BR3胞外區(qū)保守結(jié)構(gòu)域附近剛性區(qū)域分析①

張小娟 馮德明 李羅曼 蘇麗麗 孫 劍

(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津300072)

B細(xì)胞活化因子(B cell-activating factor,BAFF)，TNF家族第13位成員，在B細(xì)胞發(fā)育和T淋巴細(xì)胞激活過程中發(fā)揮重要作用[1]。BAFF可通過與B細(xì)胞上的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，而誘導(dǎo)抗凋亡因子的表達(dá)、抑制凋亡因子表達(dá)，使B細(xì)胞數(shù)量顯著升高[2,3]。所以，BAFF的過量表達(dá)會致使B細(xì)胞數(shù)量增長，自身抗體表達(dá)，進而引發(fā)一系列的自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheuma-toid arthritis,RA)、多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)及B細(xì)胞惡性腫瘤[4]。

BAFF的受體有三種：鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)素配體相互作用劑(TACI)、B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)及BAFF受體(BAFF-R)。隨著BAFF研究的深入，阻斷BAFF與其B細(xì)胞上受體的結(jié)合，進而降低B細(xì)胞數(shù)量已成為治療BAFF過量表達(dá)引發(fā)這類疾病的一個重要策略[5]。目前有三類被廣泛研究的生物制劑用于BAFF相關(guān)疾病的治療：受體融合蛋白，單克隆抗體和拮抗肽，其代表產(chǎn)品分別是Atacicept和Briobacept,Belimumab和Tabalumab，以及Blisibimod(AMG623)。但其中只有Belimumab于2011年獲FDA批準(zhǔn)上市用于治療SLE，Blisibimod和Tabalumab目前正在接受治療RA的臨床試驗，其他大多因達(dá)不到預(yù)期治療效果而終止研究[6-9]。本實驗將BR3胞外結(jié)合區(qū)分為了兩部分，通過基因重組的方法構(gòu)建純化其與人IgG Fc的融合蛋白。通過ELISA結(jié)合實驗和小肽競爭實驗來探究胞外區(qū)對BR3與BAFF結(jié)合的影響，來闡明BR3胞外區(qū)對其與BAFF結(jié)合的作用。從而設(shè)計出高親和性、特異性的BAFF拮抗劑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗試劑 限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ，HindⅢ和NdeⅠ(NEB)；DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA和蛋白Marker(TaKaRa)；引物和測序(北京三博遠(yuǎn)志公司)，引物BR3-1-f(5′-TATGTGCTTCGACCTGCTGGTCCGCCACGGTGTGGCCTGCGGTG-GAGGTGGATCTG-3′)，BR3-1-r(5′-AATTCAGATCCACCTCCACCGCAGGCCACACCGTGGCGGACCAGC-AGGTCGAAGCACA-3′)，BR3-2-f (5′-TATGTGCGGCCTGCTGCGTACCCCGCGTCCGAAACCGGCGGTG-GAGGTGGATCTG-3′)，BR3-2-r(5′-AATTCAGATCCACCTCCACCTGCCGGTTTCGGACGCGGGGTACGC-AGCAGGCCGCACA-3′)；肽BR3-1(CFDLLVRHC-VAC)，肽BR3-2(GLLRTPRPKPA)，肽BCMA1(NEYFDSLLHACIPC)，肽BCMA2(QLRCSSNT-PPLT)和肽NP(DIDFLIEEIERL-GQDL)(寧波康貝生物化學(xué)有限公司)；HRP辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體(北京中杉金橋生物科技有限公司)；卡那霉素抗生素，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),TMB(Sigma)。其他化學(xué)試劑(國藥化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2實驗材料 大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、pET-30a-Fc質(zhì)粒、IgG1Fc、BAFF蛋白均為天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實驗室儲存。

1.2方法

1.2.1BR3-1和BR3-2的設(shè)計 根據(jù)BAFF-BCMA、BAFF-TACI和BAFF-BR3復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)和序列同源性分析，在BAFF受體中有共同的保守DxL結(jié)構(gòu)域，其包含6個氨基酸殘基序列(F/Y/W)I-DII-XIII-LIV-(V/T)V-(R/G)VI[10]。BR3胞外區(qū)存在4個半胱氨酸(C19,C24,C32,C35)，形成兩個二硫鍵結(jié)構(gòu)(C19-C32,C24-C35)，我們選取包含DxL 結(jié)構(gòu)域的(C24-C35)區(qū)域作為BR3-1序列，其后包含3個脯氨酸(P41,P43,P45)的序列作為BR3-2。形成了具有DxL結(jié)構(gòu)域的BR3-1(CFDLLVRHGVAC，C32突變?yōu)镚32以保證二硫鍵的正確形成)和BR3-2(GLLRTPRPKPA)。

1.2.2pET30a-BR3-1-Fc和pET30a-BR3-2-Fc融合質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)BR3-1、BR3-2氨基酸序列設(shè)計包含NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點的引物片段。將上、下游引物溶解后，沸水浴3 min冷卻至室溫，獲得BR3-1和BR3-2基因片段。利用T4連接酶將基因片段和NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的pET30a-Fc載體連接，并轉(zhuǎn)化入DH5α宿主菌，菌落、菌液PCR，HindⅢ單酶切鑒定陽性克隆后，將陽性重組質(zhì)粒送公司測序(三博遠(yuǎn)志有限公司)。

1.2.3融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單克隆于3 ml LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8后，加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)，18℃誘導(dǎo)18 h,8 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞沉淀，用40 μl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將細(xì)胞懸浮，加入10 μl 6×上樣緩沖液，煮沸后SDS-PAGE篩選目的蛋白的高表達(dá)菌株。取30 μl 保存的高表達(dá)菌株菌種于3 ml LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，然后按照1∶500接種于3 L LB培養(yǎng)基用于大規(guī)模培養(yǎng)提取目的蛋白。離心收集細(xì)菌。將細(xì)菌懸浮后反復(fù)凍融3次，在冰浴中使用高壓勻質(zhì)儀破菌，將破碎后菌液12 000 r/min離心20 min。離心上清過濾去除細(xì)胞碎片。過濾后的上清液加到蛋白A凝膠色譜層析柱中，用檸檬酸緩沖液(pH=3.0)洗脫結(jié)合的目的蛋白。PBS(pH=7.0)過夜透析去鹽，通過SDS-PAGE分析提取蛋白質(zhì)純度。

1.2.4ELISA融合蛋白結(jié)合的活性分析和小肽競爭 BR3-1-Fc和BR3-2-Fc融合蛋白的結(jié)合活性分析，用pH=9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋BAFF至10 μg/ml，加50 μl的BAFF稀釋液于96孔板酶標(biāo)條中，然后放置到4℃包被20 h。用PBST洗滌酶標(biāo)條3次，每次5 min后，在每孔中加入150 μl 1×PBS稀釋的脫脂牛奶(5% M/V)，37℃放置2 h封閉。然后在每孔中加入50 μl相應(yīng)濃度的融合蛋白(BR3-1-Fc、BR3-2-Fc、IgG1Fc)，并在37℃孵育1 h。PBST洗滌3次后，加入50 μl 1∶5 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體孵育1 h。PBST洗滌3次后，加50 μl TMB-H2O2于37℃顯色10 min 后，用50 μl 20%H2SO4終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀于450 nm測量OD值。用于檢測小肽活性的ELISA競爭實驗按如下方法操作：酶標(biāo)條包被BAFF、洗滌、封閉如上述。在每孔中加入50 μl不同濃度的小肽和融合蛋白混合液(150 μg/ml的BR3-1-Fc)，37℃孵育1 h，PBST洗滌后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體，按照上述步驟進行顯色和終止反應(yīng)，測定450 nm測量OD值，并計算小肽的抑制率。抑制率(%)=(ABR3-Fc-ABR3-Fc+肽)/ABR3-Fc×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 本研究中，數(shù)據(jù)處理均采用Graphpad Pism 6.07系統(tǒng)軟件進行，涉及小肽競爭間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過引物退火的方法獲得目的基因片段，將目的基因和雙酶切后的pET30a-Fc連接導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中后。挑取菌落做PCR，陽性菌落過夜培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，在750 bp左右出現(xiàn)目的條帶。取PCR陽性的質(zhì)粒10 μg用HindⅢ單酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)沒有重組目的片段的質(zhì)粒pET-30a-Fc酶切后片段位置明顯低于重組質(zhì)粒(圖2)，選取陽性重組質(zhì)粒進行基因測序，結(jié)果顯示BR3-1-Fc和BR3-2-Fc基因構(gòu)建正確。

2.2BR3-1-Fc和BR3-2-Fc融合蛋白的表達(dá)純化 將測序正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，然后小樣誘導(dǎo)篩選高表達(dá)菌株。將高表達(dá)菌株進行擴培和蛋白A凝膠親和色譜柱純化獲得目的蛋白。根據(jù)預(yù)測，純化的融合蛋白的大小約為28 kD，與純化蛋白位置相符(圖3)。純化的BR3-1-Fc和BR3-2-Fc融合蛋白的產(chǎn)量分別為每升培養(yǎng)物約2.5 mg和5 mg，純度約為90%。

2.3BR3-1-Fc和BR3-2-Fc融合蛋白結(jié)合BAFF的生物學(xué)活性 在低濃度(100 μg/ml和200 μg/ml)下，BR3-1-Fc結(jié)合BAFF的能力與BR3-2-Fc相近，但隨著其濃度的增加，結(jié)合能力快速增加。當(dāng)濃度達(dá)到300 μg/ml時，BR3-2-Fc的結(jié)合約為BR3-1-Fc對BAFF的57%。而作為陰性對照的IgG1Fc雖在高濃度下也具有輕微的結(jié)合活性，但OD值始終低于0.2，明顯低于在相同濃度下BR3-1-Fc和BR3-2-Fc的吸光度(圖4)。

圖1 BR3-1-Fc和BR3-2-Fc質(zhì)粒PCRFig.1 Plasmid PCR products of BR3-1-Fc and BR3-2-FcNote: 1-4.BR3-1-Fc；M.DNA marker；5-8.BR3-2-Fc.

2.4肽抑制/增加BR3-1-Fc和BAFF的相互作用 ELISA競爭實驗表明，BR3-2肽對BR3-1-Fc和BAFF結(jié)合的競爭與BR3-1、BCMA1和BCMA2小肽明顯不同。BR3-1和BCMA1肽的抑制率相似，隨著濃度的增加，抑制率也增加。在200 μg/ml時，BR3-1肽的抑制率達(dá)到35%，BCMA1肽的抑制率為30%。當(dāng)BCMA1肽濃度增加至300 μg/ml時，抑制率達(dá)到32%高于BR3-1。BCMA2肽的抑制率始終低于10%，并且與NP沒有顯著差異。BR3-2在較高濃度下可以增加BR3-1-Fc與BAFF的結(jié)合，雖然NP對BR3-1-Fc的結(jié)合也存在這促進作用，但促進比率始終低于8%。且在300 μg/ml時BR3-2肽的促進比例可達(dá)20%，并與NP出現(xiàn)顯著差異(圖5)。

圖2 BR3-1-Fc和BR3-2-Fc融合質(zhì)粒單酶切Fig.2 Single restriction digestion analysisNote: 1.Fc-pET30a；2.BR3-1-Fc；3.BR3-2-Fc.

圖3 SDS-PAGE鑒定BR3-1-Fc,BR3-2-Fc純化蛋白Fig.3 Identification for purified fusion proteins by SDS-PAGENote: 1.BR3-1-Fc；2.BR3-2-Fc；M.Proteins marker.

圖4 ELISA鑒定BR3-1-Fc/BR3-2-Fc與BAFF的親和力Fig.4 Binding activity analysis of BR3-1-Fc/BR3-2-Fc to BAFF

圖5 BR3-1-Fc結(jié)合BAFF的小肽競爭實驗Fig.5 Peptide competitive analysis for BR3-1-Fc to BAFF bindingNote: Compare with NP group,*.P<0.05,* *.P<0.01.

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，外周單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌表達(dá)的BAFF及其受體在部分成熟B細(xì)胞的選擇和存活中發(fā)揮重要作用，BAFF結(jié)合受體后可通過誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖分化，抑制B細(xì)胞的凋亡而影響B(tài)細(xì)胞的數(shù)量和抗體表達(dá)水平。BAFF在T淋巴細(xì)胞激活等免疫過程中還可與Anti-TCR共刺激T細(xì)胞而促進T細(xì)胞增殖分化，也可以誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌IL-2和INF-γ，上調(diào)活化T細(xì)胞中抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)量，而促進Th1細(xì)胞的功能[11]。隨著BAFF研究的深入，BAFF表達(dá)水平與很多疾病的關(guān)系也逐漸被揭示。高水平的BAFF會引發(fā)一系列的自身免疫疾病，B細(xì)胞腫瘤等[12]。其他疾病如EB病毒患者，HIV患者血清中BAFF也有較高水平表達(dá)，并伴有大量的自身抗體。而低水平的BAFF則會降低抗體的表達(dá)，提高感染效率。B細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)對免疫系統(tǒng)的正常運作極其重要。目前全球大約有20%的人深受各種自身免疫疾病的困擾，B細(xì)胞腫瘤和HIV患病人數(shù)也在逐年增加。因此BAFF系統(tǒng)相關(guān)免疫系統(tǒng)的探究認(rèn)識對B細(xì)胞相關(guān)疾病治療尤為重要。

當(dāng)前BAFF拮抗藥物的開發(fā)是一些B細(xì)胞相關(guān)自身免疫疾病最為關(guān)注的焦點。然而除2011年FDA批準(zhǔn)Belimumab成為SLE臨床治療藥物外，目前研究開發(fā)的BAFF拮抗藥物如Atacicept等[13-16],普遍存在著治療效果達(dá)不到預(yù)期等問題而被終止[17]。且大多數(shù)的這類藥物只能起到緩解作用，患者關(guān)節(jié)疼痛，疲勞，風(fēng)濕等癥狀并不能根除，10年以上的SLE患者的死亡率也仍無明顯改變[18,19]。另外，目前BAFF抑制劑更傾向于清除表達(dá)BR3和TACI受體的幼稚期和過渡期B細(xì)胞。對表面廣泛表達(dá)BCMA的抗體分泌細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞影響不大。但在某些疾病中這后兩種細(xì)胞的清除更加重要。因此，對于BAFF拮抗藥物研究的總體趨勢并不樂觀，對BAFF功能和機理探究對全球疾病衛(wèi)生發(fā)展仍至關(guān)重要。且研究表明BR3結(jié)合BAFF和所引發(fā)的下游細(xì)胞內(nèi)信號通路不同于BCMA和TACI。BR3和BAFF結(jié)合后TRAF3被降解，釋放NIK，磷酸化IKKα激活p100發(fā)生磷酸化依賴性切割以產(chǎn)生活性p52-Rel B復(fù)合物。而且，BAFF還通過c-myb抑制PKCδ的核移位，從而保護B細(xì)胞免于凋亡[20,21]。但對于BR3結(jié)構(gòu)是如何在BR3結(jié)合BAFF后傳導(dǎo)特異性信號還未進一步闡明。因此本實驗對于BAFF特異受體BR3胞外區(qū)結(jié)構(gòu)的分析，不僅可以探究BR3結(jié)構(gòu)對其高親和原因，還可以為探究BAFF結(jié)合BR3后的特異信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制奠定基礎(chǔ)。

本實驗中，BR3-1-Fc和BR3-2-Fc融合蛋白與BAFF的結(jié)合活性分析實驗表明BR3-1-Fc和BR3-2-Fc都能與BAFF結(jié)合，BR3-2-Fc的結(jié)合活性大約是BR3-1-Fc的一半。但二者結(jié)合活性均明顯低于BR3-Fc與BAFF的結(jié)合(之前實驗表明BR3-Fc融合蛋白在40 μg/ml時與BAFF結(jié)合達(dá)到飽和)，BR3-1-Fc+BR3-2-Fc<

但從獲得數(shù)據(jù)我們可以總結(jié)得出：BR3受體胞外區(qū)DxL 結(jié)構(gòu)域附近的剛性結(jié)構(gòu)區(qū)域BR3-2，在BR3高親和性能中發(fā)揮重要作用，其結(jié)合BAFF后可能會引起B(yǎng)AFF的變構(gòu)而增強其與受體DxL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。據(jù)此我們可以根據(jù)BR3-2的結(jié)構(gòu)探究高親和作用機制，結(jié)合受體TACI的CRD結(jié)構(gòu)域，設(shè)計出結(jié)合活性更高的選擇性結(jié)合肽。為進一步加深對免疫系統(tǒng)中BAFF系統(tǒng)的認(rèn)識，在生理和病理條件下更好地理解BAFF相關(guān)疾病的產(chǎn)生奠定基礎(chǔ)。且實驗構(gòu)建純化的BR3-1-Fc和BR3-2-Fc蛋白，為探究BR3特異性結(jié)合BAFF的研究提供了實驗材料。