的損害作用。但微膠囊化處理的活菌數(shù)始終遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組,下降幅度較小?？梢?jiàn),微囊化的雙歧桿菌對(duì)人工膽汁的耐受力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未包埋保護(hù)的雙歧桿菌。這與壁材的作用分不開(kāi),壁材可以增大膽鹽溶液穿越的阻力,從而避免了膽鹽與菌體直接接觸。

圖9 不同濃度膽汁下菌液和微膠囊活菌數(shù)的變化 Fig.9 Changes in the number of viable bacteria of bacterial fluid and microcapsules in different concentrations of bile

2.5.3 腸道釋放性 微膠囊經(jīng)裂解,釋放出雙歧桿菌,會(huì)導(dǎo)致溶液內(nèi)物質(zhì)增多,透光率下降。由圖10可知,微膠囊在人工模擬腸液中處理的前20 min,透光率迅速下降。20 min后,透光率基本穩(wěn)定,說(shuō)明大部分濕微膠囊在腸液中20～60 min即可完全崩解,有較好的腸溶性。這是因?yàn)楹Ｔ逅徕}是依賴于Ca2+形成的可逆性凝膠,解囊液中存在與Ca2+結(jié)合能力更強(qiáng)的陰離子PO3-。一旦加入解囊液,Ca2+便會(huì)與這種陰離子結(jié)合,使凝膠體系破裂[31]。

圖10 在人工模擬腸液中微膠囊雙歧桿菌的溶出 Fig.10 Dissolution of microcapsule Bifidobacterium in artificial simulated intestinal fluid

3 結(jié)論

以香蕉水不溶性膳食纖維-海藻酸鈉-卡拉膠為復(fù)合壁材,添加低聚果糖作為保護(hù)劑,成功制備了雙歧桿菌微膠囊,其最佳工藝條件為香蕉皮水不溶性膳食纖維含量46.00%、海藻酸鈉濃度2.70%、卡拉膠濃度5.60%、低聚果糖濃度2.60%、攪拌時(shí)間31.00 min,此條件下,微膠囊的包埋產(chǎn)率為73.02%。影響包埋產(chǎn)率的因素重要性排序?yàn)镈(低聚果糖濃度)>A(膳食纖維含量)>B(海藻酸鈉濃度)>E(攪拌時(shí)間)>C(卡拉膠濃度)。紅外光譜分析表明,壁材各成分之間可能發(fā)生了作用,形成了新的物質(zhì),雙歧桿菌包埋在復(fù)合壁材中并形成微膠囊;掃描電鏡顯示微膠囊呈粒狀,內(nèi)部疏松多孔。在模擬消化的實(shí)驗(yàn)中,微膠囊化的雙歧桿菌BB12在人工胃液、膽汁中的耐受性均高于未包埋保護(hù)的益生菌;微膠囊在人工腸液處理20 min后,透光率基本穩(wěn)定,溶出性能良好。本研究能較好地解決雙歧桿菌抵抗不良環(huán)境的能力差的問(wèn)題,增強(qiáng)雙歧桿菌的存活性能,可為雙歧桿菌微膠囊在食品中的應(yīng)用及開(kāi)發(fā)新型益生菌產(chǎn)品奠定基礎(chǔ),且具有積極的生產(chǎn)實(shí)際意義。