miRNA-21對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞順鉑化療增敏作用的研究

徐文莉，李康，王娟，林燕華，廖長(zhǎng)征，羅藝，張洪德

(深圳市龍崗中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳518116)

宮頸癌是女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球范圍惡性腫瘤中位居第四位，死亡率在20～39歲婦女中高居第二[1]。85%的宮頸癌病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家僅次于乳腺癌，我國(guó)子宮頸癌發(fā)病例數(shù)居世界國(guó)家第二位[2，3]，在我國(guó)女性生殖系統(tǒng)腫瘤中居首位[4]。目前的主要治療方式為手術(shù)、放療、化療和綜合治療[5]，其中化療在宮頸癌中的作用越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的重視，順鉑作為一線化療藥物用于治療宮頸癌，但部分患者在數(shù)個(gè)化療后，會(huì)產(chǎn)生耐藥從而影響療效導(dǎo)致高死亡率。因此，如何提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性及抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是目前宮頸癌治療中急需解決的問(wèn)題。研究顯示microRNAs在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性方面起著重要作用，miRNA－21是體內(nèi)重要的miRNAs之一，與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)。PTEN是一個(gè)抑癌基因，與細(xì)胞耐藥密切相關(guān)。但是在宮頸癌鉑類耐藥相關(guān)的研究目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究通過(guò)研究宮頸癌Hela/DDP在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中miRNA－21、PTEN的變化，探討miRNA－21及PTEN在逆轉(zhuǎn)宮頸癌Hela/DDP順鉑耐藥的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌親本細(xì)胞株Hela、耐藥細(xì)胞株Hela/DDP購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)，總RNA提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司，microRNA－21 siRNA 及陰性對(duì)照 （microRNA－21 neg）及U6引物購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，PI及 Anexin－FITC Apop Detecter kit試劑盒購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)BD公司，MTT試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司，DPP－順氯氨鉑 （美國(guó)sigma公司），MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），新生牛血清（美國(guó)Gibco公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司），PTEN抗體 （Abcam公司）。儀器：CO2培養(yǎng)箱購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Thermo公司，F(xiàn)ACSCanto流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，VIIA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 收集培養(yǎng) 24h后的Hela細(xì)胞、轉(zhuǎn)染24h后的Hela/DDP細(xì)胞，提取總RNA，Multiskan go酶標(biāo)分析儀檢測(cè)RNA純度及濃度，OD260/OD280 吸光度比值在 1.8－2.0 間滿足要求。以U6作為內(nèi)參，逆轉(zhuǎn)錄引物5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’ 反應(yīng)條件：95℃，5min；40個(gè) PCR 循環(huán) （95℃，10s；60℃，20s；72℃，20s；78℃，20s（收集熒光）；為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃（每5s升高 1℃）。 miR－21 5’TGCGTGTCGTGGAGTC3，反應(yīng)條件：95℃，5min；40 個(gè) PCR 循環(huán) （95℃，10s；60℃，20s；72℃，20s；78℃，20s（收集熒光））。 為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃（每5s升高1℃）。以U6為內(nèi)參照， 以 2－ΔΔCt法表示相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=（Ct實(shí)驗(yàn)－CtU6）實(shí)驗(yàn)組－（Ct對(duì)照－CtU6）對(duì)照組，CT 為每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后的宮頸癌Hela/DDP細(xì)胞分別接種于96孔板，約5×103個(gè)/孔，置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)24h后，向每孔細(xì)胞中加入DDP10μg/ml，培養(yǎng)72h后每孔加入180μl新鮮DMEM培養(yǎng)液，再加入20μl MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后，去除孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入DMSO 100μl，置搖床上低速振蕩 10min，使結(jié)晶物充分溶解。在Multiskan go酶標(biāo)儀570nm處測(cè)量各孔的吸光值。抑制率=（對(duì)照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值。

1.2.3 PI法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期 胰酶消化細(xì)胞后，收集細(xì)胞懸液離心，棄去上清液，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度在在1×105個(gè)/ml左右，加入碘化丙啶（PI），室溫避光30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡 細(xì)胞懸液處理同 1.2.3 步驟， 取 100μl細(xì)胞懸液與 7－AAD 5μl以及FITC AnnexinV 5μl混合充分混勻，置于室溫 （20～25℃） 避光 15min， 加 400μl 1×Binding Buffer在1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中 PTEN 蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后72h后的細(xì)胞，按照實(shí)際說(shuō)明書(shū)操作步驟，提取細(xì)胞中總蛋白，進(jìn)行聚丙酰胺凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，脫脂牛奶室溫封閉。2h后加入PTEN及β－Actin抗體，置于搖床4℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜后加入辣根過(guò)氧化酶抗體，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）x 表示，兩組間比較采用 t檢驗(yàn)，三組間兩兩比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人宮頸癌親本細(xì)胞Hela組、耐藥細(xì)胞株Hela/DDP組中miR－21表達(dá)差異 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：miR－21在Hela/DDP 組中表達(dá)量 4.251±0.018，明顯高于 Hela組1.000，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041）。 見(jiàn)圖 1。2.2 Real－timePCR 檢測(cè) Hela/DDP 組、 轉(zhuǎn)染后Hela/DDP siRNA組及Hela/DDP陰性組中miR－21表達(dá)差異。

細(xì)胞轉(zhuǎn)然后miRNA－21的表達(dá)，結(jié)果顯示miR－21－siRNA 組表達(dá)量為 1.501±0.013，均低于空白對(duì)照組 4.251±0.018，P=0.041 及 miR－21－neg 組4.321±0.011，P=0.039，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空白對(duì)照組與 miR－21－neg 組相比，P=0.752，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染前miR-21在Hela/DDP及Hela中的表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)染后miR-21在空白對(duì)照組、miR-21-neg組及miR-21-siRNA組中的表達(dá)

2.3 MTT檢測(cè)順鉑對(duì) siRNA及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染Hela/DDP和無(wú)轉(zhuǎn)染Hela/DDP的抑制率。

pSIREN－miR－21干擾載體抑制Hela/DDP細(xì)胞的增殖， 抑制率為 58.458.4±1.41 明顯高于空白對(duì) 照 組 34.2 ±1.11，P=0.038 和 miR －21 －neg 組35.3±1.32，P=0.039，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空白對(duì)照組和 miR－21－neg 組比較 P=0.862， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

圖3 DDP作用72h各組細(xì)胞的抑制率

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化 miR－21－siRNA組的G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高 70.12±2.17， 與空白對(duì)照組 46.51±2.14，P=0.035 及 miR－21－Neg 組 45.27±1.15，P=0.031，S 期及 G2/M 期細(xì)胞比例明顯下降 21.54±2.11 vs 32.58±3.17、33.27±2.19 P=0.042，P=0.039；8.31±1.15 vs 21.15±2.87、22.58±3.19 P=0.022，P=0.019。 miR－21－neg 組與空白對(duì)照組相比，不同細(xì)胞周期間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)圖 4。

圖4 DDP作用72h各組細(xì)胞周期

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞儀雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染Hela/DDP組凋亡率 32.62±3.25 高 于 空 白 對(duì) 照 組 10.85±0.27，P=0.014 和 miR－21－neg 組 11.14±0.21，P=0.019，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

2.5 PTEN蛋白的表達(dá) Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)siRNA轉(zhuǎn)染組PTEN蛋白表達(dá)量為0.53±0.08明顯升高空白對(duì)照組 0.28±0.02，P=0.025 和 miR－21 －neg 組 0.27 ±0.01，P=0.023。 見(jiàn)圖 6。

3 討論

圖5 DDP作用72h各組細(xì)胞的凋亡率

圖6 DDP作用72h各組細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)水平

順鉑臨床上常用的一種腫瘤化療藥物，可以有效地抑制腫瘤，但在治療過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)耐藥顯現(xiàn)，導(dǎo)致化療不佳。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥與MicroRNAs（miRNAs）的異常表達(dá)有關(guān)。 miRNAs是一種長(zhǎng)約22nt的非編碼小分子單鏈RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要角色，主要通過(guò)負(fù)向調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)在系列疾病病理生理過(guò)程中起著重要作用[6]。miR-21是體內(nèi)重要的miRNAs之一，通過(guò)靶向調(diào)控多種細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)抗細(xì)胞凋亡，不僅參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，而且與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)[7-10]。PTEN名為與張力蛋白同源，第10染色體丟失的硫酸酶基因，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶(DPS)活性的抑癌基因，能夠通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞周期、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和細(xì)胞耐藥等過(guò)程。前人實(shí)驗(yàn)證明，PTEN是miR-21的重要靶基因，miR-21通過(guò)PTEN調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，是宮頸癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。通過(guò)抑制Hela和caSki細(xì)胞中miR-21表達(dá)，能有效增加PTEN蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由于PTEN介導(dǎo)的PI3K/AKT通路是體內(nèi)重要的抗凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其異常激活能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞對(duì)鉑類耐藥的發(fā)生。因此，我們有理由假設(shè)，miRNA-21在逆轉(zhuǎn)宮頸癌耐藥方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果顯示，通過(guò)Hela/DDP細(xì)胞中的miRNA-21表達(dá)明顯高于親本細(xì)胞Hela，提示宮頸癌耐藥與miRNA-21表達(dá)上調(diào)有關(guān)。通過(guò)siRNA干預(yù)Hela/DDP細(xì)胞后，miRNA-21表達(dá)下調(diào)，給予順鉑作用后，MTT結(jié)果顯示Hela/DDP細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，流式細(xì)胞儀分析提示細(xì)胞凋亡率升高，同時(shí)影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，將細(xì)胞停滯于G0/G1期。從而證實(shí)下調(diào)Hela/DDP細(xì)胞miRNA-21后，對(duì)順鉑的敏感性增強(qiáng)，凋亡程度提高，逆轉(zhuǎn)了宮頸癌Hela/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。實(shí)驗(yàn)研究顯示，siRNA轉(zhuǎn)染Hela/DDP細(xì)胞并給于順鉑作用后，其PTEN蛋白表達(dá)明顯提高，細(xì)胞增殖活性下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11-14]。實(shí)驗(yàn)證明，PTEN是miRNA-21的重要靶基因，miRNA-21通過(guò)PTEN調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，是宮頸癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控機(jī)制[15，16]。本實(shí)驗(yàn)顯示抑制miRNA-21的表達(dá)，PTEN蛋白表達(dá)上調(diào)，提高對(duì)順鉑化療藥物的敏感性，提示miRNA-21調(diào)控PTNE蛋白在逆轉(zhuǎn)宮頸癌Hela/DDP細(xì)胞順鉑耐藥中同樣具有重要作用。

綜上所述，抑制Hela/DDP細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)，上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)水平，增加宮頸癌Hela/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡和敏感性。本研究為了解miRNA-21在逆轉(zhuǎn)宮頸癌Hela/DDP細(xì)胞化療藥物中的作用提供了新的見(jiàn)解，為提高宮頸癌藥物敏感性的靶向治療提供了重要依據(jù)。