半夏瀉心湯對(duì)衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善及分子機(jī)制*

彭 旭 張曉梅 何學(xué)令 劉 艷

(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，成都 610041)

人在自然衰老過(guò)程中，隨著年齡的增長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)記憶力減退、反應(yīng)遲鈍、認(rèn)知功能下降等腦功能障礙癥狀。學(xué)習(xí)記憶是大腦的重要功能之一，而學(xué)習(xí)記憶的作用機(jī)制與中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT密切相關(guān)，它們之間相互制約且處于一種平衡狀態(tài)[1]。半夏瀉心湯(BXT)源自張仲景《傷寒雜病論》，本方攻補(bǔ)兼施、升降并用，其辛開(kāi)、苦降、甘補(bǔ)的組方配伍，一直以來(lái)是基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的熱點(diǎn)復(fù)方之一[2]。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，BXT及其拆方可通過(guò)影響脾虛大鼠下丘腦中NE、DA、5-HT神經(jīng)遞質(zhì)的水平，調(diào)節(jié)大鼠的脾胃功能[3]。渡邊雄泰[4]等研究表明BXT對(duì)應(yīng)激性潰瘍不僅直接作用于消化系統(tǒng)，而且通過(guò)介導(dǎo)腦內(nèi)情感系統(tǒng)的中樞抑制作用而發(fā)揮治療效果。張忠等[5]研究BXT及其拆方對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍大鼠膽堿能神經(jīng)元的影響，結(jié)果顯示BXT全方組及各拆方組除作用于胃黏膜本身引起胃黏膜本身分泌改變之外，還影響到腦的分泌功能。上述研究表明，BXT的作用機(jī)制與腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)有一定的關(guān)系。此外，根據(jù)中醫(yī)理論，BXT是辛開(kāi)苦降的代表方劑，對(duì)梳理脾胃氣機(jī)之升降，調(diào)節(jié)全身氣機(jī)之運(yùn)行，非常合乎老年人精氣不足的體質(zhì)特點(diǎn)，因此推測(cè)BXT對(duì)于抗衰老有一定的作用。本研究旨在分子水平上研究半夏瀉心湯對(duì)衰老大鼠大腦海馬區(qū)Ach、NE、DA、5-HT受體mRNA表達(dá)的影響，對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠120只，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量(400±20)g，15月齡。另取10只SD大鼠，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量(200±100)g，6月齡，作為壯年對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2013-19；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2015-185。

1.2 藥品與試劑

根據(jù)《傷寒論》BXT全方組成為半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，炙甘草9 g，大棗4枚。以上中藥飲片均購(gòu)于四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，大棗自配。用蒸餾水常規(guī)煎煮2次，加熱濃縮成每1 mL提取液中含1 g生藥，置4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ級(jí)A甲片(河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):130904)使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配成0.3%的溶液備用。D-半乳糖(上海金穗生物科技有限公司)；Trizol(Ambion公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；CHRM1、DRD2、HTR1a、ADRA2a基因引物(成都寶信生物有限公司)；一抗，二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒[基因科技(上海)有限公司]。

1.3 儀器設(shè)備

MultiGene Optimax PCR儀(Labnet)；JY600C電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；超純水系統(tǒng)(Milipore)；顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(Olympus)；切片機(jī)(Leica)；Autostainer 480 s全自動(dòng)免疫組化儀(Thermo)；Y型水迷宮(自制)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1大鼠衰老模型建立：將120只15月齡大鼠進(jìn)行Y型水迷宮測(cè)試，記錄大鼠平均逃避潛伏期(從入水起點(diǎn)至尋找到階梯出水的時(shí)間)和正確反應(yīng)次數(shù)(以10 s內(nèi)直接抵達(dá)平臺(tái)為正確反應(yīng))[6]，每次測(cè)定時(shí)間為2 min，2min后仍未找到安全通道者以120 s計(jì)算。每只大鼠每天訓(xùn)練2次，共訓(xùn)練2 d。獲得性訓(xùn)練結(jié)束后，正式進(jìn)行測(cè)試，每只鼠每天測(cè)試1次，共3 d。

根據(jù)大鼠的逃避潛伏時(shí)間由高到低，篩選出學(xué)習(xí)記憶能力明顯較弱的動(dòng)物50只，隨后在大鼠頸部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg體質(zhì)量[7]，每天1次，連續(xù)給藥4周。4周后再次進(jìn)行Y型水迷宮測(cè)試，未通過(guò)測(cè)試大鼠，即為老齡模型大鼠。

1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：將老齡模型大鼠隨機(jī)平均分為5組，根據(jù)治療藥物類型和劑量，分別為老齡對(duì)照組(生理鹽水)、石杉?jí)A甲組(作為藥物治療的陽(yáng)性對(duì)照組)、BXT高劑量組、BXT中劑量組、BXT小劑量組。另選10只6月齡正常大鼠作為壯年對(duì)照組。

BXT組大鼠根據(jù)不同BXT劑量進(jìn)行灌胃給藥，BXT高劑量組10 mL/kg、中劑量組5 mL/kg、低劑量組2.5 mL/kg，石杉?jí)A甲組30 mg/kg體質(zhì)量，壯年對(duì)照組和老齡對(duì)照組灌胃生理鹽水10 mL/kg。大鼠每周測(cè)體質(zhì)量一次，按體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，連續(xù)給藥6周。

1.4.3病理學(xué)及免疫組化檢測(cè)：行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，各組大鼠放入4%異氟烷的誘導(dǎo)盒中進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉。大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后迅速取出，并行眼眶放血處死，打開(kāi)頭蓋骨，迅速取出腦組織，于冰上剝離左側(cè)大腦皮層和海馬，置于4%多聚甲醛中固定。將腦組織塊冠狀位連續(xù)切片，片厚5 μm。每隔5張取1張，每例動(dòng)物相鄰切片分為3套，每套各5張，選取其中一套進(jìn)行常規(guī)HE染色，樹(shù)脂封片，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。另一套采用Envision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.5 Real-time PCR 檢測(cè)Ach、NE、DA、5-TH受體mRNA表達(dá)

根據(jù)GenBank的序列，用Goldkey軟件分別設(shè)計(jì)CHRM1、DRD2、HTR1a、ADRA2a基因的引物。根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，然后根據(jù)Thermo的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：

CHRM1上游引物5’-ATACAGTCAAGAGGC CCACC-3’；

下游引物5’-AGGAACACAGTCCTTGCAGA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度218 bp；

DRD2 上游引物5’-AAACCCGGACCTCC CTTAAG-3’；

下游引物5’-AGAGGACTGGTGGGATGTTG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度113 bp；

HTR1a 上游引物5’-ACCTCTCTGTTGCTG GGTAC-3’；

下游引物5’-CGATAAACAGGTCGCAGGTG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度719 bp；

ADRA2a上游引物5’-TTGGCCTTGTCGCGAT ATTG-3’；

下游引物5’-CCAGGGGACAGTTACCAGTT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度75 bp；

1.6 圖像分析及數(shù)據(jù)處理

使用Olympus顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)對(duì)海馬區(qū)Ach、NE、DA、5-TH受體陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行采圖。應(yīng)用凝膠成像分析軟件Gel-Pro-analyzer4.0分析受體和內(nèi)參β-Actin的灰度值，并用GraphPad Prism軟件做柱狀圖進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 Y型水迷宮檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

造模后，老齡對(duì)照組大鼠在Y型水迷宮中的逃避潛伏期較壯年對(duì)照組明顯延長(zhǎng)；與老齡對(duì)照組比較，在訓(xùn)練后24 h、48 h和96 h，各劑量BXT給藥組均能明顯縮短衰老大鼠逃避潛伏期，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 海馬區(qū)病理形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)各組大鼠海馬區(qū)組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖2所示。壯年對(duì)照組海馬組織各區(qū)顯示清晰，神經(jīng)元細(xì)胞豐富，數(shù)量較多，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，核大而圓，核仁明顯，可見(jiàn)少量小膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)纖維清晰；老齡對(duì)照組可見(jiàn)海馬各區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞不同

圖1 BXT對(duì)大鼠逃避潛伏期的影響Fig.1 Effect of BXT on escape latency of rats

程度減少，出現(xiàn)神經(jīng)元萎縮(紅色神經(jīng)元)，小膠質(zhì)細(xì)胞增生、血管套以及噬神經(jīng)現(xiàn)象；BXT高劑量組和石杉?jí)A甲組海馬神經(jīng)元損傷均有所改善，改善程度基本相同，但BXT中劑量組和低劑量組同老齡對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯改善。

圖2 海馬區(qū)HE染色觀察(×200)注：a：老齡對(duì)照組；b：石杉?jí)A甲組；c：壯年對(duì)照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.2 HE staining of hippocampus(×200)Note:a:aging control group;b:huperzine A group;c:strong control group; d:BXT low dose group,e:BXT medium dose group;f:BXT high dose group

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

對(duì)大鼠海馬區(qū)組織進(jìn)行免疫組化染色，各組大鼠海馬區(qū)DRD2、CHRM1、HTR1α、ADRA2α的表達(dá)和分布情況如圖3～6所示。椎體細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了深棕色的陽(yáng)性細(xì)胞染色反應(yīng)，而椎體細(xì)胞周圍未見(jiàn)其他細(xì)胞有著色。從形態(tài)結(jié)構(gòu)看，壯年對(duì)照組海馬區(qū)椎體細(xì)胞染色數(shù)量多且顏色深，排列緊密整齊，層次結(jié)構(gòu)明顯；老齡對(duì)照組海馬區(qū)椎體細(xì)胞染色數(shù)量少且顏色很淺，排列疏松，細(xì)胞間隙較大，層次結(jié)構(gòu)不明顯；BXT高劑量組和石杉?jí)A甲組椎體細(xì)胞染色數(shù)量和顏色以及排列緊密度介于壯年對(duì)照組和老齡對(duì)照組之間，對(duì)受體的表達(dá)有明顯的增強(qiáng)作用，結(jié)構(gòu)層次也有改善，這說(shuō)明高劑量BXT對(duì)海馬區(qū)的損傷有一定的保護(hù)作用，保護(hù)程度與石杉?jí)A甲組類似，但中劑量組和低劑量組椎體細(xì)胞的陽(yáng)性反應(yīng)程度與老齡對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差異。

2.4 BXT對(duì)大鼠海馬區(qū)CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α mRNA表達(dá)的影響

mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，BXT低劑量組和中劑量組的CHRM1、DRD2、ADRA2α mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于大劑量組，而HTR1α mRNA相對(duì)表達(dá)量在BXT各組中表達(dá)量差異不明顯；壯年對(duì)照組的CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其余五組，而老齡對(duì)照組偏低，尤其在CHRM1和HTR1α mRNA表達(dá)量上顯著低于其它組。見(jiàn)圖7和圖8。

圖3 海馬區(qū)DRA2表達(dá)情況(深棕色，×200)注：a：老齡對(duì)照組；b：石杉?jí)A甲組；c：壯年對(duì)照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.3 Expression of DRA2 in hippocampus (dark brown,×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group;d:BXT low dose group; e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

圖4 海馬區(qū)CHRM1表達(dá)情況(×200)注：a：老齡對(duì)照組；b：石杉?jí)A甲組；c：壯年對(duì)照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.4 Expression of CHRM1 in hippocampus(×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group; d:BXT low dose group;e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

圖5 海馬區(qū)ADRA2α表達(dá)情況(×200)注：a：老齡對(duì)照組；b：石杉?jí)A甲組；c：壯年對(duì)照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.5 Expression of ADRA2α in hippocampus (dark brown,×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group; d:BXT low dose group;e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

圖6 海馬區(qū)HTR1α表達(dá)情況(×200)注：a：老齡對(duì)照組；b：石杉?jí)A甲組；c：壯年對(duì)照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.6 Expression of HTR1α in hippocampus(×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group; d:BXT low dose group;e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

圖7 海馬區(qū)DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA表達(dá)的影響注：a：BXT低劑量組；b：BXT中劑量組；c：BXT高劑量組； d：石杉?jí)A甲組；e：壯年對(duì)照組；f：老齡對(duì)照組Fig.7 Expression of DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA in hippocampusNote: a:BXT low dose group; b:BXT medium dose group; c:BXT high dose group;d: Huperzine A group; e: Strong control group;f: Aging control group

圖8 海馬區(qū)DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA in hippocampus

3 討論

哺乳動(dòng)物隨著年齡的增加，海馬區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能以及一些相關(guān)蛋白質(zhì)分子發(fā)生改變，被認(rèn)為是海馬功能衰退的基礎(chǔ)。在本次實(shí)驗(yàn)中通過(guò)大鼠行為學(xué)試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)高劑量BXT治療過(guò)的老年大鼠能夠明顯縮短逃避潛伏期，與老齡對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01)。HE染色和免疫組化染色結(jié)果都顯示，BXT大劑量組的海馬區(qū)受損的神經(jīng)元也有所改善。這提示BXT對(duì)老年鼠的海馬區(qū)受損部位有一定程度的改善作用。

NE在記憶保持方面起重要作用，而改善記憶與促進(jìn)DA的釋放有關(guān)，5-HT則與精神活動(dòng)、感覺(jué)體溫調(diào)節(jié)、高級(jí)認(rèn)知功能有關(guān)。當(dāng)機(jī)體逐漸衰老后，腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)亦發(fā)生代謝紊亂，表現(xiàn)為NE、DA和5-HT含量下降，其含量下降是造成學(xué)習(xí)記憶能力減退的重要原因[6，8]。陳喬等用放射自顯影方法研究表明，老年大鼠大腦皮質(zhì)及海馬部位CHRM1密度顯著低于壯年對(duì)照鼠，并提出這3個(gè)腦區(qū) CHRM1受體密度的降低可能是衰老時(shí)學(xué)習(xí)、記憶、聯(lián)想、認(rèn)知等功能障礙的重要機(jī)制之一[9]。Wilkerson and Levin[10]研究發(fā)現(xiàn)，腹側(cè)海馬注入DRD2激動(dòng)劑可提高大鼠工作記憶的能力，相反注入DRD2受體拮抗劑則降低工作記憶的能力，故提示了DRD2參與記憶功能。梁發(fā)權(quán)和呂寶璋[11]采用放射性配基結(jié)合分析法發(fā)現(xiàn)老年大鼠(36月齡)大腦皮質(zhì)中5-HT受體的數(shù)目較成年大鼠(3月齡)明顯減少，提示老年鼠中樞5-HT系統(tǒng)的功能降低，可能與老年期的一些表現(xiàn)如記憶力衰退、睡眠障礙有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組的CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α mRNA表達(dá)明顯弱于壯年組，甚至出現(xiàn)一些無(wú)表達(dá)現(xiàn)象，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果是一致的，衰老時(shí)會(huì)出現(xiàn)中樞學(xué)習(xí)、記憶力以及認(rèn)知等功能的下降，這與大腦海馬區(qū)Ach、NE、DA、5-TH受體mRNA表達(dá)下降的現(xiàn)象有密切關(guān)系。

石杉?jí)A甲是一種強(qiáng)效的可逆性膽堿酯酶抑制劑，并可增強(qiáng)大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞，其增強(qiáng)突觸傳遞作用與M型乙酰膽堿受體激動(dòng)有關(guān)[12]。BXT高劑量組與石杉?jí)A甲組的CHRM1、DRD2、ADRA2α mRNA表達(dá)趨于一致性，這說(shuō)明高劑量BXT對(duì)海馬區(qū)的損傷有一定的保護(hù)作用，保護(hù)程度與石杉?jí)A甲組類似。另外，有研究報(bào)告表明膽堿酯酶抑制劑通過(guò)M1型膽堿能受體能夠使行為大鼠CA1區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)[13-14]。在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯給藥組可明顯上調(diào)腦組織膽堿能受體M1的表達(dá)[15-16]，故我們推測(cè)BXT抗衰老的作用機(jī)制與CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α基因表達(dá)有關(guān)，BXT可以激活其mRNA的表達(dá)，從而對(duì)衰老大鼠腦組織中Ach、NE、DA、5-TH起到一定的調(diào)節(jié)作用。由于中藥的作用是多靶點(diǎn)、多效應(yīng)作用的結(jié)果，因此在接下來(lái)的工作中還要再進(jìn)一步對(duì)BXT參與機(jī)體抗衰老的作用機(jī)制進(jìn)行研究。