響應(yīng)面法優(yōu)化梔子中綠原酸的提取工藝

易夢(mèng)媛，鄧愛(ài)華，劉鳳英，王 云，謝 鵬，盧俊明，王 志

（1.湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南常德 415000；2.湖南文理學(xué)院芙蓉學(xué)院，湖南常德 415000；3.澧縣扶農(nóng)中藥材農(nóng)民專(zhuān)業(yè)合作社，湖南常德 415000）

0 引言

梔子（Gardenia jasminoides Ellis）作為我國(guó)傳統(tǒng)藥材，藥用價(jià)值廣泛[1-3]，主產(chǎn)于贛、鄂、閩、湘、浙等地[4-5]。綠原酸在梔子中作為有機(jī)酸脂類(lèi)物質(zhì)存在，其含量為0.003%~0.114%[6-7]，梔子可作為綠原酸的提取材料來(lái)源。綠原酸為極性有機(jī)酸，在常溫水中的溶解度為4%左右[8]，因此試驗(yàn)中選取極性較強(qiáng)的甲醇作為提取溶劑，摸索出梔子中提取綠原酸的最佳工藝條件，以期為梔子中綠原酸的提取提供理論依據(jù)和生產(chǎn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

梔子果，湖南廣源生物科技有限公司提供；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，北京盛世康普化工技術(shù)研究院提供；甲醇（AR），德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司提供；其他試劑（AR），國(guó)藥試劑提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平，賽多利斯有限公司產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥箱、中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)，上海安寧科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒儀器有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取1.3 mg的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液定容為100 mL，搖晃均勻，制成13 μg/mL 的母液。分別吸取 2，3，4，5，6，7，8，9，10 mL的母液于10 mL的容量瓶中加入50%甲醇定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度分別為2.6，3.9，5.2，6.5，7.8，9.1， 10.4，11.7，13 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以50%甲醇溶液為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)324 nm處測(cè)定吸光度。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C）、吸光度為縱坐標(biāo)（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.046C-0.017，R2=0.999 7，R接近于1，表明綠原酸質(zhì)量濃度在0.170~0.513 mg/mL時(shí)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

稱取2.0 g梔子粉末，在超聲功率70 W，超聲時(shí)間25 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶20，超聲溫度50℃的條件下，分別考查超聲功率40，50，60，70，80，90，100 W；超聲時(shí)間 15，20，25，30，35 min；甲醇體積分?jǐn)?shù)30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%；料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；超聲溫度40，50，60，70，80℃時(shí)對(duì)梔子果粉中綠原酸提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)

通過(guò)單因素試驗(yàn)得到影響綠原酸提取的3個(gè)主要因素超聲功率、超聲時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)，確定其水平值，并使用Design Expert（Version 8.0.6） 軟件對(duì)各因素及水平進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。以A，B，C分別表示超聲功率、超聲時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)，每個(gè)因素的高中低水平分別以1，0，-1編碼。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.2.4 樣品中綠原酸含量測(cè)定

將所得綠原酸提取液以轉(zhuǎn)速2 500 r/min離心8 min，取上層清液，用甲醇稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)324 nm處測(cè)定綠原酸的吸光度A324。以對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液為空白對(duì)照。綠原酸提取量η（mg/g） 按如下公式計(jì)算：

式中：n——稀釋倍數(shù)；

C——稀釋后綠原酸質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液總體積，mL；

m——干燥后梔子果實(shí)粉末的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響

超聲功率對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 超聲功率對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響

從圖1中可以看出，當(dāng)超聲功率為40~70 W時(shí)，綠原酸提取率隨著超聲功率的升高而不斷增加，在70 W時(shí)達(dá)到最高值。繼續(xù)增大超聲功率，綠原酸提取率下降，可能是過(guò)高的超聲功率導(dǎo)致綠原酸降解或其他雜質(zhì)被提取出來(lái)影響綠原酸提取效果。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響

從圖2中可以看出，15~20 min時(shí)綠原酸提取率上升最快，隨后在20~25 min內(nèi)有所減緩，至25 min時(shí)提取率達(dá)到最大值。之后，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)提取率反而下降，在30~35 min內(nèi)下降最快，可能是長(zhǎng)時(shí)間的加熱和超聲導(dǎo)致綠原酸這種不穩(wěn)定物質(zhì)受熱見(jiàn)光氧化分解及其他雜質(zhì)析出導(dǎo)致提取率下降[9]。所以，選擇提取效果最佳的25 min作為超聲時(shí)間。

2.1.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響

甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響

從圖3中可以看出，甲醇體積分?jǐn)?shù)在30%~50%時(shí)綠原酸提取率較低，變化不明顯；甲醇體積分?jǐn)?shù)在50%~70%時(shí)，綠原酸的提取率隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加而快速上升；在甲醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，綠原酸的提取量達(dá)最大（0.065 33 g）；而當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，提取率反而下降。可能是在低體積分?jǐn)?shù)甲醇溶劑浸提下，果實(shí)中的果膠和蛋白質(zhì)等黏稠狀雜質(zhì)容易浸出，體積分?jǐn)?shù)差較小，綠原酸的浸提效果不佳；在高體積分?jǐn)?shù)甲醇溶劑浸提下，提取率下降，可能是綠原酸結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)親水性羥基基團(tuán)，高體積分?jǐn)?shù)甲醇中含水量少，綠原酸的提取率因此而下降。所以，選擇70%甲醇體積分?jǐn)?shù)作為提取溶液。

2.1.4 料液比對(duì)梔子中綠原酸提取的影響

料液比對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響

從圖4中可以看出，在溶質(zhì)質(zhì)量不變的情況下綠原酸的提取率隨著溶劑的增加而增加，可能是隨著溶劑的增多綠原酸在甲醇中溶解的飽和度增高，固體與液體的接觸面積加大，梔子中的綠原酸能夠充分析出，增加了提取效果。

2.1.5 超聲溫度對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響

超聲溫度對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 超聲溫度對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響

從圖5中可以看出，超聲溫度在40~60℃時(shí)，綠原酸的提取率隨著溫度的升高上升明顯；60℃時(shí)綠原酸的提取率也達(dá)到最大值（0.049 57 g）；而當(dāng)超聲溫度為60~80℃時(shí)，綠原酸提取率下降明顯，甚至綠原酸提取率的下降率要高于在40~60℃時(shí)綠原酸提取率的上升率。從圖5曲線的變化趨勢(shì)中也可以看出超聲溫度的升高有利于綠原酸的提取，但過(guò)高的超聲溫度也會(huì)導(dǎo)致綠原酸產(chǎn)生水解和出現(xiàn)分子內(nèi)酯基遷移，異構(gòu)化成新綠原酸和隱綠原酸，進(jìn)而導(dǎo)致綠原酸的提取率下降[10]。所以，選擇提取效果最佳的60℃作為超聲溫度。

2.2 響面分析試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型

選取超聲功率、超聲時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素，對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 模型方程的建立及顯著性分析

在不同超聲功率、超聲時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)下測(cè)定的綠原酸提取率，利用Design Expert 8.0對(duì)表2中綠原酸提取率進(jìn)行多元線性回歸擬合。

綠原酸提取率回歸模型及其顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。

表3 綠原酸提取率回歸模型及其顯著性檢驗(yàn)

超聲功率、超聲時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù)與綠原酸提取率的多元二次回歸方程為：

式中：R——綠原酸提取率，%；

A——超聲功率，W；

B——超聲時(shí)間，min；

C——甲醇體積分?jǐn)?shù)，%。

2.2.3 綠原酸提取率的響應(yīng)面分析

利用Design Expert 8.0軟件結(jié)合不同超聲功率、超聲時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù)做出交互作用條件下的響應(yīng)面圖。

超聲時(shí)間與超聲功率對(duì)綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖6，甲醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率對(duì)綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖7，甲醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響見(jiàn)圖8。

圖6 超聲時(shí)間與超聲功率對(duì)綠原酸提取率的影響

圖7 甲醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率對(duì)綠原酸提取率的影響

圖8 甲醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

從圖6~圖8中可以看出，3個(gè)影響因子單獨(dú)對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響大小依次為超聲功率>甲醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間，而3個(gè)影響因子交互作用對(duì)梔子中綠原酸提取率的影響大小依次為超聲功率、甲醇體積分?jǐn)?shù)>超聲功率、超聲時(shí)間>甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間。從圖6中可以看出，在過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短的提取時(shí)間下綠原酸提取率都不高，但在高超聲功率下長(zhǎng)時(shí)間的提取有利于綠原酸的析出。從圖7中可以看出，在中等甲醇體積分?jǐn)?shù)和中等超聲功率下的綠原酸提取效果最佳。從圖8中可以看出，在過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的甲醇中綠原酸的提取率會(huì)下降，在中等甲醇體積分?jǐn)?shù)下短時(shí)間的提取有利于綠原酸的析出。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助甲醇提取綠原酸的最佳工藝參數(shù)為超聲功率72.87 W，超聲時(shí)間18.46 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)60.54%；在此條件下，綠原酸提取率為5.68%。超聲功率、超聲時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率影響的程度大小依次為超聲功率>甲醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間，3個(gè)影響因子交互作用對(duì)綠原酸提取率的影響程度大小依次為超聲功率、甲醇體積分?jǐn)?shù)>超聲功率、超聲時(shí)間>甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間。甲醇的極性和超聲波產(chǎn)生的超聲振蕩及空穴效應(yīng)有利于綠原酸的析出[11]，避免了綠原酸見(jiàn)光加熱易分解的問(wèn)題，縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率。