人參皂甙Rb1對機(jī)械通氣大鼠肺組織NF-κB和iNOs表達(dá)的影響

單鴛露 王良榮 葉玉柱 胡正楊

機(jī)械通氣被廣泛應(yīng)用于臨床，用于重癥患者和手術(shù)患者的生命支持，但機(jī)械通氣也會誘發(fā)加重肺損傷，即機(jī)械通氣肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）。研究表明，不合理的機(jī)械通氣尤其是大潮氣量機(jī)械通氣引起肺泡過度膨脹，造成肺組織氣壓傷和容積傷，破壞肺屏障功能，最終致炎癥介質(zhì)的釋放引起生物傷[1-2]。人參皂甙Rb1是人參中有效單體成分之一，具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[3]。本研究建立大鼠VILI模型，擬觀察人參皂甙Rb1對大潮氣量機(jī)械通氣大鼠肺組織炎癥和相關(guān)通路蛋白的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 SPF級成年雄性SD大鼠30只，體重300～350g[溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證編號：SYXK（浙）2010-0150]，動物實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組（C組）、VILI組和人參皂甙Rb1預(yù)處理組（Rb1組），每組10只。

1.2 主要試劑及儀器 人參皂甙Rb1（上海源葉生物科技有限公司）；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）。Trizol提取液（美國Life technologies公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（美國Fermentas Life Science公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參GAPDH（英國Abcam公司）；HX-300小動物呼吸機(jī)（成都泰盟有限公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；垂直電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 VILI模型的建立 3組大鼠予腹腔注射20%烏拉坦8ml/kg麻醉，暴露左股靜脈并置管用于輸液和給藥，暴露氣管，切開氣管。VILI組及Rb1組大鼠靜脈注射維庫溴銨（浙江仙居藥業(yè)）6mg/kg阻斷自主呼吸，并予氣管內(nèi)插入自制氣管導(dǎo)管，接HX-300小動物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣4h，建立VILI模型。通氣參數(shù)設(shè)定：潮氣量40ml/kg，呼吸頻率60次/min，吸呼比2∶3。Rb1組于機(jī)械通氣前30min靜脈注射人參皂甙Rb1 40mg/kg，C組和VILI組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。C組氣管切開后保留自主呼吸，未予機(jī)械通氣。

1.4 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測 4h后3組大鼠予頸動脈放血處死，迅速取出心臟和肺，結(jié)扎右肺門，4℃0.9%氯化鈉溶液左肺支氣管肺泡灌洗3次，收集肺泡灌洗液（BALF）5ml，并在 4℃下以 2 000r/min 離心10min，取上清液-70℃凍存待測，采用ELISA法測定BALF中TNF-α、IL-6水平，硝酸鹽還原酶法檢測NO水平。

1.5 肺組織濕/干重比（W/D）測定 取右肺上葉，用濾紙吸干肺組織表面水分稱重后為濕重（W），置于70℃恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱72h至恒重再稱重為干重（D），計算肺組織W/D，以反映肺水腫程度。

1.6 肺組織病理變化 右肺中葉于10%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，主要觀察有無肺水腫、肺泡與肺間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血，肺泡隔增厚程度及透明膜的形成。

1.7 肺組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOs）mRNA的檢測剩余左肺組織取50mg置于研缽加液氮研磨，用Trizol萃取總RNA，進(jìn)行RT-PCR對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，iNOs引物序列正鏈 5′-TAG AGG AAC ATC TGG CCA GG-3′反鏈 5′-TGG CCG ACC TGA TGT TGC CA-3′擴(kuò)增產(chǎn)物大小為255bp，內(nèi)參GAPDH引物序列正鏈5′AAC CCA TCA CCA TAT TCC AGG AGC-3′，反鏈 5′CAC AGT CTT CTG AGT GGC AGT GAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小350bp。RT-PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置：預(yù)變性95℃，5min；變性 95℃，30s；退火 57℃，30s；延伸 72℃ 30s；循環(huán)33次，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值與內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值的比值來表示基因表達(dá)水平。

1.8 肺組織NF-κB的測定 采用Western blot檢測。依照試劑盒說明書提取胞核蛋白，采用BCA法測定濃度。蛋白在10%SDS-PAGE中室溫電泳分離，300mA、70min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加一抗 NF-κB（稀釋度 1∶2000）抗體和 GAPDH（稀釋度1∶500）抗體，4℃孵育過夜，加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，膠片掃描拍攝圖像并進(jìn)行半定量分析，采用Image J測定目的條帶的吸光度值，并以目的蛋白和相應(yīng)內(nèi)參的吸光度值比值表示目的條帶相對強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用表示，組間比較采用單向方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnet′t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 組大鼠肺BALF中TNF-α、IL-6、NO水平及肺組織W/D的比較 與C組相比，VILI組和Rb1組BLAF中 TNF-α、IL-6、NO 水平均升高（均P＜0.05）；與 VILI組比較，Rb1組TNF-α、IL-6、NO水平均下降（均P＜0.05）。與C組比較，VILI組和Rb1組肺組織W/D比值升高（P＜0.05）；與VILI組比較，Rb1組肺組織W/D比值降低（P＜0.05）。見表 1。

表1 3組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、NO水平及肺組織W/D的比較

2.2 3組大鼠肺組織光鏡下顯微結(jié)構(gòu)改變 光鏡下C組無明顯肺損傷，肺部無水腫，肺泡隔均一、結(jié)構(gòu)清晰（圖1a，見插頁），VILI組可見明顯的肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)滲出水腫，肺間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡隔增寬，局灶的肺泡塌陷和肺不張，部分出現(xiàn)肺大泡（圖1b，見插頁）；Rb1肺組織損傷程度較VILI組緩解，肺泡隔輕度增寬，炎性細(xì)胞浸潤程度較VILI組明顯減輕（圖1c，見插頁）。

圖1 3組大鼠肺組織光鏡顯微結(jié)構(gòu)變化（a：C 組；b：VILI組；c：Rb1組；HE 染色，×200）

2.3 3組大鼠肺組織iNOs mRNA表達(dá)情況 與C組相比，VILI組和Rb1組肺組織iNOs mRNA表達(dá)增高（P＜0.05）；與VILI組比較，Rb1組肺組織iNOs mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組大鼠肺組織iNOs mRNA表達(dá)（與C組比較，*P＜0.05；與 VILI組比較，△P＜0.05）

2.4 3組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)情況 與C組相比，VILI組和Rb1組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)增加，與VILI組比較，Rb1組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖 3。

圖3 3組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)（與C組比較，*P＜0.05；與 VILI組比較，△P＜0.05）

3 討論

本次研究參照前期研究采用40ml/kg大潮氣量機(jī)械通氣4h建立大鼠VILI模型[4]，肺泡毛細(xì)血管通透性增加，炎性細(xì)胞浸潤，肺組織含水量顯著增加，證實(shí)VILI模型制備成功。而人參皂甙Rb1處理后機(jī)械通氣大鼠肺組織病理損傷明顯緩解，炎癥因子釋放減少，肺部微循環(huán)通透性損傷和肺水腫減輕。

研究表明，機(jī)械刺激（牽拉、剪切力）作用肺組織造成機(jī)械損傷，通過各種信號傳導(dǎo)途徑，觸發(fā)促炎細(xì)胞因子釋放和中性粒細(xì)胞的募集，形成瀑布級聯(lián)效應(yīng)，導(dǎo)致肺部炎癥甚至全身炎癥反應(yīng)，即“生物傷”[5]。NF-κB作為炎癥介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，在氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子，脂多糖等多種刺激下，NF-κB的激活和IkB-α的磷酸化，促使NF-κB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，調(diào)控多種促炎因子的轉(zhuǎn)錄，炎癥因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）、細(xì)胞黏附分子等表達(dá)增加，同時進(jìn)一步刺激NF-κB的活化[6]。既往研究表明NF-κB信號通路的激活在VILI的發(fā)病中起重要作用[7-8]，Held等[9]研究通過離體肺傷害性機(jī)械通氣證實(shí)過度通氣可刺激細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB活化。本研究也證明VILI大鼠肺組織 NF-κB活性較對照組明顯增加，炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6表達(dá)也顯著增加，表明機(jī)械通氣過程中NF-κB活化可能參與機(jī)械通氣后肺組織中致炎細(xì)胞因子合成釋放的調(diào)控過程。人參皂甙Rb1具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡等藥理作用。研究證明，Rb1通過抑制NF-κB的活性，改善腸缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷[10]。同樣研究證實(shí)，人參皂甙Rb1通過使炎癥反應(yīng)活性減弱和抑制NF-κB易位可顯著改善TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)Rb1預(yù)處理后，VILI大鼠的NF-κB活性降低，提示人參皂甙Rb1可能通過降低NF-κB活性，降低炎癥因子的表達(dá)，減輕VILI。

NO作為一種重要的炎癥介質(zhì)，參與多種疾病發(fā)病過程[哮喘，急性肺損傷（ALI）和循環(huán)休克]，主要由一氧化氮合酶（NOs）催化產(chǎn)生。在病理狀態(tài)下，由iNO催化產(chǎn)生大量的NO，不僅直接損傷組織細(xì)胞，還易產(chǎn)生氧自由基，并生成過氧亞硝酸陰離子（ONOO-），導(dǎo)致硝化應(yīng)激和組織損傷。Peng等[12]研究發(fā)現(xiàn)小鼠大潮氣量機(jī)械通氣后iNOs表達(dá)顯著增加，iNOs的表達(dá)改變及硝化應(yīng)激的激活與肺毛細(xì)血管通透性增加相關(guān)，同時在iNOs基因敲除小鼠機(jī)械通氣中，肺損傷加重，硝化應(yīng)激和肺毛細(xì)血管通透性顯著增加，更證明了iNOs在VILI中的直接作用。本研究結(jié)果表明大潮氣量長時間通氣后，大鼠肺組織iNOs轉(zhuǎn)錄活躍，NO表達(dá)增加，與上述研究結(jié)果一致。人參皂甙Rb1干預(yù)后，大鼠iNOs表達(dá)顯著降低。有研究表明NF-κB的激活不僅可增加趨化因子和細(xì)胞因子，同樣可增加iNOs的表達(dá)[13]。由此推斷，在機(jī)械通氣肺損傷大鼠，人參皂甙Rb1也可能通過降低NF-κB的活性，減少iNOs的表達(dá)，抑制促炎因子的釋放。

綜上所述，人參皂甙Rb1可降低NF-κB和iNOs的活性，減少炎性介質(zhì)釋放，減輕機(jī)械通氣誘導(dǎo)肺損傷。