白藜蘆醇通過Akt/mTOR通路上調自噬改善輻射誘導小腸損傷

李博 張恒 周曼倩 朱思偉 王華慶 張詩武 王輝

放射治療是惡性腫瘤重要的治療手段，腹盆腔惡性腫瘤病人在接受放射治療中，可因輻射誘導小腸損傷而出現(xiàn)放射性腸炎，對惡性腫瘤病人的生活質量造成嚴重影響，但目前臨床上缺乏有效的防護藥物[1]。一些研究[2－3]表明電離輻射可以導致細胞處于持續(xù)氧化應激狀態(tài)從而下調小腸細胞自噬水平，影響細胞的自我調節(jié)及保護功能。白藜蘆醇是一種天然非黃酮多酚類化合物[4]，前期研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗氧化、抗衰老等作用，對小鼠具有放射防護作用[5－6]。白藜蘆醇可以活化沉默信息調節(jié)因子2相關酶1（SIRT1），同時可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和肝激酶 B1（LKB1）從而抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的活性[7]。但白藜蘆醇能否通過抑制Akt/mTOR通路調控小腸隱窩細胞自噬發(fā)揮放射防護作用尚未見報道。本項研究擬在前期工作的基礎之上深入研究白藜蘆醇對小腸輻射損傷防護作用的機制，為開發(fā)相關防護藥物提供基礎數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6雄性小鼠（SPF級）24只，體質量24～26 g，8周齡 [購自中國食品藥品檢定研究院，許可證號：SCXK（京）2014－0013]。 隨機分為對照組、照射組及照射給藥組，每組各8只。白藜蘆醇用無水乙醇助溶配置成母液，避光4℃保存，給藥前用生理鹽水稀釋。照射給藥組小鼠于照射前3 d至照射后3 d每日腹腔注射（50 mg/kg）；對照組和照射組給予同等體積生理鹽水腹腔注射。參考相關研究[8－9]，照射組及照射給藥組小鼠均接受6MV－X射線全身照射，單次劑量9.0 Gy。小鼠于照射后3.5 d脫頸處死，取部分小腸組織用中性甲醛固定24 h后脫水制作石蠟塊，再取部分新鮮小腸組織予以研磨。

1.2 主要試劑 白藜蘆醇（R5010）購自美國Sigma公司，Ki67（ab15580）兔源多克隆抗體購自Abcam公司 （美國），p－Akt （4060） 兔源單克隆抗體、Akt（4691）兔源單克隆抗體、p－S6R P（5364）兔源單克隆抗體、S6RP（2217）兔源單克隆抗體、LC3A/B(12741)兔源單克隆抗體、GAPDH（5174）兔源單克隆抗體和羊抗兔二抗 （7040）均購于Cell Signaling Technology公 司 （美 國 ），Beclin1兔 來 源 多 抗（11306－1－Ap）購于 Proteintech 公司（中國），蛋白提取試劑購自于Thermo公司（美國），免疫組織化學通用SP試劑盒（SP－9000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 組織學分析 由小鼠空腸組織制作的石蠟塊經切片為5μm后行HE染色，于鏡下分析。每只小鼠至少測量30根小腸絨毛長度，至少計數(shù)50個完整小腸隱窩中的隱窩細胞總數(shù)，計數(shù)每只小鼠10個小腸橫斷面中隱窩數(shù)目，所有數(shù)據計算平均值。采用SP兩步法行免疫組織化學染色，檢測小腸組織內Ki67表達情況，鏡下每只小鼠至少計數(shù)60個完整小腸隱窩的陽性細胞數(shù)及隱細胞總數(shù)并計算平均值，統(tǒng)計小腸隱窩細胞Ki67表達陽性率。

1.4 蛋白印跡檢測相關蛋白 取新鮮空腸組織100 mg勻漿后提取小腸組織總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，等量上樣，分別用10%和15%的SDS－PAGE凝膠電泳分離，蛋白轉膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶封閉后選取最佳濃度一抗 （p－Akt，1∶2 000；Akt，1∶1 000；p－S6RP，1∶1 000；S6RP，1 ∶1 000；LC3A/B，1 ∶1 000；GAPDH，1 ∶1 000；Beclin 1，1∶1 000）4℃孵育過夜， 洗膜后用辣根標記的二抗（1∶3 000）孵育 2 h，洗膜后 ECL化學發(fā)光法顯影，Bio－rad全自動凝膠成像系統(tǒng)顯影拍照，采用Image J 1.4軟件 （National Institutes of Health公司，美國）對條帶分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。采用Kolmogorov－Smirnov法對數(shù)據行正態(tài)分布檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示。多組間比較采用ANOVA方差分析，方差齊時用LSD-t法，方差不齊用 Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 組織病理學檢測結果比較 與對照組相比，照射組和照射給藥組的小鼠小腸絨毛長度、單個橫斷面隱窩數(shù)、小腸隱窩細胞總數(shù)及Ki67陽性率均顯著下降（均P＜0.05）；照射給藥組小鼠上述數(shù)據均高于照射組（均P＜0.05），詳見表1。各實驗組小腸組織病理切片HE染色見圖1A，Ki67免疫組織化學染色結果見圖1B。

表1 3組小鼠組織病理學結果比較

圖1 3組小鼠小腸組織HE染色及Ki67免疫組織化學染色 （A1－A3：HE染色，×100。B1－B3：SP兩步法Ki67免疫組織化學染色，×200；染色呈棕色細胞為Ki67表達陽性）。A1、B1圖為對照組，小腸各級結構正常，絨毛完整，隱窩排列整齊，大部分隱窩細胞為Ki67陽性。A2、B2圖為照射組，小腸黏膜水腫，隱窩結構紊亂，絨毛脫落，Ki67陽性隱窩細胞較少。A3、B3圖為照射給藥組，小腸絨毛及隱窩結構較照射組完整，Ki67陽性隱窩細胞較照射組增加。

2.2 小腸Akt/mTOR通路活性比較 照射組和照射給藥組p－Akt、p－S6RP相對表達量均高于對照組（t=21.535，t=10.593，均 P＜0.001），照射給藥組p－Akt、p－S6RP 相對表達量低于照射組（t=－11.521，t=－6.468，P＜0.001），見表 2。 Akt/mTOR 通路相關蛋白的相對表達情況見圖2。

2.3 自噬相關蛋白水平比較 照射組LC3－II、Beclin1相對表達量低于對照組（t=－15.131，t=－27.588，均P＜0.001）和照射給藥組（t=21.315，t=－14.774，均 P＜0.001），見表 2。3組小鼠小腸自噬相關蛋白 LC3－II、Beclin 1的表達情況見圖3。

表2 3組小鼠小腸組織中相關蛋白相對表達量比較

圖2 3組小鼠小腸組織Akt/mTOR通路相關蛋白表達情況（A圖，蛋白電泳圖；B圖，p－Akt/Akt相對表達量柱狀圖；C 圖，p－S6RP/S6RP 相對表達量柱狀圖；*P＜0.05）。

3 討論

放射性腸炎是腹盆腔惡性腫瘤放射治療的常見并發(fā)癥，主要因長期大劑量射線導致小腸的組織結構被破壞而誘發(fā)。研究[2]發(fā)現(xiàn)程序性細胞死亡——自噬，對小腸輻射損傷具有重要的調控作用。當處于正常水平時，細胞內的自噬有利于清除細胞內受損或者多余細胞成分，從而維持細胞應激情況下的營養(yǎng)及能量供應[11]，然而過度激活的自噬則會導致組織損傷，因此根據激活的程度和種類不同，自噬對機體可發(fā)揮促進保護或誘導損傷的雙向作用[12]，但其機制尚未完全探明。由于電離輻射可導致小鼠小腸細胞的持續(xù)氧化應激，進而下調自噬相關通路的活性，從而造成小腸損傷。mTOR是PI3K/Akt信號傳導通路中的重要環(huán)節(jié)，可整合營養(yǎng)、能量及生長因子等多種細胞外信號，調控細胞存活、生長、蛋白質合成、增殖和自噬等過程[13]。在Akt信號的調節(jié)下，mTOR可抑制Atg13和Atg1結合形成自噬體，從而抑制自噬體膜的形成，抑制自噬[14]。

有研究[4,10]表明，白藜蘆醇具有抗氧化、抗衰老作用，可以有效改善輻射誘導的小鼠骨髓功能抑制、免疫系統(tǒng)損傷；白藜蘆醇可活化SIRT1，同時可以通過激活AMPK和LKB1來抑制mTOR的活性[7]。在此基礎上，本研究探討了白藜蘆醇能否通過抑制Akt/mTOR通路調控小腸隱窩細胞的自噬，而對小腸輻射損傷發(fā)揮防護作用。

本研究結果顯示，小鼠接受9 Gy劑量的X射線全身照射后，可觀察到小腸隱窩細胞數(shù)量減少和增殖能力降低、小腸絨毛損傷；在接受相同劑量X線照射的情況下，與照射組相比，白藜蘆醇持續(xù)干預使小鼠的小腸絨毛長度、隱窩細胞數(shù)目、單個橫斷面隱窩數(shù)及隱窩細胞Ki67陽性率均顯著增加，說明白藜蘆醇可有效改善電離輻射導致的小腸損傷。

與照射組小鼠相比，白藜蘆醇干預后的受照射小鼠小腸組織的p－Akt、p－S6RP表達下降，說明白藜蘆醇抑制了受照小鼠小腸組織Akt/mTOR通路活性。白藜蘆醇干預后受照射小鼠小腸組織自噬相關的標志性蛋白LC3－Ⅱ、Beclin1表達較照射組小鼠增加，提示白藜蘆醇可上調受照小鼠小腸細胞的自噬水平，而自噬水平的適當上調有助于細胞的防護作用[15]。本研究結果提示，白藜蘆醇可對小腸輻射損傷發(fā)揮防護作用，其改善小腸輻射損傷的機制可能是通過mTOR依賴途徑調節(jié)小腸細胞的自噬水平，而上調后的自噬作用為受照小腸隱窩細胞提供營養(yǎng)及能量供應，改善了其增殖能力。

本研究表明，白藜蘆醇通過Akt/mTOR途徑對自噬水平的適度調控可能是其改善小腸輻射損傷的關鍵機制，今后的輻射損傷防護相關研究中，如何適度調控自噬可作為進一步研究的方向。由于自噬復雜的調控機制尚未探明，白藜蘆醇上調小腸細胞自噬水平的過程，是否還有mTOR以外的途徑參與有待進一步研究。此外，電離輻射可導致小腸的急性損傷與慢性損傷，兩者具有不同的分子機制[1]。本的僅局限于輻射誘導小腸急性損傷進行研究，在慢性損傷中白藜蘆醇是否具有相同的防護機制仍有待研究。

圖3 3組小鼠小腸組織自噬相關蛋白表達情況 （A圖，蛋白電泳圖；B圖，LC－3II蛋白相對表達量柱狀圖；C圖，Beclin1蛋白相對表達量柱狀圖，*P＜0.05）。