0～6月齡不同排便頻率健康嬰兒的腸道菌群構(gòu)成分析

陳 嚴(yán)，高武紅，易烈致，吳 悠，曾云斌（廣東省深圳市南山區(qū)婦幼保健院兒童保健科，廣東深圳518000）

嬰兒糞便的次數(shù)和性質(zhì)常反映胃腸道的生理和病理狀態(tài)，故檢查糞便極為重要。嬰兒排便狀況與腸道微生態(tài)的關(guān)系密切，排便次數(shù)已成為兒保、兒科門診的常見(jiàn)主訴。本研究調(diào)查 0～6月齡健康嬰兒不同排便狀況的腸道菌群分布、多樣性并優(yōu)勢(shì)菌差異，分析排便頻率不同其對(duì)應(yīng)的腸道菌群構(gòu)成是否也不同，旨為臨床根據(jù)排便狀況有針對(duì)性地應(yīng)用不同種類的益生菌調(diào)整腸道微生態(tài)環(huán)境，改善嬰兒排便狀況提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

方便抽樣法選取兒?？崎T診體檢的 0～6月齡健康嬰兒，納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡＜ 6 月齡；⑵喂養(yǎng)方法為母乳喂養(yǎng)或混合喂養(yǎng)或人工喂養(yǎng)；⑶采樣前2周未服用過(guò)微生態(tài)制劑及抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴排除內(nèi)分泌或代謝性疾病及藥物引起的便秘， 6月齡內(nèi)有腦癱、甲低等嚴(yán)重疾病，父母有便秘史等；⑵排除器質(zhì)性疾?。合忍煨跃藿Y(jié)腸、肛門狹窄、肛門周圍炎癥、脊柱裂等疾病；⑶嚴(yán)重濕疹；⑷新生兒高膽紅素血癥；⑸近 2周大便次數(shù)、顏色、性狀明顯改變的兒童。

1.2 方法

1.2.1 問(wèn)卷調(diào)查 發(fā)放自行設(shè)計(jì)的“嬰兒糞便狀況問(wèn)卷”，內(nèi)容包括：嬰兒入院前 2周排便狀況(糞便次數(shù)/顏色/性狀)、喂養(yǎng)方式、分娩方式、出生史、月齡、體格生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)，母親飲食習(xí)慣、排便狀況，家族便秘史等。 25例家長(zhǎng)在明白問(wèn)卷內(nèi)容后在醫(yī)師指導(dǎo)下自填完成。

1.2.2 糞便標(biāo)本留取及測(cè)序 本次實(shí)驗(yàn)共收集糞便標(biāo)本 25份。新鮮糞便取樣后留取少量行糞便常規(guī)檢查，其余部分立即放進(jìn)－ 20℃冰箱保存，并集中收集到－ 80℃冰箱長(zhǎng)期保存。集中送華大基因公司進(jìn)行 16SRNA腸道菌群測(cè)序及物種分類與豐度分析。

1.2.3 對(duì)象分組與觀察指標(biāo) 按不同的排便頻率將25 例 研究對(duì)象分為 3 組 。 a組：(1/3～3)次/d，即排便頻率在 3d及以下排便 1次至 1d排便≤ 3次之間；b組：＞ 3次/d； c組：＜ 1 /3次/d，即 4d及以上排便1次。觀察 3組糞便腸道菌群的物種分類與豐度。

2 結(jié)果

2.1 問(wèn)卷調(diào)查分析

本次調(diào)查的 0～6月齡嬰兒為 2017年 6月－ 2018年4月來(lái)深圳市南山區(qū)婦幼保健院兒?？企w檢的健康嬰兒， 25例嬰兒出生體質(zhì)量、身長(zhǎng)及目前體格發(fā)育指標(biāo)均正常，其中男嬰 14例，女嬰 11例。分娩方式為順產(chǎn) 17例，剖宮產(chǎn) 8例。純母乳喂養(yǎng)的 10例，混合喂養(yǎng)的 12例，人工喂養(yǎng) 3例。居住地全部在城市，帶養(yǎng)人文化程度為大專及以下的 3例(占 12%)，文化程度為本科及以上的 22例(占 88%)。嬰兒父母均無(wú)便秘史。

共收集 25份糞便標(biāo)本，糞便常規(guī)均正常。糞便顏色黃色的 19例(占 76%)，綠色的 6例(占 24%)；糞便性狀為不成形便的 16例(占 6 4%)，成形軟便的 9例(占36%)。a 組12例 (占48 %)；b組 6例 (占24 %)；c 組7 例(占28%)。

2.2 糞便腸道菌群分析

2.2.1菌群在門水平的差異物種分析 本組 25份糞便的腸道菌群測(cè)序及物種分類與豐度分析結(jié)果顯示其菌群的門水平物種上包含 8個(gè)菌門，標(biāo)本在豐度上個(gè)體差異顯著的是擬桿菌門和疣微菌門，詳見(jiàn)圖1。

2.2.2菌群在科水平差異物種分析 a組差異物種是厚壁菌門，梭菌綱，梭菌目，毛螺菌科； b組差異物種是放線菌門，放線菌綱，雙岐桿菌目，雙岐桿菌科； c組排差異物種是擬桿菌門，擬桿菌綱，擬桿菌目，卟啉單胞菌科。 3組在科水平差異物種如圖 2、3、4所示。

3 討論

正常排便是嬰幼兒健康的標(biāo)志之一。嬰兒排便狀況備受關(guān)注，已成為家長(zhǎng)常見(jiàn)的焦慮因素和兒保、兒科門診的常見(jiàn)主訴。家長(zhǎng)對(duì)出生數(shù)月內(nèi)的嬰兒排便次數(shù)減少或過(guò)多、過(guò)硬或過(guò)稀、排便時(shí)哭鬧、綠色大便等很憂慮，并為此頻繁就診于兒?？苹騼嚎崎T診。為改善嬰兒排便狀況，臨床已應(yīng)用益生菌治療小兒功能性便秘、腹瀉、抗生素相關(guān)性腸炎等，然而部分小兒治療效果不佳。為針對(duì)不同排便狀況使用不同種類益生菌，提高益生菌的使用效率，本研究調(diào)查了嬰兒不同排便狀況的腸道菌群分布、多樣性并優(yōu)勢(shì)菌，發(fā)現(xiàn)了不同排便頻率的腸道菌群構(gòu)成差異。

圖1 25個(gè)糞便標(biāo)本門水平物種柱狀圖

圖2 a組差異物種毛螺菌科(lachnospiraceae)

圖3 b組差異物種雙岐桿菌科(bifidobacteriaceae)

圖4 c組差異物種卟啉單胞菌科(porphyromonadaceae)

本研究中嬰兒糞便腸道菌群物種組成和豐度分析發(fā)現(xiàn)， 0～6月齡健康嬰兒腸道菌群在菌門水平上豐富、多樣，包含 8個(gè)菌門，個(gè)體差異顯著的是擬桿菌門和疣微菌門。本研究的重要發(fā)現(xiàn)是不同排便頻率的腸道菌群分布不同，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且初步發(fā)現(xiàn)不同排便頻率在科水平的差異物種。嬰兒排便次數(shù)在(1/3～3)次/日，屬于正常排便情況，該組與其它組差異物種是毛螺菌科，該科細(xì)菌具有水解多種植物多糖、脫乙?；饔靡越到舛舅?、拮抗艱難梭菌感染等作用[1-3]，屬于益生菌。陳小玉等[4]發(fā)現(xiàn)再生障礙性貧血患兒的免疫紊亂和骨髓衰竭基本被糾正時(shí)，其糞便中毛螺菌科水平整體呈上升趨勢(shì)；高仁元等[5]研究結(jié)腸癌大鼠與正常大鼠糞便菌群結(jié)構(gòu)性變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，腸癌大鼠糞便菌群中毛螺菌科菌群豐度顯著降低。后續(xù)研究可以針對(duì)排便次數(shù)過(guò)多或過(guò)少的嬰兒應(yīng)用毛螺菌科益生菌，觀察嬰兒排便狀況改善情況。 b組的差異物種是雙岐桿菌科。雙歧桿菌科是人體腸道內(nèi)重要的常見(jiàn)共生細(xì)菌，該菌屬下的一些菌種被認(rèn)為是能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有利影響的益生菌，純母乳喂養(yǎng)嬰兒排便次數(shù)常較人工喂養(yǎng)嬰兒多，既往研究指出純母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道雙岐桿菌數(shù)量比人工喂養(yǎng)嬰兒高，應(yīng)用雙歧桿菌是否可以改善排便次數(shù)過(guò)少嬰兒的排便狀況，臨床需進(jìn)一步試驗(yàn)，觀察療效。嬰兒排便次數(shù)每天小于 1 /3次，也是困擾家長(zhǎng)的問(wèn)題，該組差異物種是卟啉單胞菌科。卟啉單胞菌科是與牙周病相關(guān)細(xì)菌，陳智濱等[6]研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)低體質(zhì)量?jī)耗赣H唾液中牙齦卟啉單胞菌檢出水平較高，于鑫等[7]在進(jìn)展期腺瘤患者糞便中也發(fā)現(xiàn)牙周病相關(guān)細(xì)菌卟啉單胞菌屬和牙齦卟啉單胞菌顯著上升。從這些研究可以看出卟啉單胞菌科與疾病發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)，卟啉單胞菌科細(xì)菌是否也正是導(dǎo)致嬰兒排便次數(shù)過(guò)少的主要腸道菌群？其具體的機(jī)制和途徑及干預(yù)治療的方法仍需更深入的研究和更大樣本的調(diào)查加以明確。

腸道微生態(tài)環(huán)境與人體健康有著奇妙的關(guān)聯(lián)。嬰兒腸道微生物影響身體代謝、影響腦發(fā)育和行為的觀點(diǎn)已被很多科學(xué)探索者接受。反之，我們也可能通過(guò)某些措施促進(jìn)腸道微生物群落的健康，從而改善嬰兒健康。以往對(duì)于腸道微生態(tài)的研究多采用培養(yǎng)或分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)于腸道微生物群的多樣性研究有明顯的局限性，隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，以其測(cè)序快、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)逐漸應(yīng)用于腸道微生物的研究，這些研究大多在歐美國(guó)家完成，中國(guó)此方面文獻(xiàn)報(bào)道不多，且樣本量少，結(jié)果差異性較大，不能全面體現(xiàn)嬰兒腸道微生物區(qū)系的定植及演變?nèi)^(guò)程。本研究通過(guò)高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)嬰兒不同排便狀況的糞便微生物群進(jìn)行 DNA測(cè)序，調(diào)查不同排便狀況嬰兒糞便微生物定植多樣性和優(yōu)勢(shì)菌，填補(bǔ)排便狀況與腸道菌群分布關(guān)系的研究空白，為應(yīng)用不同益生菌改善不同排便狀況提供理論線索，為今后研究腸道微生物群系變化與遠(yuǎn)期疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。臨床上為益生菌的應(yīng)用開(kāi)辟新用途：早期干預(yù)，預(yù)防嬰兒便秘或腹瀉，促進(jìn)遠(yuǎn)期健康。

從腸道微生態(tài)學(xué)角度，早期益生菌干預(yù)可以通過(guò)修飾腸道菌群，提高菌群轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為活性化合物的能力，常用菌種有雙岐桿菌、乳桿菌、糞鏈球菌、酪酸梭菌、芽孢桿菌和布拉酵母菌。不同種類的益生菌作用機(jī)制不完全相同，對(duì)不同疾病的臨床效果存在差異[8]。本研究從排便頻率的直觀現(xiàn)象對(duì)應(yīng)出腸道菌群構(gòu)成的差異，期望能夠根據(jù)嬰兒不同排便頻率有針對(duì)性的應(yīng)用不同種類的菌群調(diào)整腸道內(nèi)環(huán)境，改善排便狀況，切實(shí)解決排便次數(shù)過(guò)多或過(guò)少給小嬰兒家長(zhǎng)造成的困擾。本次實(shí)驗(yàn)收集到的標(biāo)本量稍少，后續(xù)要進(jìn)行更大樣本的研究以證實(shí)結(jié)果的可靠性。另外，腸道菌群是一個(gè)整體，單一應(yīng)用益生菌的療效需要進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)確定。本次研究發(fā)現(xiàn)不同排便頻率在科水平存在顯著差異的物種，為后面的研究提供了方向和研究重點(diǎn)。