工廠化和網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道微生物群結(jié)構(gòu)與功能分析

■姜 燕 徐永江柳學(xué)周* 鄭煒強(qiáng) 陳 佳 史 寶王 濱

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2.大黃魚育種國家重點實驗室寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司，福建寧德 352103)

大黃魚（Larimichthys crocea）為我國傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)魚類，也是我國主要的海水經(jīng)濟(jì)魚種之一，其養(yǎng)殖業(yè)主要集中于我國浙江、福建等地。據(jù)統(tǒng)計，2017年大黃魚苗種產(chǎn)量為391 472萬尾，其養(yǎng)殖的年產(chǎn)量高達(dá)177 640噸，穩(wěn)居海水養(yǎng)殖魚類榜首[1]，并被列為我國八大優(yōu)勢出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一。并且，與2016年相比，其產(chǎn)量明顯提高11.35%。伴隨養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖過程中的各種問題也逐漸顯現(xiàn)，最終導(dǎo)致魚體處于不完全健康狀態(tài)，表現(xiàn)出對細(xì)菌性、寄生蟲性及病毒性等疾病病原的抵抗力逐漸下降[2-5]。

為解決上述問題，大黃魚產(chǎn)業(yè)正在從養(yǎng)殖設(shè)施、優(yōu)質(zhì)苗種生產(chǎn)、配合飼料使用、病害防控等方面推動養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)型升級。而關(guān)于病害的預(yù)防與治療方面的研究也在不斷的開展與深入，其中包括各種有效藥物的研發(fā)、疫苗的研制及消化道微生物群調(diào)控的研究等[6-10]。消化道微生物群調(diào)控是近幾年提出的熱點課題，主要是通過微生物間的相互作用來實現(xiàn)，在生物、環(huán)保的基礎(chǔ)上有效提高魚體對環(huán)境變化的適應(yīng)能力。

圍繞消化道微生物群開展生物調(diào)控，首先要清楚消化道微生物的結(jié)構(gòu)特征，同時還要掌握魚體消化道微生物群與其生存環(huán)境中菌群的相互關(guān)系。本研究針對工廠化和網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道菌群的組成與分布信息開展研究，明確消化道中的優(yōu)勢物種，為大黃魚幼魚內(nèi)源性益生菌的篩選奠定理論基礎(chǔ)。并且，查明大黃魚幼魚消化道菌群與環(huán)境菌群的相關(guān)性，為消化道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控途徑提供理論參考。同時，借助于16S rDNA高通量測序方法對大黃魚幼魚消化道微生物群基因參與的主要功能進(jìn)行分析，為大黃魚幼魚消化道功能菌群的篩選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚來源

實驗所用大黃魚幼魚由福建省富發(fā)水產(chǎn)有限公司提供，實驗中室內(nèi)工廠化和海上網(wǎng)箱養(yǎng)殖的所有大黃魚苗種均來自于同一批受精卵孵化的健康幼魚。其中，工廠化養(yǎng)殖幼魚體重（0.36±0.133）g，體長（3.66±0.394）cm，養(yǎng)殖密度為1.7萬尾/m3；海上網(wǎng)箱養(yǎng)殖幼魚體重（0.54±0.055）g，體長（4.32±0.22）cm，養(yǎng)殖密度為750尾/m3。

1.2 樣品采集與處理

大黃魚幼魚樣本：隨機(jī)挑選一個工廠化養(yǎng)殖池和一個海上網(wǎng)箱分別作為兩個處理組，對每一個處理組的幼魚進(jìn)行取樣，每組隨機(jī)采集20尾。將挑選的幼魚在滅菌海水中暫養(yǎng)20 min，連續(xù)進(jìn)行3次，之后采用MS-222（Fluka,USA）進(jìn)行麻醉處理，麻醉后立即進(jìn)行解剖。解剖過程：75%酒精擦拭體表后采用消毒的解剖工具解剖取其完整消化道，去除內(nèi)容物，之后用預(yù)冷的滅菌生理鹽水沖洗并分裝，于液氮中保存。整個解剖過程在無菌環(huán)境下進(jìn)行。室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道樣本采用I0YG表示，I0YG1、I0YG2、I0YG3表示三個平行樣本；海上網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道樣本采用C0YG表示，同樣，C0YG1、C0YG2、C0YG3表示三個平行樣本。

養(yǎng)殖用水樣本：對工廠化養(yǎng)殖幼魚進(jìn)行進(jìn)水口水樣的采集，共采集3次，每次3 L水；網(wǎng)箱養(yǎng)殖幼魚則對網(wǎng)箱中的水進(jìn)行水樣采集，同樣采集3次，每次3 L水。水樣在現(xiàn)場經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾后，保留濾膜至液氮中備用。其中，工廠化養(yǎng)殖用水樣本采用IYW表示，IYW1、IYW2、IYW3代表三個平行樣本；同樣，CYW1、CYW2、CYW3代表的是海上網(wǎng)箱的水樣本。

餌料樣本：不同模式養(yǎng)殖幼魚處于同一生長階段，因此投喂的配合飼料完全相同。準(zhǔn)確稱取0.1 g配合飼料三份，分裝于無菌離心管中，液氮保存?zhèn)溆?。采用s0YF代表餌料樣本，s0YF1、s0YF2、s0YF3則代表的是三個平行樣本。

1.3 微生物總DNA的提取與高通量測序

將液氮中保存的幼魚消化道樣本從液氮中取出，冰上自然解凍，每個處理組隨機(jī)選取三個樣本作為平行組，嚴(yán)格按照QIAamp DNA mini kit（QIAGEN,Ger?many）試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取消化道微生物總DNA。將收集的各水樣濾膜無菌粉碎后采用OME?GA Soil DNA kit（Omega Bio-Tek,USA）進(jìn)行細(xì)菌總DNA的提取。將每個餌料樣本按照QIAamp DNA mini kit（QIAGEN,Germany）的說明提取細(xì)菌總DNA。之后，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增16S rDNAV3-V4高變區(qū)序列，擴(kuò)增基因的正向引物338F：5'-ACTCCTAC?GGGAGGCAGCA-3'，反向引物806R：5'-GGACTACH?VGGGTWTCTAAT-3'。擴(kuò)增的序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后交由商業(yè)測序公司通過Illumina MiSeq PE300平臺進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

測序所得的下機(jī)數(shù)據(jù)，采用Trimmomatic（v 0.35）[11]剪切、Flash（v 1.2.11）[12]拼接、Uchime（v 4.2）[13]去嵌合體等一系列處理得到有效序列（effective reads）。然后，采用Vsearch（v 2.4.2）[14]對所有樣品的全部有效序列進(jìn)行歸類操作，默認(rèn)以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為一個OTU（Operational Taxonomic Units），并選取OTU的代表性序列。用RDP Classifer（v 2.2）[15]與Silva數(shù)據(jù)庫（v 123）對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋。將測序所得有效tags數(shù)目最小值作為標(biāo)準(zhǔn)對其余樣本的有效tags進(jìn)行均一化處理，Alpha和Beta多樣性均基于均一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析。采用tax4fun（0.3.1）對微生物群基因參與的KEGG通路進(jìn)行比對分析。

采取單因素方差分析（ANOVA）方法進(jìn)行差異性分析，顯著性水平為P＜0.05。采用Kruskal Wallis檢驗對不同養(yǎng)殖模式幼魚消化道微生物群差異物種進(jìn)行分析。所有數(shù)值均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（Means±S.D.）表示。

2 結(jié)果

所有樣本經(jīng)高通量測序及對測序結(jié)果數(shù)據(jù)的一系列處理后共獲得511 291條有效序列和2 230個有效OTU。其中，對所有樣本有效tags進(jìn)行均一化處理的標(biāo)準(zhǔn)為27 487條。

2.1 α-多樣性

所有樣品的物種數(shù)目如圖1所示，室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道菌群的物種數(shù)目平均值為356，低于網(wǎng)箱養(yǎng)殖幼魚的467.7，但差異不顯著（P＞0.05）。餌料中的微生物物種數(shù)目顯著高于工廠化養(yǎng)殖幼魚消化道微生物物種數(shù)目（P＜0.05）。兩種模式下的幼魚消化道微生物的物種數(shù)目分別與水環(huán)境微生物的物種數(shù)目差異不顯著（P＞0.05）。

工廠化和網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚消化道微生物群的香濃指數(shù)分別為6.69和6.67，與餌料微生物群之間的差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于兩種水環(huán)境的（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 不同養(yǎng)殖模式下大黃魚幼魚消化道及環(huán)境微生物群α-多樣性（n=3）

2.2 大黃魚消化道微生物群結(jié)構(gòu)特征

圖2顯示的是每一個樣本相對豐度排列前十的菌群。由圖2可以看出，在門水平，兩種環(huán)境下大黃魚幼魚消化道微生物組成比較相似，主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，其豐度之和為83.43%～92.84%。

圖2 不同養(yǎng)殖模式下大黃魚幼魚消化道優(yōu)勢菌門

在屬水平，每一個消化道樣本中相對豐度高于1%的微生物物種如圖3所示。從圖3中可以看出，每一個樣本中豐度高于1%的菌屬的豐度和均低于60%，且物種數(shù)目為11或12，相對比較穩(wěn)定。工廠化和網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚消化道優(yōu)勢菌屬主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、醋菌屬（Acetobacte）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等19個物種。但是，網(wǎng)箱養(yǎng)殖中，發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）和弧菌屬（Vibrio）在其中一個消化道樣本中豐度高達(dá)33.36%、9.16%，與其余兩個樣本的差異比較明顯。

以平行樣本共有菌屬為基礎(chǔ)，工廠化養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道菌屬水平的物種數(shù)目為84，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道中則為95個（圖4）。其中，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道特有菌屬遠(yuǎn)高于工廠化養(yǎng)殖的，而兩種模式下大黃魚幼魚消化道共有的菌屬為59個。并且，19個相對豐度高于1%的菌屬中，除Flavisolibacter外，其余菌屬均為共有均屬。因此，將發(fā)光桿菌屬、乳桿菌屬、弧菌屬、魏斯氏菌屬等18個菌屬視為兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚幼魚消化道的共有優(yōu)勢菌群。

圖5顯示了兩種環(huán)境條件下大黃魚幼魚消化道中豐度差異顯著的菌屬。其中，網(wǎng)箱養(yǎng)殖幼魚消化道Flavitalea、海單胞菌屬（Marinomonas）、Roseovarius和假單胞菌屬（Pseudomonas）等的豐度顯著低于工廠化養(yǎng)殖的（P＜0.05），而氣單胞菌屬（Aeromonas）、Esche?richia_Shigella、根瘤菌屬（Rhizobium）、Psychrilyo?bacter和黃單胞菌屬（Xanthomonas）的豐度顯著高于工廠化養(yǎng)殖的（P＜0.05）。

圖3 不同養(yǎng)殖模式下大黃魚幼魚消化道優(yōu)勢菌屬

圖4 不同養(yǎng)殖模式下大黃魚幼魚消化道微生物群韋恩圖

2.3 消化道微生物群與環(huán)境菌群的相關(guān)性

以每個樣本三個平行共有菌屬為基礎(chǔ)，對工廠化養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道菌群與環(huán)境菌群相關(guān)性進(jìn)行分析。消化道的微生物物種數(shù)目為84，與養(yǎng)殖用水共有物種42個，與餌料共有物種55個，三者共有物種34個，而消化道特有物種21個（見圖6）。

同樣以平行樣本共有物種為基礎(chǔ)，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道微生物物種數(shù)目為95，與水共有物種僅20個，而與餌料共有物種卻高達(dá)65個，并且三者共有物種僅17個（圖7）。

圖5 兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚幼魚消化道差異顯著菌屬(P＜0.05)

圖6 工廠化養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道菌群、餌料菌群與環(huán)境菌群的韋恩圖

圖7 網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道菌群、餌料菌群與環(huán)境菌群的韋恩圖

在大黃魚幼魚消化道微生物群與環(huán)境菌群的主成分分析中可以看出，主成分1（PC1）貢獻(xiàn)率84%，主成分2（PC2）的貢獻(xiàn)率為9.6%（圖8）。相對于網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚消化道樣本，工廠化養(yǎng)殖的消化道樣本比較聚集，說明消化道微生物群結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。同時，相對與水樣本而言，消化道樣本與餌料樣本相距較近，說明餌料中的微生物群組成與消化道的較為相似。

2.4 大黃魚消化道微生物群功能分析

基于各樣本的KEGG比對，共獲得299個功能途徑，對基因豐度排列前十五的進(jìn)行分析，可以看出兩種模式下大黃魚幼魚消化道微生物群功能在第一層級主要由環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、新陳代謝和細(xì)胞過程四大類組成（圖9）。其中，三級水平下，參與環(huán)境信息加工的轉(zhuǎn)運蛋白功能的基因數(shù)目最多，ABC轉(zhuǎn)運蛋白的次之。另外，參與肽酶、氨基酸相關(guān)酶功能的基因數(shù)目也相對較高，為35～56萬個。在這些優(yōu)勢的代謝通路中，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚消化道微生物群基因豐度明顯低于工廠化養(yǎng)殖的，但差異均不顯著（P＞0.05）。

圖8 大黃魚幼魚消化道菌群與環(huán)境菌群PCA分析

圖9 大黃魚幼魚消化道菌群功能注釋

針對第一層級通路中的新陳代謝通路進(jìn)行對比分析，在第二層級水平，大黃魚消化道微生物群參與的功能按照基因豐度由高到低的順序主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔酶因子和維生素代謝、核苷酸代謝、脂類代謝、異生物質(zhì)生物降解與代謝、多糖生物合成與代謝、酶家族等（見圖10）。在所有的新陳代謝通路中，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚消化道微生物群基因豐度同樣低于工廠化養(yǎng)殖的，差異不顯著（P＞0.05）。

圖10 大黃魚幼魚消化道菌群新陳代謝功能的分類注釋

3 討論

3.1 大黃魚幼魚消化道微生物群結(jié)構(gòu)特征及其與環(huán)境微生物的相關(guān)性

本研究中，屬水平下，所有消化道樣本的優(yōu)勢物種的豐度和比較相近，且均低于60%，反映出物種組成的均一性比較高。同時，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道菌群的物種數(shù)目及香濃指數(shù)均高于工廠化養(yǎng)殖模式的，說明網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚消化道微生物群的多樣性比較高，但差異不明顯。在兩種養(yǎng)殖模式下，大黃魚幼魚消化道微生物群在門和屬水平的主要組成基本相似，并且工廠化養(yǎng)殖大黃魚消化道微生物結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)固。在物種共有性分析時，發(fā)現(xiàn)本研究中18個豐度高于1%的菌屬為兩種模式養(yǎng)殖大黃魚消化道的共有優(yōu)勢物種，說明這些菌群可能始終存在于大黃魚消化道中，受環(huán)境和自身因素的影響，其豐度會出現(xiàn)一定的變化，導(dǎo)致其中一些菌屬（氣單胞菌屬、假單胞菌屬等）的豐度產(chǎn)生顯著性差異，但其豐度并不是很高。李存玉等[16]在對工廠化和池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)對比分析中，同樣發(fā)現(xiàn)，工廠化養(yǎng)殖的牙鲆腸道微生物多樣性比較低；并且，兩種模式下養(yǎng)殖牙鲆腸道優(yōu)勢物種組成在門和屬水平上基本相似，只是物種豐度存在一定的差異。關(guān)于仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)對比分析中，有研究指出，池塘養(yǎng)殖和海上吊籠養(yǎng)殖的腸道菌群的結(jié)構(gòu)存在較大差異[17]。這可能與養(yǎng)殖動物的種類、攝食習(xí)性等有關(guān)[18]。

通過PCR與克隆技術(shù)相結(jié)合，王程程等[19]對同一養(yǎng)殖海區(qū)的1齡大黃魚進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬為其腸道內(nèi)的最優(yōu)勢菌屬。而本實驗中，在工廠化和網(wǎng)箱兩種模式下大黃魚幼魚消化道中，擬桿菌屬雖為優(yōu)勢物種，但是豐度并不是最高的。這可能與生存環(huán)境、營養(yǎng)水平、魚體自身的生理階段及研究方法有關(guān)[9，18，20-24]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水和餌料是外源性物質(zhì)的良好載體，包括益生菌和病原菌在內(nèi)的微生物均可借助于這兩種介質(zhì)進(jìn)入養(yǎng)殖動物體內(nèi)形成相應(yīng)的效應(yīng)[25-28]。本實驗中，分別對兩種環(huán)境因素與消化道菌群的相關(guān)性進(jìn)行了分析。兩種模式養(yǎng)殖大黃魚消化道與餌料共有菌屬的數(shù)目明顯高于水環(huán)境的；并且，與水環(huán)境相比，大黃魚消化道菌群的組成與分布與餌料的更為相似，揭示了對兩種模式養(yǎng)殖大黃魚幼魚而言，餌料中微生物群對消化道菌群的影響較為明顯。同時，大黃魚消化道也有自己的特有物種，推測其可能與親本、授精過程或者微生物間的相互作用有關(guān)。相關(guān)報道指出，大菱鲆、牙鲆苗種繁育階段，與水中微生物相比，餌料微生物與仔稚幼魚腸道菌群的結(jié)構(gòu)更相關(guān)[29-30]。但是，Bakke等[7]在對鱈魚幼魚消化道菌群的研究中發(fā)現(xiàn)，與餌料相比，消化道菌群結(jié)構(gòu)與水中的微生物組成比較相似，這可能與研究的方法、魚的種類及生存環(huán)境有關(guān)。

3.2 大黃魚幼魚消化道微生物群功能

消化道微生物群是一個復(fù)雜的群體，通過相互間的各種作用使整個群體處于動態(tài)的平衡狀態(tài)，有效預(yù)防外源菌群的定植[31]。因此，針對消化道菌群調(diào)控方面的研究逐步開展內(nèi)源性菌群的挖掘與深入研究。從而，糞菌移植、“菌群-腸-行為軸”等成為醫(yī)學(xué)界研究的焦點[32-35]。Shabat等[36]通過研究證實反芻動物能量的吸收依賴于消化道特異的微生物組。還有報道指出，消化道微生物組能夠在機(jī)體能量獲取與消耗方面協(xié)同宿主更好的適應(yīng)高海拔的生活環(huán)境[37]。本研究中，兩種模式養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道主要菌群結(jié)構(gòu)基本相似，僅有少數(shù)豐度較低的菌屬存在一定差異。因此，消化道微生物群的主要功能也基本相似，在新陳代謝中，參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝等功能占據(jù)主要優(yōu)勢地位。另外，參與能量代謝、輔酶因子和維生素代謝、脂類代謝等的微生物基因豐度也比較高。說明消化道微生物群在滿足自身生長發(fā)育需要的同時，對宿主營養(yǎng)代謝也發(fā)揮著重要的作用。兩種模式養(yǎng)殖大黃魚幼魚來源于同一批受精卵孵化的仔魚，并且取樣過程完全隨機(jī)，投喂的餌料也相同，最終體重存在一定差距，這可能與養(yǎng)殖密度差距懸殊相關(guān)。在工廠化養(yǎng)殖模式下，幼魚的養(yǎng)殖密度為網(wǎng)箱養(yǎng)殖的22.7倍，相比較而言對幼魚的各種生長機(jī)制形成一定的脅迫。為了彌補(bǔ)養(yǎng)殖密度對魚體自身的生長機(jī)制的不足，消化道菌群通過對結(jié)構(gòu)的細(xì)微調(diào)整來形成一種對魚體生長代謝的補(bǔ)償作用，最終表現(xiàn)為參與主要代謝通路及新陳代謝各通路的消化道微生物群基因的豐度均高于網(wǎng)箱養(yǎng)殖幼魚的。

4 結(jié)論

工廠化和網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚幼魚消化道微生物群優(yōu)勢物種組成基本相似，其中，假單胞菌屬、氣單胞菌屬和Escherichia_Shigella在兩種養(yǎng)殖模式幼魚消化道中的豐度差異顯著（P＜0.05）。并且，幼魚消化道菌群與餌料中的相關(guān)性比較大。兩種模式養(yǎng)殖幼魚消化道菌群基因參與的主要功能相近，但是工廠化模式養(yǎng)殖幼魚消化道菌群參與這些主要功能的基因豐度高于網(wǎng)箱模式養(yǎng)殖幼魚的，這可能是對幼魚生長代謝在密度脅迫中的一種補(bǔ)償作用。