NKG2D的結(jié)構(gòu)與功能①

曹偉婭 李存娣 王 健

(安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，淮南232001)

自然殺傷細胞(Natural killer cell,NK)具有肯定的抗腫瘤活性，其在抗肝細胞癌分裂增生、浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用。NKG2D(Natural killer group 2D)作為表達在NK細胞、CD8+γδT細胞、γδT細胞等免疫活性細胞表面的重要活化性受體[1]，屬C型凝集素受體家族中的關(guān)鍵成員，誘導(dǎo)NK細胞表達NKG2D，可進一步促進NK細胞活化，并在抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中起重要作用[2]。本文圍繞NKG2D結(jié)構(gòu)、功能、表達及其在肝癌中的作用進行綜述，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 NKG2D的發(fā)現(xiàn)

NKG2D是20世紀90年代發(fā)現(xiàn)的存在于NK細胞表面的活化性受體。Houchins等[3]于1991年在篩選人源性NK細胞優(yōu)勢表達基因時發(fā)現(xiàn)NKG2D，同時還篩選出與之相鄰的NKG2A、NKG2C、NKG2E。4組基因均編碼由215～233個氨基酸組成的Ⅱ型膜蛋白，令人稱奇的是NKG2C與NKG2A在C末端(COOH-)有94%的同源性，在跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)有56%的同源性，而NKG2D與另外3組基因的氨基酸同源性僅有21%，它們共同參與NKG2受體家族的組成。

NK細胞是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[4-6]，而且與T細胞和B細胞相比，NK細胞表面的NKG2D在活化過程中不受宿主MHC限制，并能通過多種信號激活途徑殺傷、溶解腫瘤細胞。NK細胞表面可表達多種受體(圖1)，依功能可分為活化性受體和抑制性受體，前者系指具有特征性的天然細胞毒性受體(Natural cytotoxicity receptor,NCR)家族成員，如NKp46、NKp30、NKp44和C型凝集素家族受體(NKG2D、CD94/NKG2C、CD94/NKG2E、CD94/NKG2F、CD161)，還有活化的殺傷性免疫球蛋白受體(activating killer immunoglobulin receptors,KIRs)，如KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DL4。NK細胞抑制性受體主要包括NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR3DL1。如表1。

NKG2受體家族包括NKG2A、B、C、D、E，其中NKG2A、B屬于抑制性受體，NKG2C、D、E屬于活化性受體。NKD2A、B、C、E在細胞表面表達需CD94分子輔助參與，并與CD94分子形成異源二聚體。值得注意的是，NKG2A的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含兩個與含

有絡(luò)氨酸蛋白2結(jié)構(gòu)域同源的磷酸酶-1(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1,SHP-1)相關(guān)聯(lián)的免疫酪氨酸抑制性受體(Immu-noreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs)基序，這些抑制性基序在胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域由一致的序列I/VXYXXV/L組成，能夠在受體配體結(jié)合后導(dǎo)致ITIM的酪氨酸磷酸化[7]，隨后招募細胞內(nèi)SHP-1酪氨酸磷酸酶，然后使激活的級聯(lián)信號分子上的酪氨酸殘基去磷酸化，傳遞抑制信號。NKG2A介導(dǎo)的信號通路在介導(dǎo)肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮關(guān)鍵的抑癌作用[8]。MKG2C可與CD 94形成異源二聚體，因缺乏ITIMs基序，不能傳遞抑制信號，卻能夠傳遞活化信號。人源性NKG2D是以同源二聚體形式表達，無需CD94，也不會與之結(jié)合，小鼠NK細胞表達的也是NKG2D同源二聚體。Ho等[9]以C57BL/6J、BALB/cJ和C57BL/6T小鼠為實驗動物模型，采用cDNA克隆、IL-2誘導(dǎo)活化的NK細胞(亦稱淋巴因子激活的殺傷細胞，Lymphokine-activated killer cell,LAK) 培養(yǎng)和免疫印跡分析等方法，基于表達序列標簽數(shù)據(jù)庫克隆出與人類NKG2D和CD94互補同源的C57BL/6的cDNA，證實小鼠NKG2D基因序列位于NK基因序列CD94和Ly49受體家族附近，從小鼠NK細胞中克隆出兩種NKG2D轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分別為2.7 kb和2.1 kb。小鼠CD94和人類CD94在氨基酸水平上分別有54%一致性和66%相似性。

圖1 NK細胞受體Fig.1 NK cell receptorsNote: Activated receptors can be expressed on NK cells, such as NKG2D, C, NKp46, CD16 and others, and multiple inhibitory receptors also can be expressed on NK cells, such as NKD2A, NKG2B and so on.

表1 NK細胞活化性受體和抑制性受體

2 NKG2D的染色體定位

2.1鼠源性NKG2D的染色體定位 Dissen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞介導(dǎo)同種異體反應(yīng)性功能(NK-mediated alloreactivity,NKa)的基因位點位于常染色體上，是一個顯性基因，調(diào)控由NK細胞介導(dǎo)的同種異體反應(yīng)，定位在小鼠自然殺傷基因復(fù)合體(Natural killer gene complex，NKC)區(qū)域，可以調(diào)控同種異體淋巴細胞NK細胞的溶菌作用，通過連鎖分析和脈沖場凝膠電泳實驗證實,定位于小鼠6號染色體上的自然殺傷基因復(fù)合體含NKR-P1和Ly-49、NKG2D同系物等多基因家族。

2.2人源性NKG2D的染色體定位 人源性NKG2D基因定位于12p12.3-p13. 1(圖2)， 基因組

長270 kb，編碼分子量為42 kD的Ⅱ型膜蛋白[11]。2012年，Imai等[12]采用單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)分析732例原子彈爆炸后幸存者外周血NK細胞和CD8+T細胞表面NKG2D的表達，發(fā)現(xiàn)其定位于12號染色體，其NKC區(qū)域包括NKG2D hb-1和NKG2D hb-2兩個單倍體區(qū)。NKG2D hb-1含有兩個關(guān)鍵的單倍體等位基因LNK1和HNK1，分別與低自然細胞毒活性和高自然細胞毒活性的表型密切相關(guān)，HNK1/HNK1單倍型較LNK1/LNK1對揭示癌癥風險的降低更有意義。在NK細胞NKG2D的表達中，LNK1/LNK1、LNK1/HNK1、HNK1/HNK1單倍型表達依次顯著增加(P=0.003)，或以個體單倍型標記的單核苷酸多態(tài)性(haplotype-tagging single nucleotide polymorphisms,htSNPs)依次為主要的純合子、雜合子、小純合基因型(P=0.02～0.003)，提示NKG2D單倍型參與NK細胞和CD8+T細胞NKG2D蛋白的表達，使機體針對腫瘤細胞毒性反應(yīng)存在明顯的個體差異。

圖2 NKG2D染色體定位Fig.2 Chromosome localization of NKG2DNote: Human NKG2D is located at 12p12.3-p13.1.

表2 人/鼠源性NKG2D表達

2.3人源性NKG2D與鼠源性NKG2D的異同點 人源殺傷細胞凝集素樣受體K1(Killer cell lectin like receptor K1,KLRK1)基因，即編碼NKG2D蛋白的功能基因，具有有限的多態(tài)性，只有2個等位基因存在單一氨基酸的差異，小鼠同源基因KLRK1多態(tài)性同樣有限。KLRK1直系同源基因存在于所有哺乳動物和有袋類動物的基因組中，表明該基因在進化過程中高度保守。NKG2D作為活化性受體可同時表達于人源性和鼠源性NK細胞、CD8+T細胞等，但在CD4+T細胞通常缺失表達，具體見表2[13]。

3 NKG2D的基因結(jié)構(gòu)和功能

3.1鼠源性NKG2D的基因結(jié)構(gòu)和功能 早在1998年，Glienke等[14]發(fā)現(xiàn)小鼠NKG2D具有相對保守的基因序列，含10個外顯子。小鼠NK細胞凝集素樣受體的基因(NK lectin-like receptor,NKLLR)，亦稱NKR-P2。序列分析表明,它與人源性NKG2D基因有高度的同源性，并且這兩個分子形成了獨特的NKLLR家族，和其他小鼠NKLLR相比，與NKG2家族中的A、B、C和E沒有更多相關(guān)性[15]。NKR-P2不僅是包含7個內(nèi)含子的單拷貝基因，而且反映了小鼠NK基因的復(fù)雜性。小鼠NKR-P2與人類同源基因的不同之處在于其胞質(zhì)尾部包含由一個單獨的外顯子編碼的13個氨基酸。NK細胞能夠強烈表達NKR-P2，但在T細胞或NK細胞中未檢測到缺乏此外顯子的剪接變異體。

3.2人源性NKG2D的基因結(jié)構(gòu)和功能 人源性NKG2D基因由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成。外顯子2～4編碼胞內(nèi)、跨膜結(jié)構(gòu)域，外顯子5～8編碼與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(圖3示)，是一個突出于細胞外空間的膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域。人源性的NKG2D雖然具有特定的單核苷酸變異性，但與鼠源性NKG2D受體有70%同源性。

圖3 人源性NKG2D基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of human NKG2DNote: The gene structure of human NKG2D is composed of 10 exons and 9 introns. The exon 2 to exon 4 encode the intracellular and transmembrane domain. The exon 5 to exon 8 encodes the domain, which is prominent in the extracellular and can combine with a ligand.

Shum等[16]提取14例志愿者外周血單個核細胞中的總RNA，經(jīng)PCR擴增技術(shù)確定人源性NKG2D的等位基因，發(fā)現(xiàn)其中至少有5個志愿者為NKG2D雜合子。對每一個供者的每一種等位基因進一步分析，依據(jù)人類基因研討會的專家共識，發(fā)現(xiàn)人類NKG2D至少表達三個不同的等位基因，分別用NKG2D01、NKG2D02、NKG2D03表示，它們的登記號依次為NM-007360、AF260135、AF260136，其中“NM”表示參考序列，但三種等位基因的基因序列均表示為D12S2489E。NKG2D01基因序列最初由Houchins等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與另外2種等位基因的同源性很高，僅有214和624兩個位點的核苷酸不同，其中一個是同義核苷酸，另一個是反義核苷酸。214位點的堿基分別是G、G、A，624位點的堿基為A、G、G。此外，還對比分析了人類和黑猩猩CD94、某些NKG2家族基因的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，其中三種人源性NKG2D和黑猩猩的pt-NKG2D的核苷酸同源性為98.9%，證實NKG2D是一種高度保守的基因。

3.3人源性NKG2D與鼠源性NKG2D基因結(jié)構(gòu)和功能差異 早在2002年Diefenbach等[18]提出，小鼠NKG2D的mRNA剪接可產(chǎn)生兩種剪接體：長(NKG2D-L)和短(NKG2D-S)的剪接體。除5′端外，兩個開放閱讀框(Open-reading frames,ORFs)是相同的：NKG2D-L與NKG2D-S相比，包含一個額外的上游AUG密碼子，從而使NKG2D-L在相關(guān)蛋白胞漿區(qū)的氨基端要長出13個氨基酸。通過mRNA半定量PCR分析表明，這兩種亞型在不同的細胞類型中均有不同程度的表達，并受到細胞活化的調(diào)節(jié)。流式細胞術(shù)和免疫共沉淀實驗表明，NKG2D-S能與DAP10、DAP12結(jié)合，而NKG2D-L僅能與DAP-10結(jié)合。DAP12基因與DAP10基因相鄰，二者之間染色體定位僅相距300 bp，為含有86個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，主要為NKG2C、E的接頭蛋白。

由此可知，不同物種之間NKG2D基因結(jié)構(gòu)和功能存在一定的差異。人源性NKG2D與鼠源性NKG2D分別定位在12號、6號染色體上，其包含的外顯子和內(nèi)含子數(shù)也不同，鼠源性NKG2D胞質(zhì)尾部包含一個單獨的外顯子，可編碼13個氨基酸。而人源性NKG2D至少表達三個不同的等位基因，有關(guān)鼠源性NKG2D等位基因尚未見報道。

4 NKG2D的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能靶位

4.1鼠源性NKG2D的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能靶位 2008年Guerra等[19]在探討NKG2D缺陷型小鼠NK細胞特征時，發(fā)現(xiàn)在NK細胞發(fā)育過程中，NKG2D缺陷型小鼠的NK細胞表面成熟標志與正常小鼠沒有顯著差異，即表明NKG2D對NK細胞的正常表型發(fā)育不是必需的。小鼠可表達兩種NKG2D選擇性剪接異構(gòu)體于NK細胞和持續(xù)活化型CD8+T細胞表面，NKG2D-L亞型也以二硫鍵形成二聚體的形式表達，并且與DAP10結(jié)合?；罨?，小鼠NK細胞表達的NKG2D-S亞型可與DAP10或DAP12結(jié)合。DAP10含有可招募P85 PI3K激酶、Vav-1、Grb2 信號復(fù)合體的YINM基序，而DAP12含有可招募 Syk和ZAP70的ITAM基序。

4.2人源性NKG2D的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能靶位 NKG2D是在人類NK細胞和活化的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)上均能表達的活化性受體，屬跨膜性受體，分子量大約為42 kD，是重要的免疫活性分子[20]。NKG2D單聚體蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)包括2個α螺旋、2個β片層、4個二硫鍵，其胞外域含有1個C型植物血凝素樣受體的β片層(β-stand)結(jié)構(gòu)。NKG2D的跨膜區(qū)域含有帶正電荷的氨基酸，胞漿區(qū)不含傳遞信號的基序，主要依靠接頭蛋白DAP來傳遞活化信號。NKG2D的主要接頭蛋白是DAP10，可以通過靜電作用與DAP10跨膜區(qū)富含負電荷的氨基酸殘基結(jié)合，這是NKG2D表達和激活下游信號PI3K和Grb2所必需的，并能進一步促進細胞增殖、刺激細胞因子產(chǎn)生、激活免疫細胞、激發(fā)NK細胞和T細胞的細胞毒性潛力[21]。人源性DAP10定位于19q13.1，是由74個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，可以通過胞外區(qū)半胱氨酸殘基的二硫鍵形成同源二聚體，繼而表達于NK細胞表面。

4.3人源性NKG2D與鼠源性NKG2D蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能靶位差異 NKG2D在多種人源性和鼠源性細胞表面呈差異表達，如在幾乎所有CD8+T細胞、NK細胞、單陽性CD8+T細胞等表達情況是不一樣的，但似乎只與NK細胞和T細胞中的DAP10相結(jié)合，這可能是NK細胞和T細胞具有細胞毒效應(yīng)的原因之一。人類所有的CD8+T淋巴細胞能夠表達NKG2D，而在小鼠內(nèi)僅表達活化的CD8+T淋巴細胞。此外，在小鼠體內(nèi)存在NKG2D兩個長、短不同的亞型。在人類中，只有較長的NKG2D受體亞型。人源性NKG2D與鼠源性NKG2D蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能位點差異見表3。

5 NKG2D介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)

NKG2D作為一個關(guān)鍵的活化受體，導(dǎo)致DAP10的磷酸化反應(yīng)，它可以激活絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)和Janus激酶(Janus kinase,Jak)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄活化因子(Activators of transcription,STAT)實現(xiàn)多種途徑的信號傳導(dǎo)[22]。NKG2D細胞質(zhì)中缺少傳導(dǎo)信號的結(jié)構(gòu)，但是，NKG2D在人體內(nèi)通過轉(zhuǎn)接蛋白分子DAP10和在小鼠內(nèi)的DAP10和DAP12結(jié)合，激活信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細胞毒性效應(yīng)細胞的脫粒和/或細胞因子的產(chǎn)生。2009年Segovis等[23]提出NKG2D介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑首先需要PI3K及其亞單位P85和轉(zhuǎn)接蛋白CrkL的參與，隨后激活下游因子，如Ras家族的小GTP酶Rap1，從而實現(xiàn)細胞毒作用(圖4、5)。而DAP12可以通過自身基于酪氨酸的免疫受體活化基序招募ZAP70和Syk，進而可以直接發(fā)揮細胞毒作用，或者通過PI3K、STAT5產(chǎn)生效應(yīng)細胞因子。因此，在小鼠體內(nèi)，NKG2D可通過PI3K和Syk/ZAP70兩條信號通路發(fā)揮功能。

Sagiv等[24]在探討NKG2D配體介導(dǎo)衰老細胞的免疫調(diào)節(jié)作用中，采用組織培養(yǎng)、細胞毒性實驗、SA-β-gal染色、基因敲除、流式細胞術(shù)及免疫熒光等多種實驗方法證實，在復(fù)制性衰老、DNA損傷導(dǎo)致的衰老、癌基因誘導(dǎo)的衰老過程中，衰老細胞表面的MICA、ULBP2上調(diào)是介導(dǎo)NK細胞NKG2D識別和消除衰老成纖維細胞所必需的，值得注意的是，這些配體的連續(xù)表達受ERK信號通路調(diào)控。在敲除NKG2D基因的小鼠模型中，衰老活化星狀細胞的積累增加，肝損傷中的衰老細胞難以消除，從而加重肝纖維化，提示NKG2D 受體通過與配體相互作用能夠延緩或阻斷肝纖維化的進程。

6 NKG2D介導(dǎo)的生物學(xué)功能

活化的NK細胞受體NKG2D和它的多種配體共同組成的一個強大的壓力誘導(dǎo)監(jiān)測系統(tǒng)，可以對受感染、發(fā)炎和惡性轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生一定的抵抗作用，并且在抗腫瘤免疫監(jiān)視中起決定性作用。

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是一種免疫介導(dǎo)的肝病。為研究NKG2D活化NK細胞參與抗乙型肝炎病毒的分子機制，Wang等[25]通過阻斷或不阻斷NKG2D進行兩組實驗，將NK細胞和正在發(fā)生HBV復(fù)制的HepG2細胞共培養(yǎng)后，通過流式細胞術(shù)、免疫組織化學(xué)(Immunohistoch-emistry,IHC)分別檢測NKG2D、IFN-γ的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。結(jié)果顯示， HBV感染患者外周血NKG2D+、IFN-γ+NK細胞增多，肝組織內(nèi)NKG2D、IFN-γ的mRNA和蛋白質(zhì)含量都顯著增高，體外培養(yǎng)NKG2D、IFN-γ的mRNA和蛋白水平明顯高于被NKG2D單克隆抗體阻斷的培養(yǎng)組。提示NKG2D通過激活HBV感染過程中的NK細胞，部分調(diào)節(jié)免疫炎癥和增強抗病毒效應(yīng)。

表3 人/鼠源性NKG2D蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能靶位

圖4 鼠源性NKG2D介導(dǎo)的信號通路Fig.4 Signal transduction pathway mediated by NKG2D in miceNote: When mouse NKG2D homodimer is combined with its ligands (RAE1, H60, and MULT1) and connects with DAP10 on the surface of the cell membrane, which makes DAP10 residues phosphorylate, and activates the downstream PI3K and the regulatory subunit P58. It promotes the increase of calcium influx and the release of granzyme. Otherwise, It further promotes cell proliferation by activated STAT5 signal transduction pathway. Cytotoxic effect is played through the pathway of JNK-cJunN axis. DAP12 can recruit ZAP70 and Syk by its tyrosine receptor activation motifs, which can directly exert cytotoxic effect, or produce effector cytokines through PI3K and STAT5. Therefore, there are two signaling pathways, PI3K and Syk/ZAP70, in mice for NKG2D.

圖5 人源性NKG2D介導(dǎo)的信號通路Fig.5 Signal transduction pathway mediated by NKG2D in humanNote: When human NKG2D homodimer is combined with its ligands (MICA, MICB, ULBPs) and connects with DAP10 on the surface of the cell membrane, which makes DAP10 residues phosphorylate, and activates the downstream PI3K and the regulatory subunit P85. It promotes the increase of calcium influx and the release of granzyme. Otherwise, It further promotes cell proliferation by activated STAT5 signal transduction pathway. Cytotoxic effect is played through the pathway of JNK-cJunN axis.

慢性乙型肝炎免疫清除期，外周血和肝組織中NK的頻率和分布均明顯增加，尤其是NKG2D+NK細胞增加尤為明顯，可有效抑制病毒的復(fù)制，減少由HBV引起肝硬化、肝癌的風險[26]。NKG2D配體特異表達于腫瘤細胞，與NKG2D結(jié)合后可以觸發(fā)強烈的抗腫瘤效應(yīng)，提示NKG2D介導(dǎo)的途徑可能是治療癌癥的強有力的靶點[27]。

腎缺血-再灌注損傷(Renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)可導(dǎo)致急性腎功能衰竭，死亡率高達50%。NK細胞是早期天然免疫應(yīng)答的重要參與者，但其在腎小管上皮細胞(Tubular epithelial cell,TEC)損傷中的作用尚不清楚。Zhang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞可以殺死體外同系TEC，而TEC在體外凋亡死亡與其表面NKG2D配體早期視黃酸可誘導(dǎo)蛋白(Retinoic acid early transcript-1,RAE-1)上調(diào)以及NK細胞上的NKG2D表達有關(guān)。腎細胞制劑的FACS分析表明，在 IRI后腎臟內(nèi)NKG2D顯著增加，與RAE-1結(jié)合后增強NK細胞殺細胞效應(yīng)。但是在野生型C57BL/6小鼠模型中，NK細胞耗竭對其生存有利，因為NK細胞的過繼治療加重了NK、T和B細胞缺失的Rag2(-/-)gamma(c)(-/-)小鼠的IRI損傷。在某些疾病中，如腎缺血-再灌注損傷，NKG2D與配體結(jié)合后，活化NK細胞，增強殺腎小管上皮細胞效應(yīng)，可加重病情。

綜上所述，NKG2D是NK細胞表面最重要的活化性受體，其基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有多個功能位點。可通過激活PI3K、PLCγ2、JNK-cJunN等信號通路，使NK細胞TNF-α、IFN-γ、顆粒酶釋放分泌增加，F(xiàn)asL、TRAIL表達上調(diào)，在非宿主MHC限制條件下，發(fā)揮對腫瘤細胞的細胞毒性效應(yīng)。尤其在抗病毒感染、延緩癌癥進展、促進組織損傷等方面發(fā)揮重要作用[29-32]。