EMS誘變馬鈴薯抗寒突變體篩選

黃 萍,李 飛,顏 謙

(貴州省馬鈴薯研究所，貴州 貴陽 550006)

【研究意義】為馬鈴薯凍害問題提供有效的解決方法。【前人研究進展】用愈傷組織為誘變受體材料的相關(guān)報道較少，而用愈傷組織作為誘變受體材料，雖操作較為復(fù)雜，但因其可以降低產(chǎn)生嵌合體的幾率，所以更容易得到穩(wěn)定、可遺傳的變異類型，是誘變育種的理想材料。常規(guī)雜交育種技術(shù)選育抗寒突變體具耗時長、難度大的缺點，而EMS誘變育種具有變異頻率高、可改變單一不良性狀、變異效應(yīng)較易穩(wěn)定、育種周期短等優(yōu)點[1]。柳永強、王淼、楊乾等[2-4]用EMS誘變馬鈴薯，并獲得突變株系，但他們都是用馬鈴薯試管苗的莖段作為誘變受體材料。【本研究切入點】馬鈴薯栽培種雖喜涼，但不耐霜凍，冬季低溫常會對馬鈴薯造成霜凍危害[5]。溫度低于1 ℃馬鈴薯植株停止生長，-0.8 ℃時遭受冷害，-1.5 ℃時遭受凍害，-3 ℃時植株會凍死[6]。因立體氣候特點使貴州省周年均可種植馬鈴薯，但早春種植的馬鈴薯在苗期常會遭倒春寒危害，而秋季種植的馬鈴薯在塊莖膨大期也會遭受低溫、早霜或晚霜的影響，使塊莖生長受阻，導(dǎo)致減產(chǎn)，影響農(nóng)戶收入[7]。【擬解決的關(guān)鍵問題】以貴州省栽培面積較大的馬鈴薯品種費烏瑞它試管苗愈傷組織為誘變材料，采用EMS誘變和Hyp壓力選擇正向突變體，得到高脯氨酸變異系，經(jīng)抗低溫特性及相關(guān)生理生化特性研究，篩選出抗寒突變體。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以馬鈴薯栽培品種費烏瑞它為試驗材料，經(jīng)實驗室莖尖剝離培養(yǎng)、病毒檢測獲得脫毒試管苗。

1.2 愈傷組織誘導(dǎo)

將馬鈴薯品種費烏瑞它脫毒試管苗莖段切成長0.3～0.5 cm的小段，接種到MS+BA2.0 mg/L+2,4-D 1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L、pH=6的培養(yǎng)基上，用三角瓶培養(yǎng)，每瓶接種6段，在(23±2) ℃、1000 lx、光照10 h/d條件下誘導(dǎo)愈傷。

1.3 愈傷組織分化

將愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L、pH=6上，在(23±2) ℃、2000 lx、光照14 h/d條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計愈傷組織萌發(fā)情況。

萌發(fā)率(%)=不定芽數(shù)量/愈傷組織總數(shù)×100

1.4 再生不定芽增殖

當(dāng)不定芽長到2.0 cm時轉(zhuǎn)接到MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH=6的培養(yǎng)基上，在(20±2) ℃、2000 lx、光照14 h/d條件下增殖培養(yǎng)。

1.5 EMS誘變處理愈傷組織

EMS溶液用0.01 mol/L、pH=7的磷酸緩沖液配制，過濾滅菌，以不含EMS的磷酸緩沖液為對照(CK),誘變濃度分別設(shè)為0.4 %、0.8 %、1.2 %和1.6 %。

在無菌操作臺上，將愈傷組織切成大小約3 mm的小塊，分別在不同濃度的溶液中浸泡1、2、3、4 h(期間不停地?fù)u動)后，用無菌水沖洗干凈，分別接種于愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，7～10 d觀察愈傷組織成活率，重復(fù)3次。

愈傷組織成活率(%)=存活愈傷組織數(shù)量/愈傷組織總數(shù)×100。

1.6 L-Hyp濃度篩選

將對照愈傷組織小塊分別接種到添加0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 g/L的L-Hyp誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度為(23±2) ℃、黑暗培養(yǎng)7～10 d，觀察愈傷組織成活率，獲得L-Hyp的半致死劑量。

將EMS誘變處理培養(yǎng)7～10 d的愈傷組織小塊接種在含L-Hyp的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d，篩選成活的愈傷組織，轉(zhuǎn)接到不含L-Hyp的培養(yǎng)基上，用含L-Hyp和不含L-Hyp的培養(yǎng)基交替篩選愈傷組織，重復(fù)3次，篩選出抗寒愈傷組織。

1.7 抗寒愈傷組織再分化誘導(dǎo)

將篩選出的抗性愈傷組織增殖后，接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于(20±2) ℃、2000 lx、光照14 h/d條件下培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計愈傷組織萌發(fā)情況(芽分化率=萌發(fā)不定芽數(shù)/愈傷組織總數(shù))。當(dāng)不定芽長到2.0 cm時，轉(zhuǎn)接到MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L、pH=6的培養(yǎng)基上，在(20±2) ℃、2000 lx、光照14 h/d條件下增殖培養(yǎng)。

1.8 抗寒再生苗耐冷性生理指標(biāo)測定

將獲得的抗性株系試管苗分別放在20 ℃、7 ℃、0 ℃、-1 ℃、-2 ℃、-4 ℃、-6 ℃下7 d，采用黃基水楊酸法測定各處理脯氨酸含量，以未經(jīng)EMS誘變的愈傷組織再生苗為對照。將獲得的抗性株系試管苗分別放在20 ℃、0 ℃、-1 ℃、-2 ℃、-3 ℃、-4 ℃下5 d，取出后用DDS-307型電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率R1，將材料放入沸水浴中水浴20 min以殺死植物組織，取出后迅速用自來水冷卻，測定電導(dǎo)率R2，計算相對電導(dǎo)率=R1/R2×100 %。以未經(jīng)EMS誘變的愈傷組織再生苗為對照。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)分化及增殖培養(yǎng)

將費烏瑞它試管苗莖段接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，莖段兩端開始膨大呈啞鈴狀。培養(yǎng)25 d后，莖段兩端繼續(xù)膨大變粗，中部加粗。培養(yǎng)40 d，莖段切口處長出肉眼可見的愈傷組織，少部分材料有根形成，長度大約1 cm，上有許多根毛。培養(yǎng)60 d，90 %接種材料形成愈傷組織，有9.76 %的愈傷上有根形成，長度約2.47 cm，此時愈傷組織平均重0.248 g，淡綠色，結(jié)構(gòu)較致密。而對照無愈傷組織形成，接種材料變白死亡。選取生長良好的愈傷組織60塊接入分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。30 d愈傷組織表面形成瘤狀突起，培養(yǎng)50 d有6.78 %的愈傷組織小芽。培養(yǎng)70 d有28個愈傷組織有小苗形成，最高的苗4.61 cm，愈傷組織誘導(dǎo)芽形成率是47.5 %。分化出來的健壯小苗轉(zhuǎn)接到不含激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30 d左右可用于擴繁。

2.2 EMS處理費烏瑞它愈傷組織的生長情況

從表1可知，在相同的EMS濃度下，隨著處理時間的增加，愈傷組織存活率降低；在相同的處理時間內(nèi)，隨著EMS濃度的增加，愈傷組織存活率也降低。在試驗濃度范圍內(nèi)，當(dāng)EMS度為0.4 %時，處理1～4 h對愈傷組織的殺傷力相對較弱，其存活率仍然能達(dá)到70 %以上；其次是0.8 %的EMS處理，此時愈傷組織仍有40 %以上的存活率；當(dāng)EMS濃度大于1.2 %后對愈傷組織的傷害作用較強，存活率不到40 %。根據(jù)處理后愈傷組織致死率結(jié)果，篩選出EMS半致死濃度為0.8 %、處理時間為4 h較佳。

2.3 L-Hyp處理費烏瑞它愈傷組織的生長情況

從表2看出，愈傷組織在不添加L-Hyp的培養(yǎng)基上培養(yǎng)成活率達(dá)98 %，隨著L-Hyp濃度的增加，成活率逐漸下降。當(dāng)濃度增加到0.4 %時，存活率為52.2 %；當(dāng)L-Hyp增加到0.6 %時，成活率最低，僅有13.4 %。L-Hyp對費烏瑞它愈傷組織的半致死劑量為0.4 %，但兼顧成活率和變異頻率相對較高考慮，選擇0.5 %為L-Hyp的半致死劑量濃度。

表1 EMS處理費烏瑞它愈傷組織的存活率

表2 不同濃度L-Hyp處理費烏瑞它愈傷組織的成活率

2.4 L-Hyp對EMS誘變愈傷組織的篩選

從表3看出，經(jīng)EMS誘變處理后的愈傷組織在L-hyp上成活率高于對照，且成活的愈傷組織多數(shù)無褐化、生長良好，而對照經(jīng)L-Hyp篩選后成活的愈傷組織大多數(shù)表現(xiàn)為褐化。表明經(jīng)EMS誘變的部分愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生了抗L-Hyp變異。

2.5 L-hyp抗性愈傷組織分化

抗性愈傷組織誘導(dǎo)成芽的時間較長，為89 d，比對照的75 d多14 d。在愈傷誘導(dǎo)芽分化期間，有15個抗性愈傷組織褐化面積不斷加大，最后死亡，剩余的12個抗性愈傷組織中有7個誘導(dǎo)出抗性再生苗，每個抗性再生苗為一個株系共7個；而對照的愈傷即使未分化出芽，但顏色一直是淡綠色，未發(fā)生大面積褐化。從表4看出，經(jīng)EMS和L-Hyp篩選后的愈傷組織芽分化率低于對照，只有25.9 %，比對照低18.5百分點。一定程度上說明EMS對愈傷組織傷害的持續(xù)性，致使愈傷的生長分化受到抑制。

表3 EMS誘變處理后的愈傷組織在L-hyp上的成活率及生長情況

表4 L-Hyp抗性愈傷組織分化

2.6 抗性再生苗耐凍性生理指標(biāo)

2.6.1 脯氨酸含量 從表5看出，在所設(shè)溫度范圍內(nèi)隨溫度降低，抗性系內(nèi)脯氨酸含量均明顯增加，-3 ℃溫度處理后，脯氨酸含量開始降低；低溫處理后抗性系內(nèi)脯氨酸含量明顯高出對照，比值大于1。7個抗性株系中，株系1的脯氨酸含量最高，其次是抗性4系，抗性3系、2系、5系和6系間差異性不顯著，7系最低。

2.6.2 電導(dǎo)率 從表6看出，隨溫度降低，對照與抗性株系相對電導(dǎo)率均顯著增加，但對照增加幅度明顯高出各變異株系，-2 ℃和-4 ℃處理后，對照相對電導(dǎo)率分別是57.92和61.91，而在變異株系中電導(dǎo)率增加幅度最大的是變異株6號，分別是44.39和49.83；其次是7號，抗性系5、3、2號間變化不顯著，抗性系4號和1號電導(dǎo)率變化最低。在所設(shè)溫度處理下，對照和變異株系電導(dǎo)率增加速度不一致，20～-2 ℃情況下電導(dǎo)率增加幅度顯著大于-4～-6 ℃。

表5 不同溫度下7個抗性株系的脯氨酸含量

注：表中大、小寫字母分別表示各變異株系間脯氨酸含量分別達(dá)1 %極顯著水平和5 %顯著水平。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate significant differences at 1 % and 5 % levels respectively.

表6 不同溫度下7個抗性株系的電導(dǎo)率

3 討 論

植物EMS離體篩選技術(shù)是植物抗逆育種的一項快速有效選擇方法，已廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、小麥上。影響EMS誘變效果的主要因素有外植體選擇、EMS濃度、處理時間及處理方法等[8]。確定EMS的濃度和處理時間時，通常以半致死劑量條件作為最適條件[9-10]。采用馬鈴薯試管苗莖段愈傷組織作試驗外植體，由于其本身已開始形成點狀突起且生長處于旺盛時期，這樣的外植體對化學(xué)誘變劑具有一定的敏感性。EMS不僅在誘變處理過程中會導(dǎo)致愈傷組織毒害和死亡，而且在誘變后愈傷組織分化過程中還會表現(xiàn)明顯的殘留，更有利于獲得突變體材料。

試驗用EMS誘變費烏瑞它愈傷組織，經(jīng)不同濃度L-Hyp篩選獲得7個變異株系。經(jīng)脯氨酸和電導(dǎo)率測定，其保持了高脯氨酸特性和耐低溫能力，與對照存在顯著差異，初步認(rèn)定為抗寒變異系，但要獲得更多的遺傳學(xué)方面和分子方面的證據(jù)，還要對其有性世代耐低溫能力和基因組進行進一步研究。

4 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，篩選出的7個株系具有一定抗寒性，但各個抗寒能力存在差異。具體哪個抗寒能力最強，還有待后期大田試驗驗證。