NPM1 A型突變體對TGF-β1誘導K562細胞增殖及AKT磷酸化的影響*

吳正財 王成艷 吳香新 許昌聲 林敏輝

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）為一種高度異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機制涉及多種基因改變，核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM1）突變?yōu)樗柘蛋籽。╩yeloid leukemia，ML）最常見的基因突變，其NPM1 A 型突變體（NPM1 mutant A，NPM1 A）約占75%～80%［1-2］。研究證實，NPM1突變可下調(diào)抑癌蛋白ARF 的活性、增強癌蛋白c-myc 的穩(wěn)定性，促進細胞的惡性增殖［3-5］；動物體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，NPM1 突變可導致轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓組織異常增生［6］。研究發(fā)現(xiàn)，NPM1 突變后可促進胞質(zhì)內(nèi)細胞信號分子PI3K、ARF 和NF-kappa B 等發(fā)生移位，參與調(diào)控白血病細胞的惡性增殖和抵抗凋亡［4-7］。AKT為細胞增殖的重要調(diào)控分子，在轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1 作用下，發(fā)生磷酸化及細胞核移位，刺激下游信號分子表達，促進細胞增殖［8］。研究發(fā)現(xiàn)，AML患者白血病細胞過度增殖與AKT 分子磷酸化有關(guān)［9］。本研究通過體外感染攜帶NPM1 A 型突變體腺病病毒（Ad5－NPM1）K562細胞，觀察Ad5-NPM1 對TGF-β1 誘導的K562 細胞增殖及AKT磷酸化的影響，探討過表達NPM1突變蛋白的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 Ad5-NPM1-EGFP 腺病毒由上海吉凱基因化學技術(shù)公司構(gòu)建；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone 公司；TGF-β1 購自美國Sigma 公司；anti-NPM1 和anti-βactin 抗體及免疫印跡化學發(fā)光試劑均購自美國Santa Cruz 公司；anti-AKT 和anti-P-AKT 購自美國TSC公司；HRP 標記的Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；NPM1 ELISA 試劑盒購自上海Roche 公司。SW-CJ－IF 型超凈工作臺購自蘇州蘇凈集團；CO2細胞培養(yǎng)箱購自日本Sanyo 公司；超速低溫離心機Sigma-3K15 購自德國Sigma 公司；-70℃超低溫冰箱DW-86L386 購自青島海爾集團；Ⅸ70 型熒光相差倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；Mini-PROTEAN Tetra MP4 垂直電泳槽購自美國Bio-Rad 公司；DYCP-40C 型半干式碳板轉(zhuǎn)印儀槽購自北京六一儀器廠。

1.1.2 細胞培養(yǎng) 白血病細胞株K562由福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所提供，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d 將細胞培養(yǎng)液移至15 mL 離心管，300 g離心，棄上清，加10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)重懸細胞，按1∶3分裝培養(yǎng)，取3～5代細胞用于實驗。

1.2 方法

1.2.1 ELISA 法測細胞上清液NPM1 蛋白含量 準備好稀釋后的標準品和待測樣品，按Roche NPM1 ELISA 試劑盒說明書完成操作，于450 nm 處測定OD值，并根據(jù)標準品計算待測樣品濃度。

1.2.2 MTT法測細胞增殖 取3～5代K562細胞，300 g離心，0.2%FBS 1640培養(yǎng)基重懸細胞2×105cells/mL，接96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μL細胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細胞分為3 組：空白對照組（CT）、空載組（轉(zhuǎn)染Ad5-vector-100）、Ad5-NPM1 組，每組3 個復孔，轉(zhuǎn)染3 d 后加入TGF-β1干預24 h；干預完成后加入10μL/孔MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，300 g離心，棄上清，加入DMSO 100μL/孔，置搖床上低速振蕩10 min，于酶標儀490 nm處測定OD值。

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達水平 取3～5代K562細胞300 g離心，0.2%FBS 1640培養(yǎng)基重懸細胞2×105cells/mL，均勻接種于6 孔板中，每孔加入1 mL 細胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入不同處理因素（TGF-β1 或轉(zhuǎn)染NPM1 聯(lián)合處理）后，反復吹打細胞培養(yǎng)基數(shù)次，將細胞懸液移至1.5 mL EP管，300 g離心10 min，棄上清液，加1×SDS（200μL/管）混勻，冰上靜置10 min，收集混合液于EP 管中，迅速置于沸水中10 min。4℃，12 000 g離心10 min，取上清液，測定蛋白含量后，經(jīng)10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜。用TBST 漂洗3次，加入Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，洗膜后，滴加Luminol發(fā)光液，顯影，定影，掃描，White/Ultraviolet Transilluminator 凝膠成像系統(tǒng)分析，蛋白表達水平以目的蛋白與β-actin光密度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有計量資料以表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間兩兩比較使用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒載體Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染K562 細胞后熒光強度的變化

熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，K562 細胞胞質(zhì)熒光強度隨重組腺病毒載體Ad5-NPM1 感染復數(shù)（MOI：30～200）增加而增強，轉(zhuǎn)染第3 d后可見K562細胞胞質(zhì)有大量綠色熒光（圖1）。

2.2 Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染K562 細胞（3 d）后NPM1 蛋白表達水平的變化

Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細胞（3 d）后提取蛋白，進行Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)：空白對照組（CT）與空載組（Ad5-vector-100）之間NPM1蛋白水平無顯著差異（P＞0.05）；NPM1蛋白表達水平呈Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染復數(shù)（MOI：30～100）依賴性增加，與Ad5-vector-100組相比，Ad5-NPM1-30組和Ad5-NPM1-100組NPM1蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.01），Ad5-NPM1-200組和Ad5-NPM1-100組NPM1表達水平無顯著性差異（P＞0.05，圖2）。后續(xù)選擇Ad5-NPM1-100為實驗條件。

2.3 Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細胞（3天）后細胞上清液NPM1蛋白含量的變化

為進一步測定感染效率，本研究提取細胞上清液行NPM1 ELISA實驗。發(fā)現(xiàn)空白對照組（CT）與空載組（Ad5-vector-100）NPM1蛋白含量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；K562細胞上清液的NPM1水平呈Ad-NPM1轉(zhuǎn)染復數(shù)依賴性增加（r=0.92），與CT組相比，Ad-NPM1-30組和Ad-NPM1-100組的NPM1蛋白含量顯著增加（P＜0.01），Ad-NPM1-200組和Ad-NPM1-100組NPM1蛋白水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖1 Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細胞（3 d）熒光顯微鏡觀察（物鏡×10）

圖2 Western blot檢測Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細胞（3 d）NPM1蛋白表達

圖3 ELISA法測Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細胞上清液NPM1蛋白含量

2.4 TGF-β1（10 ng/mL）對K562 細胞AKT、P-AKT水平的影響

Western blot 法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠時間依賴性誘導K562細胞AKT 蛋白磷酸化，其磷酸化水平在作用30 min 后即明顯增加，45 min 達到峰點，但對總AKT水平無顯著影響（圖4）。

2.5 Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染對TGF-β1 誘導的K562 細胞AKT、P-AKT的影響

K562細胞轉(zhuǎn)染Ad5-vector或Ad5-NPM1 3天后，TGF-β1（10 ng/mL）處理45 min，提取蛋白進行Western blot法檢測。結(jié)果顯示與空白對照組（CT）相比，TGFβ1刺激可顯著增加K562細胞的P-AKT水平；與TGFβ1（10 ng/mL）組相比，TGF-β1+Ad5-Vector-100組PAKT水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而TGF-β1+Ad5-NPM1-100組的P-AKT水平則顯著增加（P＜0.05），各組總AKT水平未見顯著差異（P＞0.05，圖5）。

圖4 Western blot 法檢測TGF-β1（10 ng/mL）誘導K562細胞AKT、PAKT的影響

2.6 Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染對TGF-β1誘導的K562細胞增殖的影響

K562細胞轉(zhuǎn)染Ad5-vector或Ad5-NPM1 3天后，TGF-β1（10 ng/mL）處理24 h，行MTT實驗，結(jié)果顯示空白對照組（CT）與空載組（Ad5-vector-100）間細胞增殖無顯著性差異（P＞0.05）；與Ad5-vector-100組相比，TGF-β1+Ad5-vector-100 組細胞增殖顯著增高（P＜0.01）；TGF-β1+Ad5-NPM1-100組細胞增殖顯著高于TGF-β1+Ad5-vector-100組（P＜0.01，圖6）。

圖5 Western blot 法檢測Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染對TGF-β1（10 ng/mL）誘導K562細胞AKT、P-AKT的影響

3 討論

NPM1為一種重要的核磷蛋白，其參與多種細胞生物過程。體外實驗證實NPM1 突變體蛋白可下調(diào)抑癌蛋白ARF 的活性、增強癌蛋白c-myc 的穩(wěn)定性，增強對細胞刺激因子反應(yīng)性，促進細胞的過度增殖［4］。Falini 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在AML 患者中常伴有NPM1 突變，體外細胞實驗也發(fā)現(xiàn)伴有NPM1 突變體白血病細胞對TGF-β1 誘導增殖能力明顯增強，PI3K/AKT信號通路活性也顯著升高，提示患有NPM1突變的白血病患者可能通過增強PI3K/AKT信號通路促進白血病細胞增殖效應(yīng)。本研究旨在探究NPM1突變在生長因子作用下對ML 細胞株K562 增殖的影響。首先將攜帶NPM1 A 型突變體的腺病毒載體轉(zhuǎn)染K562 細胞建立過表達NPM1 蛋白的K562 細胞株。Western blot 與ELISA 的檢測結(jié)果均顯示，Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細胞3 d后細胞NPM1蛋白表達水平顯著增加，提示通過攜帶NPM1A 型突變體基因腺病毒載體轉(zhuǎn)染可成功建立過表達NPM1蛋白的K562細胞株。

圖6 MTT 法檢測Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染（MOI=100）對TGF-β1（10 ng/mL）K562細胞增殖的影響

TGF-β1為一種重要腫瘤細胞刺激分子，其可誘導細胞增殖和分化，Hamilton 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，AKT 作為細胞增殖重要調(diào)控分子，在生長因子作用下，AKT發(fā)生磷酸化，促進細胞增殖效應(yīng)。本研究采用10 ng/mL的TGF-β1短時間處理K562細胞，發(fā)現(xiàn)TGF-β1能有效增加AKT 的磷酸化水平，結(jié)果提示在K562細胞中TGF-β1 可能通過調(diào)控AKT 磷酸化水平來誘導生長。隨即檢測過表達NPM1 蛋白K562 細胞株中，過表達NPM1 對TGF-β1 誘導P-AKT 的影響，發(fā)現(xiàn)與TGF-β1（10 ng/mL）組相比，轉(zhuǎn)染Ad5-NPM1 的K562細胞能進一步增加TGF-β1（10 ng/mL）誘導的AKT磷酸化水平。MTT 結(jié)果也顯示過表達NPM1 蛋白可明顯促進TGF-β1誘導的K562細胞增殖。

綜上所述，NPM1 A 型突變體可增強TGF-β1 對K562 細胞誘導的增殖能力，且與AKT 磷酸化水平有關(guān)。