植物乳桿菌HNU082抗生素抗性與相關(guān)基因的關(guān)系

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(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

抗生素(Antibiotics)是一類用于抑制或殺死存在于人和動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌的天然、半合成或合成化合物[1],使用后暴露于環(huán)境中將誘導(dǎo)抗性基因產(chǎn)生和傳播,嚴(yán)重威脅生態(tài)平衡及人類健康[2-3]。抗生素抗性(Antibiotic Resistance)指微生物可耐受抗生素的抑制和致死作用進(jìn)而存活和繁殖[4],按來(lái)源可分為兩種:一是源于抗生素生產(chǎn)菌的先天性抗性,以隨機(jī)突變或表達(dá)潛在抗性基因等方式使細(xì)菌體內(nèi)基因組上的抗性基因原型、準(zhǔn)抗性基因或潛在抗性基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[5-6];二是獲得性抗性,由抗生素或抗性基因的接觸和交流所導(dǎo)致?？股乜剐曰?Antibiotic Resistance Genes,ARGs)是抗性傳播和發(fā)展的媒介,先天性ARGs經(jīng)后代垂直轉(zhuǎn)移,獲得性ARGs通過(guò)食物鏈水平轉(zhuǎn)移[7-9]?？剐曰虻乃睫D(zhuǎn)移是群落中菌株產(chǎn)生多重耐藥性[10]的一個(gè)重要原因。

就益生菌而言,抗生素抗性有利有弊。畜禽養(yǎng)殖業(yè)常將益生菌作為飼料添加劑與抗生素配伍使用[11],以避免抗生素的某些副作用,提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。Zhang等[12]在肉雞日糧中添加枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),結(jié)果表明飼喂Bacillussubtilis的肉雞在第22～35 d,和整個(gè)研究期間分別有5.3%和3.3%的體重增加。濫用抗生素導(dǎo)致腸道菌群失調(diào),提高病原菌入侵風(fēng)險(xiǎn);益生菌調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)機(jī)體免疫健康[13]。兩者相互作用時(shí),抗生素抗性有助于菌株免于抗生素抑制的不利影響,提高在胃腸道中的存活率,長(zhǎng)期定植以發(fā)揮預(yù)期作用。菌株抗性研究有助于益生菌資源的安全、合理及有效使用?？股卦卺t(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛使用引發(fā)了對(duì)生物安全性的嚴(yán)重關(guān)切[14],如今抗生素抗性問(wèn)題也是乳酸菌研究的重要內(nèi)容。1999年,Netherwood等[15]提出腸道細(xì)菌之間可發(fā)生抗性基因的水平轉(zhuǎn)移。Shalini等[16]對(duì)乳酸菌抗性的綜述認(rèn)為,較多的乳酸菌菌株含有抗性基因,包括發(fā)酵乳中的乳酸菌,它們?cè)谌梭w腸道中大量存在,直接接觸到腸道微生物群落。因此抗性基因可能水平轉(zhuǎn)移到腸道內(nèi)的病原體使得攜帶抗性基因的益生菌成為潛在致病菌,導(dǎo)致抗生素交叉抗性[17]。

Lactobacillusplantarum屬于乳酸桿菌,常見于乳制品、果蔬、肉類及人體腸道中,因優(yōu)良發(fā)酵特性及多種益生作用被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、食品發(fā)酵及醫(yī)療保健等領(lǐng)域[18-19]。L.plantarumHNU082分離自我國(guó)海南省黎族聚居地自然發(fā)酵食品魚茶,其基因組已完全測(cè)序(登錄號(hào):PRJCA000348),編碼豐富的碳水化合物活性酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)有助于菌株競(jìng)爭(zhēng)腸道中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并且該微生物的生理學(xué)和功能方面特性已在體外和體內(nèi)充分表征,具有益生菌發(fā)育的巨大潛力[20]。

本文模擬不同抗生素的環(huán)境選擇壓力[21]對(duì)菌株存活及生長(zhǎng)情況的影響,同時(shí)在分子水平上挖掘相關(guān)抗性基因數(shù)據(jù),分析了抗性基因與抗性程度之間的關(guān)系,旨在為益生菌的體外安全評(píng)估和合理應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.plantarumHNU082 分離自海南魚茶;MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;鹽酸克林霉素、紅霉素、頭孢唑啉鈉、氯霉素、鹽酸土霉素、諾氟沙星、羅紅霉素、鹽酸四環(huán)素、利福平、羧芐青霉素鈉、萬(wàn)古霉素 北京索萊寶科技有限公司;無(wú)水乙醇、乙酸鈉 分析純,廣州化學(xué)試劑廠;甲醇、異丙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、苯酚、氯仿、異戊醇 分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;含二甲苯菁和溴酚藍(lán)雙染料6×DNA loading buffer 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;核酸染料(Goldview) 美國(guó)AMERCO公司;瓊脂糖 北京天根生化科技有限公司;瓊脂 上海百賽生物技術(shù)有限公司;蛋白酶K、SDS、TBE緩沖液、Tris-HCL、CTAB、EDTA 上海吉至生化科技有限公司。

HN-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;85-1恒溫磁力攪拌器 常州澳華儀器有限公司;SW-TFG12通風(fēng)柜 蘇州蘇凈集團(tuán)公司;DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠;DP72雙目生物顯微鏡 OLYMPUS;Hettich32R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)ZENTRIFUGEN;Cell Biosciences凝膠成像分析系統(tǒng) Alphalmager MN;FA-1604電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;FST-RO精密型超純水機(jī) 普利菲爾應(yīng)用材料有限公司;BIO-DL移液器 上?？推潓?shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司;G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司;XH-D漩渦混合器 江蘇康健醫(yī)療用品有限公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;THZ-100B恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV759紫外可見分光光度計(jì) 上海奧譜勒儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 將凍存的L.plantarumHNU082菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)36 h待培養(yǎng)液明顯渾濁或菌體沉淀后,于-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取 采用CTAB法和液氮凍融法[22]提取菌株基因組總DNA。取1 mL菌體培養(yǎng)物于滅菌EP管中,離心(4 ℃,8000 r/min,3 min)棄上清,收集菌體;加入500 μL TE緩沖液(pH8.0),振勻后置液氮中速凍1 min取出,放入65 ℃水浴融化,重復(fù)凍融3次;加入80 μL SDS(10%,w/v)和10 μL蛋白酶K(20 mg/mL),37 ℃水浴4 h后取出;加入100 μL NaCl溶液(20 mg/mL)和80 μL CTAB溶液(10 mol/L),混勻后65 ℃水浴20 min,得到DNA粗提取液;加入750 μL苯酚/氯仿/異戊醇溶液(25∶24∶1,v/v),輕輕顛倒搖勻1 min,靜置2 min,重復(fù)4次,至無(wú)氣泡;離心(4 ℃,12000 r/min,10 min)后取上清至滅菌EP管中;加入500 μL氯仿/異戊醇溶液(24∶1,v/v),混勻1 min,靜置2 min,重復(fù)3次;離心(4 ℃,12000 r/min,10 min)后取上清,加入500 μL預(yù)冷異丙醇和50 μL乙酸鈉(3 mol/L),混勻,于-20 ℃靜置30 min后離心(4 ℃,12000 r/min,10 min),棄上清得DNA沉淀并用乙醇(70%,v/v)洗滌;烘箱干燥10 min取出,用30 μL TE溶液回溶置于-20 ℃保存。

1.2.3 DNA純度檢測(cè)及抗性基因檢測(cè) 取DNA提取物與6×DNA loading buffer各2 μL混合,加樣于預(yù)先制備的1%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔,電壓100 V,0.5×TBE電泳液條件下電泳20 min,電泳后于紫外燈下觀察,對(duì)所提DNA的濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司全基因組測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)各基因出現(xiàn)次數(shù),并由此計(jì)算基因的出現(xiàn)頻率(抗性基因出現(xiàn)次數(shù)/抗性基因出現(xiàn)總數(shù))以及各類抗生素相關(guān)抗性基因出現(xiàn)次數(shù)占抗性基因出現(xiàn)總數(shù)的百分比(某類抗生素相關(guān)基因出現(xiàn)次數(shù)之和/所有抗性基因出現(xiàn)總數(shù))。

1.2.4 植物乳桿菌抗生素抗性的檢測(cè)

1.2.4.1 抗生素配制 根據(jù)抗性基因檢測(cè)結(jié)果,結(jié)合抗生素的分類[23]及應(yīng)用情況,選取各抗生素大類中極具代表性的11種常用抗生素(見1.1)進(jìn)行篩選?？股噩F(xiàn)配現(xiàn)用,分別稱取各抗生素0.128 g,于3 mL溶劑(表1)中溶解并用MRS液體培養(yǎng)基定容至50 mL,制成2560 μg/mL母液。準(zhǔn)確移取4 mL培養(yǎng)基于試管中,121 ℃滅菌后冷卻至室溫。將抗生素母液逐步稀釋,取4 mL培養(yǎng)基與4 mL抗生素母液(2560 μg/mL)混合均勻,制得1280 μg/mL溶液;取4 mL培養(yǎng)基與4 mL濃度為1280 μg/mL的抗生素溶液混合均勻,制得640 μg/mL溶液;同理稀釋為12個(gè)濃度梯度:1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL。所有試管溶液體積均為4 mL,每個(gè)濃度10支試管。

表1 抗生素配制所用溶劑Table 1 Solvents for antibiotic preparation

1.2.4.2 吸光度檢測(cè) 分別取200 μL菌液接種于各含抗生素的培養(yǎng)基及陰性對(duì)照管(不含抗生素的培養(yǎng)基)中,震蕩均勻,陰性對(duì)照管接種混勻后于-20 ℃凍存,備用,實(shí)驗(yàn)管于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)16 h。從培養(yǎng)0 h起,及此后每4 h取出實(shí)驗(yàn)管測(cè)定600 nm時(shí)吸光度,以溶解震勻的陰性對(duì)照管校零。共獲得0、4、8、12、16 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光值,繪制菌體的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)曲線。

1.2.4.3 抗生素MIC篩選 根據(jù)吸光值的變化所反映菌體的生長(zhǎng)情況,選取吸光度值從近似零突增至某值的明顯變化范圍內(nèi)所含的全部抗生素濃度,作為抗生素抑制濃度驗(yàn)證值。按上述各濃度梯度抗生素溶液的配制法,制得比驗(yàn)證濃度高一個(gè)梯度的抗生素溶液各5 mL。另有若干含有5 mL瓊脂培養(yǎng)基的25 mL錐形瓶,滅菌備用。將各抗生素溶液分別迅速倒入各錐形瓶中,搖勻后分別迅速倒入培養(yǎng)皿,輕微晃動(dòng)避免產(chǎn)生氣泡。平板冷卻后,移取100 μLL.plantarumHNU082菌液涂布,于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h。觀察平板菌落生長(zhǎng)情況,尋找兩個(gè)相鄰驗(yàn)證值使得較低濃度下有試驗(yàn)菌生長(zhǎng)(PCR檢驗(yàn)),若其中較高的濃度下無(wú)試驗(yàn)菌生長(zhǎng),則該較高濃度為抗生素MIC。若首次選取的驗(yàn)證值不符合篩選條件,則據(jù)平板結(jié)果逐步放大驗(yàn)證值選取范圍,直到確定出菌株抗生素抗性與敏感性的臨界值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有抗生素各時(shí)間點(diǎn)下每個(gè)濃度2個(gè)平行,測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.0和Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株抗性基因檢測(cè)結(jié)果

全基因組測(cè)序結(jié)果表明,L.plantarumHNU082中存在9類抗生素的抗性基因,共12種(表2)?？剐曰驒z測(cè)總頻數(shù)為15次,其中l(wèi)mrD和macB基因分別出現(xiàn)2次和3次,其余基因各出現(xiàn)一次。各基因出現(xiàn)頻率大小有所不同,lmrD和macB分別為13.0%、20.0%,其余基因?yàn)?.7%。氟喹諾酮類、林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素相關(guān)基因檢測(cè)頻數(shù)占基因檢測(cè)總頻數(shù)的比例同為最高,達(dá)20.0%,其余均為6.7%。

表2 植物乳桿菌HNU082抗性基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 Resistance gene detection results of L.plantarum HNU082

2.2 菌株的抗生素抗性

2.2.1 抗生素培養(yǎng)菌株生長(zhǎng)曲線 菌株在各抗生素培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線(圖1),反映菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)和數(shù)量變化趨勢(shì),通過(guò)觀察在不同濃度抗生素條件下菌株生長(zhǎng)情況隨培養(yǎng)時(shí)間的變化,可確定菌株耐受與敏感界限,分析其抗性表達(dá)情況,從而對(duì)抗生素MIC范圍做出初步判斷;當(dāng)抗生素濃度較高時(shí),菌株數(shù)量幾乎不隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增加,即菌株的生長(zhǎng)繁殖受到抑制;而抗生素濃度降低至某一濃度時(shí),菌株數(shù)量開始呈現(xiàn)出上升趨勢(shì),即在該濃度下表現(xiàn)出抗性。由圖1可見,當(dāng)鹽酸克林霉素、紅霉素、頭孢唑啉鈉、氯霉素、鹽酸土霉素、羅紅霉素、鹽酸四環(huán)素以及羧芐青霉素鈉等8種抗生素的濃度分別降至20、10、5、5、10、10、10、5 μg/mL時(shí)菌株展現(xiàn)出良好生長(zhǎng)趨勢(shì),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)及抗生素濃度降低,菌體數(shù)量增長(zhǎng)愈加明顯;諾氟沙星和萬(wàn)古霉素濃度的變化對(duì)菌株的生長(zhǎng)幾乎不產(chǎn)生影響,1280 μg/mL條件下,隨培養(yǎng)時(shí)間的增加試驗(yàn)菌的數(shù)量不斷上升,即最大濃度仍不能抑制菌體生長(zhǎng)繁殖,MIC>1280 μg/mL;而利福平的抑制作用顯著,0.625 μg/mL條件下菌株仍無(wú)法良好生長(zhǎng),MIC<0.625 μg/mL。

圖1 菌體生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of the strain 注:A～K依次表示鹽酸克林霉素、紅霉素、頭孢唑啉鈉、氯霉素、鹽酸土霉素、諾氟沙星、羅紅霉素、鹽酸四環(huán)素、利福平、羧芐青霉素鈉、萬(wàn)古霉素。

2.2.2 抗生素MIC值的確定 根據(jù)吸光值曲線選定各抗生素平板驗(yàn)證濃度范圍(表3),結(jié)合驗(yàn)證結(jié)果(圖2、圖3)得到L.plantarumHNU082對(duì)11種抗生素的MIC(表4)。鹽酸克林霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、羅紅霉素MIC為20 μg/mL,氯霉素、頭孢唑啉鈉、羧芐青霉素鈉、紅霉素MIC為10 μg/mL,諾氟沙星和萬(wàn)古霉素在1280 μg/mL最大實(shí)驗(yàn)濃度下仍不能抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng),因此MIC>1280 μg/mL,同理利福平0.625 μg/mL最小濃度下試驗(yàn)菌仍被抑制,MIC<0.625 μg/mL。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,菌株對(duì)不同抗生素表現(xiàn)出不同的抗性特征。結(jié)合表1,紅霉素、羅紅霉素同是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,均與macB基因有關(guān),但二者M(jìn)IC卻不同,即菌株對(duì)受相同基因影響的同類抗生素的不同藥物,也表現(xiàn)出不同的抗性程度。MIC范圍內(nèi)的濃度值越小,則抗生素的抑制作用越明顯,菌株抗生素抗性越弱;相反,MIC值越大表示菌株抗生素抗性越強(qiáng)。

表3 抗生素抑制濃度驗(yàn)證范圍Table 3 Verification ranges of antibiotic inhibition concentration

圖2 抗生素抑制情況Fig.2 Antibiotic inhibition

圖3 抗生素耐受情況Fig.3 Antibiotic resistance

表4 各抗生素最小抑制濃度Table 4 MIC of antibiotics to L.plantarum HNU082

2.3 抗生素抗性與抗性基因的關(guān)系

抗生素MIC值反映菌株的抗生素抗性特征,根據(jù)菌株的抗性基因檢測(cè)結(jié)果,分析抗生素抗性與相應(yīng)抗性基因的關(guān)系:

萬(wàn)古霉素和諾氟沙星MIC>1280 μg/mL,菌株所表達(dá)的抗性最為明顯,萬(wàn)古霉素相關(guān)抗性基因mprF占所檢測(cè)基因的6.7%,而諾氟沙星相關(guān)抗性基因arlR、emeA、gyrB占所檢測(cè)基因的20.0%;此外,lmrC和lmrD與鹽酸克林霉素有關(guān),占所檢測(cè)基因的20.0%,但鹽酸克林霉素MIC為20 μg/mL。菌株對(duì)上述抗生素均表達(dá)出了一定的抗性,基因檢測(cè)頻率相同時(shí),抗性特征卻不同,因此抗性程度與相關(guān)抗性基因所占比重之間無(wú)直接聯(lián)系。

在菌株L.plantarumHNU082中,鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素抗性與mepA有關(guān),MIC均為20 μg/mL;頭孢唑啉鈉和羧芐青霉素鈉抗性與pbp1a有關(guān),MIC均為10 μg/mL,而macB是紅霉素和羅紅霉素的相關(guān)抗性基因,紅霉素與羅紅霉素MIC分別為10、20 μg/mL,菌株對(duì)羅紅霉素的抗性強(qiáng)于紅霉素;因此對(duì)于受同一基因影響的不同抗生素,菌株的抗性特征也不相同,抗生素抗性因藥物不同存在差異,抗性基因不是決定抗性特征的絕對(duì)因素。

除上述抗生素外,菌株對(duì)與fexA相關(guān)的氯霉素也具有一定的抗性,而利福平的抑制作用極其明顯,菌株極不耐受,未表達(dá)出抗性。通常認(rèn)為抗性基因的存在與抗生素抗性的表達(dá)之間具有一定的聯(lián)系,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,并非所有的抗性基因均會(huì)表達(dá)出相應(yīng)的抗性。

3 討論

抗生素抗性表型和抗性基因之間并不存在絕對(duì)的相關(guān)性。一方面抗生素抗性是基因、移動(dòng)元件及其細(xì)菌宿主之間復(fù)雜相互作用的結(jié)果,同時(shí)伴隨著人類為控制細(xì)菌生長(zhǎng)而施加的強(qiáng)烈選擇壓力[24],這為本實(shí)驗(yàn)中菌株存在rpoB基因卻未體現(xiàn)出相應(yīng)抗性提供了合理解釋;另一方面先天性抗性菌株可能具有抗生素抗性表型而不含相應(yīng)抗性基因[25]。邵玉宇[26]在植物乳桿菌鏈霉素抗性基因的相關(guān)研究中提到,植物乳桿菌IMAU60045和IMAU80091均攜帶有aadA和ant(6)基因,但對(duì)鏈霉素表現(xiàn)出的耐藥性卻完全不同,該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)一致。通過(guò)不斷增加培養(yǎng)基中鏈霉素濃度進(jìn)行30 d傳代培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)IMAU60045的耐藥性增加了1024倍,所以在不同條件下,同一基因相關(guān)的抗性特征也會(huì)發(fā)生變化。某些關(guān)于抗性基因與抗生素抗性的相關(guān)研究還表明,一種抗性基因不僅是對(duì)一種特定藥物產(chǎn)生抗性,還能對(duì)其他結(jié)構(gòu)相似藥物存在抗性。不同類的抗生素可能有相同的作用位點(diǎn),這些位點(diǎn)如果被抗性基因修飾,就會(huì)出現(xiàn)交叉抗生素抗性。

有研究[27]報(bào)道,乳酸菌菌株的抗生素抗性存在種間特異性而不存在地區(qū)特異性,在同一種內(nèi),分離自不同地區(qū)的菌株的抗生素抗性的差異性較小;宋曉敏等[28]在綜述中對(duì)乳酸菌各屬針對(duì)不同抗生素的固有耐藥性進(jìn)行了總結(jié),乳桿菌屬具有抗性的相關(guān)抗生素包括肽類萬(wàn)古霉素、β-內(nèi)酰胺類頭孢噻、氟喹諾酮類氟哌酸和環(huán)丙沙星等,與本實(shí)驗(yàn)植物乳桿菌抗性基因的檢測(cè)結(jié)果相一致。因此本實(shí)驗(yàn)關(guān)于植物乳桿菌抗生素抗性及其相關(guān)基因的研究結(jié)果,理論上可為其他植物乳桿菌的相關(guān)研究給予參考。

本實(shí)驗(yàn)采用試管稀釋法、分光光度法并結(jié)合平板驗(yàn)證的方式對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行11種抗生素抗性的篩選,嚴(yán)格控制微生物培養(yǎng)條件和吸光度測(cè)定時(shí)間點(diǎn),以提高M(jìn)IC測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。但乳酸菌抗生素抗性的測(cè)定方法不唯一,許多研究者借鑒致病菌耐藥性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)與方法,如K-B紙片擴(kuò)散法、打孔法、牛津杯法、肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、E-test法[29-30],其中K-B紙片擴(kuò)散法、打孔法及牛津杯法以抑菌圈直徑為測(cè)定指標(biāo),但存在結(jié)果不穩(wěn)定及操作復(fù)雜等缺陷,而肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法及E-test法以MIC、MBC為測(cè)定指標(biāo),具有測(cè)定準(zhǔn)確重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),但工作量大,肉眼難以觀察。目前對(duì)乳酸菌耐藥性的研究逐漸受到人們的重視,對(duì)耐藥性檢測(cè)方法的研究也必不可少,需要調(diào)整、改良現(xiàn)有方法或采用多重方法結(jié)合,使其更適用于乳酸菌抗性檢測(cè)。

4 結(jié)論

HNU082在分子水平上存在arlR、emeA、fexA、lmrC、lmrD、macB、mepA、mprF、novA、pbp1a、gyrB、rpoB等抗生素抗性基因;鹽酸克林霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、羅紅霉素MIC為20 μg/mL,氯霉素、頭孢唑林鈉、紅霉素、羧芐青霉素鈉MIC為10 μg/mL,諾氟沙星、萬(wàn)古霉素MIC>1280 μg/mL,利福平MIC<0.625 μg/mL。在相關(guān)基因存在的情況下,菌株對(duì)鹽酸克林霉素、氯霉素、頭孢唑啉鈉、紅霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、羅紅霉素、羧芐青霉素鈉、諾氟沙星以及萬(wàn)古霉素等抗生素具有抗性,且對(duì)萬(wàn)古霉素和諾氟沙星的抗性最強(qiáng),但對(duì)利福平未表達(dá)出相應(yīng)抗性。菌株抗性程度與抗性基因所占比例大小無(wú)關(guān);針對(duì)包括受同一基因影響的不同藥物,菌株的抗性特征也各不相同;抗性基因的存在一定程度上反應(yīng)了菌株表達(dá)抗生素抗性的可能性,但抗生素抗性表型與抗性基因之間的關(guān)系并不絕對(duì);且抗生素抗性特征不是菌株的固定屬性,表型抗性將會(huì)受環(huán)境或其他條件的影響發(fā)生變化。