苜蓿、小麥自毒及他感作用機(jī)理

鄭 瑞，師尚禮，馬史琛

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 / 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心, 甘肅 蘭州 730070）

植物生長(zhǎng)代謝途徑中會(huì)產(chǎn)生一些次生物質(zhì)，他們通過(guò)植物根系分泌、莖葉揮發(fā)和殘?bào)w分解等途徑釋放到環(huán)境中，這些物質(zhì)若對(duì)后茬同種作物生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，這種現(xiàn)象被稱為自毒作用，若對(duì)后茬其他種植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響則稱之為他感作用[1-2]。被譽(yù)為牧草之王的苜蓿(Medicago sativa)作為最重要的飼草之一，不僅填補(bǔ)了優(yōu)質(zhì)蛋白飼料的空缺，并且對(duì)促進(jìn)奶產(chǎn)品、肉制品的優(yōu)良發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)。然而，植株矮小、根系受損、幼苗死亡等現(xiàn)象在苜蓿連作后發(fā)生頻繁[3]，說(shuō)明苜蓿連作極不利于他的發(fā)育生長(zhǎng)，而自毒作用是造成苜蓿連作幼苗死亡和產(chǎn)量下降的主要原因[4]。有研究發(fā)現(xiàn)苜蓿植株的水浸提液抑制苜蓿種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)，而且隨著水浸提液濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，說(shuō)明苜蓿水浸提液中含有自毒物質(zhì)[5]。研究者[6]發(fā)現(xiàn)苜蓿自毒物質(zhì)香豆素和肉桂酸在處理濃度高于6 μg·mL-1后，抑制作用顯著。苜蓿的自毒物質(zhì)是由苜蓿的活體和殘?bào)w產(chǎn)生并分泌或釋放到周圍環(huán)境，并且不是單一的某種物質(zhì)，而是幾種物質(zhì)的混合物，這些物質(zhì)的存在對(duì)下茬苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)造成了不可避免的傷害[7]。苜蓿體內(nèi)自毒物質(zhì)產(chǎn)生的影響因素有很多，例如苜蓿的品種、株齡、密度、土壤環(huán)境、田間管理、耕作制度等因素都會(huì)對(duì)自毒作用產(chǎn)生不同程度的影響[8]。由于自毒物質(zhì)通過(guò)一般田間管理措施很難對(duì)其進(jìn)行徹底消除，所以，對(duì)于由自毒作用引起的苜蓿連作障礙至今缺少有效的調(diào)控措施。

小麥(Triticum aestivum)是一種典型的他感型禾本科作物，也是存在連作障礙的作物之一，其主要通過(guò)根系分泌、殘?bào)w分解等方式影響自身或鄰近植物的生長(zhǎng)發(fā)育。Kimber[9]研究發(fā)現(xiàn)小麥殘?bào)w對(duì)小麥的生長(zhǎng)有抑制作用，小麥的自毒作用在秸稈還田中表現(xiàn)十分明顯，秸稈還田是為了改善土壤條件，然而這種措施往往會(huì)導(dǎo)致小麥本身發(fā)芽和生長(zhǎng)受阻，產(chǎn)量下降[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小麥秸稈和種植過(guò)小麥的土壤浸提液明顯抑制小麥的發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)，并且已從小麥秸稈中分離出了香豆酸、對(duì)一羥基苯甲酸、丁香酸、香草酸、阿魏酸等他感物質(zhì)[11]。有研究表明苜蓿與貓尾草(Phleum pretense)、燕麥(Avena sativa)等飼用禾本科谷物或玉米(Zea mays)、小麥等禾本科作物輪作一季后幾乎能徹底降解苜蓿自毒作用[12-13]。

苜蓿和小麥輪作后苜蓿相對(duì)發(fā)芽率均達(dá)97%以上，有效刺激了苜蓿胚芽、胚根伸長(zhǎng)，苜蓿輪作1年小麥可以全部解除自毒效應(yīng)并且提高土壤微生物多樣性，促進(jìn)土壤由真菌型向細(xì)菌型轉(zhuǎn)化，土壤肥力和酶活性也明顯增加[14-15]。近年來(lái)，關(guān)于自毒物質(zhì)在植物體內(nèi)的含量和種類的研究收獲頗多，然而對(duì)于自毒物質(zhì)的侵害途徑以及受體植物的中毒機(jī)制研究報(bào)道較為少見，苜蓿、小麥間他感作用的機(jī)理研究較為鮮見。本研究以苜蓿和小麥兩種作物為試驗(yàn)材料，通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)和生理生化指標(biāo)的測(cè)定，研究?jī)煞N作物的自毒、他感效應(yīng)和其生理生化機(jī)制，為降解毒害以及合理輪作奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用甘農(nóng)2號(hào)紫花苜蓿(Medicago sativa‘Gannong No.2')、 隴 春 BJ103 小 麥 (Triticum aestivum‘longchunBJ-103')兩種作物，種子來(lái)自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 浸提液制備

在直徑為 180 mm × 350 mm 的花盆中采用沙培法種植苜蓿 (甘農(nóng) 2號(hào))和小麥 (隴春 BJ103)各10盆，每盆50粒，定時(shí)澆灌等量蒸餾水和營(yíng)養(yǎng)液(霍格藍(lán)氏營(yíng)養(yǎng)液)，培養(yǎng)40 d后，將幼苗連根取出，用自來(lái)水沖洗根部，晾干，放置于105 ℃的烘箱中殺青15～20 min，之后降低烘箱溫度，維持在70～80 ℃，烘干，之后用碾槽碾碎至粉末。然后準(zhǔn)確稱取苜蓿干粉 0、0.1、0.25、0.5、1 g，分別加入 1 000 mL 蒸餾水溶解，在 24 ℃ ± 1 ℃ 條件下振蕩浸提24 h，浸提物經(jīng)過(guò)4層紗布過(guò)濾，初步去除其中的植物纖維，再經(jīng) 3 000 r·min-1離心 2 h，取上清液真空抽濾，通過(guò)一層定量濾紙，最后，以蒸餾水分別定容[16-17]，使苜蓿浸提液濃度分別為0(CK)、0.1、0.25、0.5、1 g·L-1，小麥各濃度浸提液制備同上。

用苜蓿浸提液澆灌下茬苜蓿種子和幼苗為苜蓿

自毒試驗(yàn)，澆灌下茬小麥種子和幼苗為苜蓿-小麥他感試驗(yàn)；用小麥浸提液澆灌下茬小麥種子和幼苗為小麥自毒試驗(yàn)，澆灌下茬苜蓿種子和幼苗為小麥-苜蓿他感試驗(yàn)。

1.2.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

取苜蓿(甘農(nóng)2號(hào))和小麥(隴春BJ103)種子，在0.05%的次氯酸鈉溶液中消毒15 min，取出種子，用蒸餾水反復(fù)沖洗(約5～6次)至次氯酸鈉完全沖洗干凈。在9 cm的培養(yǎng)皿中鋪上濾紙，用少量的蒸餾水浸濕濾紙，使濾紙和培養(yǎng)皿底部完全貼合。每個(gè)培養(yǎng)皿放置苜蓿種子(甘農(nóng)2號(hào))30粒，小麥種子(隴春BJ103)20粒，用各個(gè)濃度的苜蓿幼苗浸提液分別將苜蓿和小麥種子完全浸沒，每個(gè)濃度做3次重復(fù)，蒸餾水處理作為對(duì)照。小麥幼苗浸提液處理同上。培養(yǎng)皿加蓋后放置于24 ℃，14 h光照10 h黑暗的光照培養(yǎng)箱中，期間定時(shí)定量添加浸提液少許，保證種子發(fā)芽的濕潤(rùn)環(huán)境。120 h后測(cè)定發(fā)芽率、下胚軸長(zhǎng)度(苜蓿)、胚芽鞘長(zhǎng)度(小麥)及胚根長(zhǎng)[18]。

3.1.3 壩料攤鋪 粘土心墻料鋪筑沿壩軸線進(jìn)行，鋪料時(shí)嚴(yán)格控制鋪土厚度，土料采用推土機(jī)及裝載機(jī)攤鋪平整，并隨時(shí)進(jìn)行鋪料厚度測(cè)量，確保厚度滿足要求。

1.2.3 幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)

將消毒后的苜蓿、小麥種子分別種于直徑為180 和350 mm的花盆，苜蓿每盆30粒，小麥每盆20粒。定期澆灌不同處理的浸提液30 mL(苜蓿浸提液分別澆灌苜蓿和小麥，小麥浸提液分別澆灌小麥和苜蓿)，以蒸餾水為對(duì)照，3次重復(fù)，常規(guī)方法管理。4周隨機(jī)選取苜蓿、小麥幼苗各20株，測(cè)定幼苗株高、根長(zhǎng)、苗鮮重、根鮮重。計(jì)算化感效應(yīng)指數(shù)(RI)：

式中：C為對(duì)照值，T為處理值。當(dāng)RI＞0 時(shí)，表示促進(jìn)作用；當(dāng)RI＜0 時(shí)，表示抑制作用。RI絕對(duì)值的大小代表化感作用強(qiáng)度[19-20]。

1.2.4 生理指標(biāo)的測(cè)定

采用氮藍(lán)四唑(NBT)法、愈創(chuàng)木酚法和高錳酸鉀滴定法分別測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性[21]。采用李合生[18]的方法測(cè)定細(xì)胞膜相對(duì)透性、丙二醛(MDA)含量；采用Mukherjee和Choudhuri[22]的方法測(cè)定H2O2含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用 IBM SPSS Statistics 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提液對(duì)苜蓿、小麥種子萌發(fā)的自毒和他感效應(yīng)

浸提液種內(nèi)澆灌，隨著浸提液濃度的增加發(fā)芽率呈逐漸下降趨勢(shì)；種間澆灌隨著浸提液濃度的增加發(fā)芽率呈先增后減趨勢(shì)(圖1)。與對(duì)照相比，苜蓿浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿種子發(fā)芽率無(wú)明顯變化，濃度為0.25、0.5和1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿種子發(fā)芽率分別降低8.58%、17.46%和41.41%，且差異顯著(P＜0.05)；與對(duì)照相比，苜蓿浸提液

圖 1 浸提液濃度處理的苜蓿、小麥種子發(fā)芽率Figure 1 Different concentrations of leaching solution on alfalfa and wheat germination rates

自毒效應(yīng)使苜蓿、小麥胚根長(zhǎng)度隨著浸提液濃度增加而降低，當(dāng)濃度大于0.5 g·L-1后，下降明顯；他感效應(yīng)使苜蓿、小麥胚根長(zhǎng)度隨著浸提液濃度增加呈先增后減趨勢(shì)，相比受體小麥胚根長(zhǎng)度的變化，受體苜蓿變化幅度較大(圖2)。與對(duì)照相比，苜蓿浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿胚根長(zhǎng)度與對(duì)照差異不顯著(P＞0.05)，濃度為0.25、0.5和1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿胚根長(zhǎng)度分別降低 18.18%、25%和79.92%，且差異顯著(P＜0.05)，自毒作用明顯；與對(duì)照相比，苜蓿浸提液濃度為0.1、0.25和 0.5 g·L-1時(shí)，受體小麥胚根長(zhǎng)度升高 7.77% 、18.45% 和 10.16%，0.5 g·L-1時(shí) 促 進(jìn) 效 應(yīng) 開 始 減弱，濃度為1 g·L-1時(shí)，受體小麥胚根生長(zhǎng)受到抑制，降低 25.53%，且差異顯著 (P＜0.05)。與對(duì)照相比，小麥浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體小麥胚根長(zhǎng)度與對(duì)照差異不顯著(P＞0.05)，小麥浸提液濃度為0.25、0.5和1 g·L-1時(shí)，受體小麥的胚根長(zhǎng)分別降低 0.79%、4.73%和43.15%；與對(duì)照相比，小麥浸提液濃度為 0.1、0.25 和 0.5 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的胚根長(zhǎng)度升高 17.57%、32.13%和15.92%，0.5 g·L-1時(shí)促進(jìn)效應(yīng)開始減弱，當(dāng)小麥濃度為 1 g·L-1時(shí)，苜蓿胚根生長(zhǎng)受抑，降低 49.63%(P＜0.05)。綜上所述，浸提液種內(nèi)處理，胚根長(zhǎng)度隨著浸提液濃度的增加而減小，自毒效應(yīng)明顯，且苜蓿自毒效應(yīng)大于小麥；種間處理，濃度為0.1、0.25和0.5 g·L-1時(shí)，促進(jìn)胚根生長(zhǎng)，存在他感正效應(yīng)，且0.25 g·L-1時(shí)達(dá)到最佳，0.5 g·L-1的促進(jìn)效應(yīng)開始減弱，表現(xiàn)為低促高抑的他感濃度效應(yīng)。

圖 2 浸提液濃度處理的苜蓿、小麥胚根長(zhǎng)Figure 2 Different concentrations of leaching solution on alfalfa and wheat radicle length

小麥浸提液對(duì)苜蓿下胚軸長(zhǎng)的影響較苜蓿浸提液對(duì)小麥胚芽鞘長(zhǎng)的影響明顯，說(shuō)明苜蓿下胚軸長(zhǎng)較小麥胚芽鞘對(duì)他感作用更敏感(圖3)。與對(duì)照相比，苜蓿浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿下胚軸長(zhǎng)度與對(duì)照差異不顯著(P＞0.05)，濃度為0.25、0.5和1g·L-1時(shí)，受體苜蓿下胚軸長(zhǎng)度分別降低 20%、32.73%和 67.27%，且差異顯著 (P＜0.05)；與對(duì)照相比，苜蓿浸提液濃度為0.1、0.25和 0.5 g·L-1時(shí)，受體小麥的胚芽鞘長(zhǎng)度分別升高 5.9%、 15.16%和1.95%，只有 0.25 g·L-1時(shí)與對(duì)照差異顯著 (P＜0.05)，濃度為1g·L-1時(shí)，小麥胚芽鞘生長(zhǎng)受抑，降低24.83%(P＜0.05)。與對(duì)照相比，小麥浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體小麥的胚芽鞘長(zhǎng)與對(duì)照差異不顯著 (P＞0.05)，濃度為 0.25、0.5 和 1 g·L-1時(shí)，受

圖 3 浸提液濃度處理的苜蓿下胚軸長(zhǎng)和小麥胚芽鞘長(zhǎng)Figure 3 Lengths of alfalfa hypocotyls and wheat coleoptiles in plants treated with extracts

體小麥的胚芽鞘生長(zhǎng)受到抑制，降低 12.54%、29.7%和64.69%，且差異顯著(P＜0.05)；與對(duì)照相比，小麥浸提液濃度為0.1、0.25和0.5 g·L-1時(shí)，受體苜蓿下胚軸長(zhǎng)度分別升高11.29%、29.48%、14.06%，只有0.25g·L-1時(shí)與對(duì)照差異顯著 (P＜0.05)，小麥浸提液濃度為1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿下胚軸伸長(zhǎng)受抑，降低 21.82%(P＜0.05)。綜上所述，浸提液種內(nèi)處理，苜蓿下胚軸和小麥胚芽鞘長(zhǎng)度隨著浸提液濃度的增加而減小，自毒效應(yīng)明顯，苜蓿自毒效應(yīng)大于小麥；異種間處理，濃度為0.1、0.25和0.5 g·L-1時(shí)，苜蓿下胚軸和小麥胚芽鞘長(zhǎng)度高于對(duì)照，但只有0.25 g·L-1處理時(shí)他感正正效應(yīng)顯著(P＜0.05)，濃度為 1 g·L-1時(shí)，他感負(fù)效應(yīng)顯現(xiàn)。

2.2 浸提液對(duì)苜蓿、小麥幼苗生長(zhǎng)的自毒和他感效應(yīng)

苜蓿、小麥幼苗生長(zhǎng)的自毒效應(yīng)隨著浸提液濃度的增大而增強(qiáng)，其化感指數(shù)均為負(fù)值。他感效應(yīng)在浸提液濃度為 0.1～0.5 g·L-1時(shí)表現(xiàn)為正效應(yīng)，化感指數(shù)為正值，且濃度為0.25 g·L-1時(shí)他感正效應(yīng)最明顯，0.5 g·L-1時(shí)正效應(yīng)開始減弱，濃度為 1 g·L-1時(shí)，表現(xiàn)為他感負(fù)效應(yīng) (表 1)。苜蓿浸提液使受體苜蓿幼苗生長(zhǎng)受抑，且隨著浸提液濃度的增大抑制作用增強(qiáng)；苜蓿浸提液濃度為0.1、0.25和 0.5 g·L-1時(shí)，促進(jìn)受體小麥幼苗生長(zhǎng)， 0.25 g·L-1時(shí)苜蓿浸提液促進(jìn)作用最明顯，與對(duì)照相比，受體小麥的苗高、根長(zhǎng)、苗鮮重和根鮮重分別升高23.3%、14.25%、17.10%和13.40%，且差異顯著(P＜0.05)，0.5 g·L-1時(shí)正效應(yīng)開始減弱，1 g·L-1的苜蓿浸提液抑制受體小麥的幼苗生長(zhǎng)，其苗高、根長(zhǎng)、苗鮮重和根鮮重分別降低9.53%、10.20%、7.38%和3.11%，表現(xiàn)出低促高抑的他感濃度效應(yīng)。與對(duì)照相比，小麥浸提液濃度為0.1、0.25和0.5 g·L-1時(shí)，促進(jìn)受體苜蓿幼苗生長(zhǎng)，其中 0.25 g·L-1時(shí)小麥浸提液使苜蓿的苗高、根長(zhǎng)、苗鮮重和根鮮重分別顯著升高 49.38%、59.60%、78.05%和110.93%(P＜ 0.05)， 小 麥 浸 提 液 濃 度 為 1 g·L-1時(shí)，苜蓿幼苗生長(zhǎng)受抑，其苗高、根長(zhǎng)、苗鮮重和根鮮重降低 4.83%、19.29%、2.99%和16.29%，表現(xiàn)為低促高抑的濃度效應(yīng)，與苜蓿浸提液對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的他感作用一致。

2.3 浸提液對(duì)苜蓿、小麥自毒和他感作用的生理機(jī)制

2.3.1 浸提液濃度對(duì)苜蓿、小麥SOD、POD和CAT活性的調(diào)控

SOD酶活性強(qiáng)弱代表植物體預(yù)防活性氧毒害的程度，對(duì)植物細(xì)胞起保護(hù)作用。苜蓿浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的SOD酶活性無(wú)明顯變化，濃度為 0.25、0.5 和 1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿SOD酶活性顯著低于(P＞0.05)對(duì)照13.18、33.92%和54.62%，苜蓿浸提液濃度為 0.1、0.25 和 0.5 g·L-1時(shí)，受體小麥SOD活性較對(duì)照高出9.51%、16.34和 6.06%(P＜0.05)，濃度為 1 g·L-1時(shí)，受體小麥SOD酶活性開始減弱，低于對(duì)照5.88%(圖4)。小麥浸提液濃度為 0.1、0.25 g·L-1時(shí)，受體小麥的SOD酶活性與對(duì)照差異不顯著(P＞0.05)，濃度為0.5、1 g·L-1時(shí)，受體小麥SOD酶活性分別顯著低于對(duì)照8.75%和23.28%；小麥浸提液濃度為0.1、0.25和 0.5 g·L-1時(shí)，苜蓿 SOD酶活性顯著高于對(duì) 照 28.96%、42.54%、34.05%(P＜0.05)，濃度為 1 g·L-1時(shí)，SOD酶活性減弱，低于對(duì)照8.49%。綜上，浸提液種內(nèi)處理，濃度超過(guò)0.1 g·L-1后，苜蓿即刻表現(xiàn)出明顯的自毒效應(yīng)，濃度超過(guò)0.25 g·L-1后，小麥才表現(xiàn)出自毒效應(yīng)，表明自毒效應(yīng)對(duì)SOD酶活性的影響，苜蓿比小麥更敏感；浸提液種間處理，濃度為 0.1、0.25 和0.5 g·L-1時(shí)，SOD 酶活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為他感正效應(yīng)，其中0.25 g·L-1的浸提液使 SOD酶活性增強(qiáng)最多，濃度為 1 g·L-1時(shí)，SOD活性減弱，表現(xiàn)為他感負(fù)效應(yīng)。

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圖 4 浸提液濃度處理的苜蓿、小麥超氧化物歧化酶(SOD)活性Figure 4 Superoxide dismutase (SOD) activity of alfalfa and wheat treated with different concentrations of leaching solution

POD酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的，并避免活性氧的產(chǎn)生和積累的保護(hù)酶之一。苜蓿、小麥的自毒效應(yīng)對(duì)POD酶活性的影響變化趨勢(shì)一致，隨著浸提液濃度增大POD酶活性減弱；他感效應(yīng)對(duì)POD酶活性的影響呈先增后減趨勢(shì)，苜蓿浸提液濃度為0.5 g·L-1時(shí)小麥POD酶活性達(dá)到最大值，而小麥浸提液濃度為0.25 g·L-1時(shí)苜蓿POD酶活性達(dá)到最大值，表明苜蓿POD酶活性對(duì)他感效應(yīng)較小麥敏感(圖5)。苜蓿浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿POD酶活性與對(duì)照差異不顯著 (P＞0.05)，濃度為 0.25、0.5 和 1 g·L-1時(shí)，POD酶活性隨苜蓿浸提液濃度的增大而減弱，分別低于對(duì)照9.01%、15.5%和25.09%；苜蓿浸提液濃度為 0.1、0.25和 0.5 g·L-1時(shí)，受體小麥 POD 酶活性隨苜蓿浸提液濃度增大而隨之增強(qiáng)，分別高于對(duì)照 4.27%、11.71%和 16.63%(P＜0.05)，濃度為1 g·L-1時(shí)，POD 酶活性受抑，低于對(duì)照 14.38%。小麥浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體小麥POD酶活性與對(duì)照差異不顯著(P＞0.05)，濃度為0.25、0.5和 1 g·L-1時(shí)，POD酶活性隨小麥浸提液濃度的增大而減弱，分別低于對(duì)照8.06%、21.83%和29.34%；小麥浸提液濃度為 0.1 g·L-1、0.25 g·L-1和0.5 g·L-1時(shí)，受體苜蓿 POD酶活性較對(duì)照高出6.64%、16.85%和8.48%，小麥浸提液濃度為1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的POD酶活性減弱，低于對(duì)照21.97%。

圖 5 浸提液濃度處理的苜蓿、小麥POD活性Figure 5 Peroxidase (POD) activity of alfalfa and wheat treated with different concentrations of leaching solution.

CAT酶可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，其活性大小代表了植物的代謝強(qiáng)度。苜蓿、小麥CAT酶活性在自毒效應(yīng)影響下，均隨浸提液濃度增大而下降，但受體苜蓿CAT酶活性降低更明顯；苜蓿、小麥他感作用中，隨浸提液濃度增大CAT酶活性呈先上升后下降趨勢(shì)(圖6)。苜蓿浸提液濃度為0.1、0.25 g·L-1，受體苜蓿的 CAT 酶活性與對(duì)照差異不顯著 (P＞0.05)，濃度為 0.5、1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿CAT酶活性分別低于對(duì)照12.13%和26.89%；苜蓿浸提液濃度為 0.1、0.25 和 0.5 g·L-1時(shí)，受體小麥CAT酶活性增強(qiáng)，分別顯著高于對(duì)照14.88%、39.49% 和 35.72%(P＜ 0.05)， 濃 度 為 1 g·L-1時(shí) ，CAT酶活性減弱，低于對(duì)照7.14%。小麥浸提液濃度為0.1、0.25g·L-1，受體小麥CAT酶活性與對(duì)照差異不明顯 (P＞0.05)，小麥浸提液濃度為 0.5、1 g·L-1時(shí)受體小麥的CAT酶活性受抑，分別低于對(duì)照9.08%、32.26%；小麥浸提液濃度為0.1、0.25、0.5 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的CAT酶活性分別顯著高于對(duì)照 19.30%、40.71% 和 37.82%(P＜0.05)，濃度為1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿CAT酶活性減弱，低于對(duì)照22.65%。

圖 6 浸提液濃度處理的苜蓿、小麥CAT活性Figure 6 Catalase (CAT) activity of alfalfa and wheat treated with different concentrations of leaching solution

2.3.2 浸提液對(duì)苜蓿和小麥MDA、H2O2含量和相對(duì)膜透性的影響

MDA的含量是反映膜質(zhì)過(guò)氧化程度的重要依據(jù)。自毒效應(yīng)導(dǎo)致MDA含量呈上升趨勢(shì)，他感效應(yīng)使MDA含量呈先減后增趨勢(shì)(圖7)。苜蓿浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的MDA含量與對(duì)照差異不顯著 (P＜0.05)，濃度為 0.25、0.5 和 1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿MDA含量較對(duì)照高出 18.42%、24.39%和 48.33%(P＞0.05)；苜蓿浸提液濃度為 0.1、0.25和0.5 g·L-1時(shí)，受體小麥MDA含量隨著苜蓿浸提液濃度的增大而減少，顯著低于對(duì)照 28.85%、44.23% 和 50.00%(P＜0.05)，濃度為 1 g·L-1時(shí)，小麥MDA含量較對(duì)照高出3.85%。小麥浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體小麥的MDA含量與對(duì)照間無(wú)顯著差異 (P＜0.05)，濃度為 0.25、0.5 和 1 g·L-1時(shí)，受體小麥MDA含量分別較對(duì)照高出7.14%、14.75%和 26.76%，且差異顯著 (P＞0.05)；小麥浸提液在濃度為 0.1、0.25 和 0.5 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的MDA含量分別低于對(duì)照3.2%、32.26%和12.9%，濃度為1 g·L-1時(shí) ，受體苜蓿MDA含量增加，較對(duì)照高出27.91%。

圖 7 浸提液濃度處理的苜蓿、小麥MDA含量Figure 7 Malondialdehyde (MDA) content of alfalfa and wheat treated with different concentrations of leaching solution

H2O2具有較強(qiáng)的氧化性，如果其含量打破平衡并有效積累，則會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)大分子氧化損傷。苜蓿、小麥的自毒效應(yīng)使H2O2含量呈上升趨勢(shì)，并且浸提液濃度大于0.5 g·L-1之后急劇增加；他感效應(yīng)使H2O2含量呈先降低后上升趨勢(shì)(圖8)。苜蓿浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的H2O2含量與對(duì)照無(wú)顯著差異 (P＜0.05)，濃度為 0.25、0.5和1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿 H2O2含量隨濃度的增大而增加，分別高于對(duì)照3.62%、7.67%和31.36%；苜蓿浸提液濃度為 0.1、0.25 和 0.5 g·L-1時(shí)，受體小麥H2O2含量顯著低于對(duì)照8.16%、44.67%和17.73%(P＜0.05)，濃度為 1 g·L-1時(shí)，小麥 H2O2含量增加，較對(duì)照高出17.25%。小麥浸提液濃度為0.1 g·L-1時(shí)，受體小麥的H2O2含量與對(duì)照差異不顯著 (P＜0.05)，濃度為 0.25、0.5 和 1 g·L-1時(shí)，受體小麥H2O2含量分別高于對(duì)照4.23%、12.79%和30.43%；小麥浸提液濃度為 0.1、0.25 和 0.5 g·L-1時(shí)，苜蓿的H2O2含量顯著低于對(duì)照 18.95%、48.97%和 21.74%(P＜0.05)，濃度為 1 g·L-1時(shí)，苜蓿 H2O2含量較對(duì)照高出22.64%。

圖 8 浸提液濃度處理的苜蓿、小麥H2O2含量Figure 8 Hydrogen peroxide (H2O2) content of alfalfa and wheat treated with different concentrations of leaching solution

相對(duì)膜透性的大小與植物抗逆性的強(qiáng)弱有關(guān)。苜蓿、小麥的自毒效應(yīng)對(duì)相對(duì)膜透性的影響趨勢(shì)一致，隨浸提液濃度增加而增大；他感效應(yīng)對(duì)相對(duì)膜透性的影響趨勢(shì)也大體一致，呈先減少后增加趨勢(shì)(圖9)。苜蓿浸提液濃度為 0.1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的相對(duì)膜透性與對(duì)照無(wú)顯著差異(P＜0.05)， 濃度為0.25、0.5和1 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的相對(duì)膜透性分別較對(duì)照高出8.30%、12.85%和24.76%；苜蓿浸提液濃度為 0.1、0.25 和 0.5 g·L-1時(shí)，受體小麥的相對(duì)膜透性分別低于對(duì)照8.79%、15.33%和4.92%，濃度為1 g·L-1時(shí)，相對(duì)膜透性顯著高于對(duì)照 22.69%(P＜0.05)。小麥浸提液濃度為 0.1 g·L-1時(shí)，受體小麥相對(duì)膜透性與對(duì)照無(wú)顯著差異(P＜0.05)，小麥浸提液濃度為 0.25、0.5 和 1 g·L-1時(shí)，受體小麥的相對(duì)膜透性分別較對(duì)照高出12%、16.88%和29.05%；小麥浸提液濃度為0.1、0.25和0.5 g·L-1時(shí)，受體苜蓿的相對(duì)膜透性分別低于對(duì)照11.10%、25.44% 和 12.75%，濃度為 1 g·L-1時(shí)，苜蓿的相對(duì)膜透性高于對(duì)照9.18%。

圖 9 浸提液濃度處理的苜蓿、小麥相對(duì)膜透性Figure 9 Relative membrane permeability of alfalfa and wheat treated with different concentrations of leaching solution

3 討論與結(jié)論

Rice[23]認(rèn)為，他感作用是指由植物或微生物釋放到環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)而對(duì)其他植物或微生物的生長(zhǎng)發(fā)育所產(chǎn)生的有利或不利的作用，他涵蓋了各種植物之間、微生物之間生化相生及相克作用。自毒作用是植物種內(nèi)相互影響的方式之一，是一種特殊的生存競(jìng)爭(zhēng)[24]，當(dāng)自毒物質(zhì)積累到一定程度并超過(guò)某一臨界濃度以后會(huì)產(chǎn)生自毒效應(yīng)，抑制了體內(nèi)某些重要酶的活性，從而使膜質(zhì)受到過(guò)多自由基的傷害，損傷了體內(nèi)的膜系統(tǒng)，導(dǎo)致各項(xiàng)生理代謝受阻，抑制生長(zhǎng)[25]。有研究發(fā)現(xiàn)刀豆氨酸(canavanine)具有自毒效應(yīng)，但含量低于1%，自毒效應(yīng)不嚴(yán)重，當(dāng)含量高于1%時(shí)，自毒效應(yīng)明顯。說(shuō)明自毒物質(zhì)具有“高抑低促”的濃度效應(yīng)[26]。植物在正常生長(zhǎng)條件下體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡中，自由基濃度較低，不會(huì)引起植物傷害[27]，但在逆境下會(huì)產(chǎn)生活性氧的積累，加劇膜脂的過(guò)氧化而導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損，影響細(xì)胞功能[28]。SOD、CAT和POD酶組成有效清除活性氧自由基的抗氧化酶系統(tǒng)，維持體內(nèi)的活性氧代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)[29]。本研究結(jié)果顯示，苜蓿浸提液抑制受體苜蓿的整體生長(zhǎng)，并且隨著浸提液濃度增大，抑制作用增強(qiáng)。小麥浸提液對(duì)受體小麥的自毒效應(yīng)與苜蓿浸提液對(duì)受體苜蓿的自毒效應(yīng)類同。說(shuō)明浸提液濃度是自毒效應(yīng)強(qiáng)弱的重要依據(jù)，浸提液通過(guò)降低酶活性，影響細(xì)胞膜的透性，促進(jìn)過(guò)氧化物含量增多，產(chǎn)生毒害作用[30-31]。

苜蓿和小麥浸提液異種間處理，濃度為0.1、0.25和 0.5 g·L-1時(shí)，SOD、POD、CAT 酶活性增強(qiáng)，MDA、H2O2含量和相對(duì)膜透性減少，保護(hù)酶類活性增強(qiáng)可以有效清除活性氧并將其維持在降低的水平，保護(hù)細(xì)胞不受傷害，從而對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，濃度為1 g·L-1時(shí)，SOD、POD、CAT酶活性開始減弱，MDA、H2O2含量和相對(duì)膜透性增加積累，活性氧得不到有效清除，從而導(dǎo)致種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)受到抑制。有研究表明苜蓿植株浸提液對(duì)苜蓿有“高抑低促”的濃度效應(yīng)，在達(dá)到某“閾值”濃度時(shí)表現(xiàn)出自毒作用，超過(guò)此閾值越大，自毒效應(yīng)越顯著[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿-小麥輪作能夠顯著提高小麥的籽粒產(chǎn)量，與小麥-小麥連作比較，小麥籽粒產(chǎn)量增加[14]，本研究結(jié)果顯示，當(dāng)苜蓿和小麥浸提液濃度在0.1、0.25和0.5 g·L-1時(shí)，能夠有效緩解小麥和苜蓿的自毒效應(yīng)，且浸提液濃度為0.25 g·L-1時(shí)達(dá)到最佳，并且小麥浸提液對(duì)苜蓿的他感促進(jìn)作用較苜蓿浸提液對(duì)小麥的他感促進(jìn)作用強(qiáng)烈。

植物在逆境環(huán)境中，體內(nèi)活性氧代謝平衡會(huì)被打破，過(guò)氧化物質(zhì)大量產(chǎn)生并積累，導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷和細(xì)胞氧化，并大量積累過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，從而引起植物的氧化傷害。幼苗浸提液是一種混合液，其可能包含多種單個(gè)物質(zhì)或混合物質(zhì)，自毒作用和他感作用都具有兩面性，而浸提液的濃度往往是促進(jìn)或抑制受體生長(zhǎng)的綜合因素。自毒作用和他感作用的機(jī)理是復(fù)雜多樣的，還需要更廣泛、深層次的研究去繼續(xù)探明其發(fā)生的反應(yīng)和次生變化，為糧草合理輪作及開發(fā)利用提供有力的理論依據(jù)。