將熒光檢測(cè)技術(shù)引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的實(shí)踐與探索

葉 君, 熊 犍, 吳勝龍, 何婉芬

(華南理工大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州 510640)

2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給了下村修、馬丁·查爾菲和錢(qián)永健,以獎(jiǎng)勵(lì)他們?cè)诰G色熒光蛋白(GFP)領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)[1]。瑞典皇家學(xué)會(huì)諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)評(píng)選委員會(huì)對(duì)綠色熒光蛋白的評(píng)價(jià)指出,綠色熒光蛋白已經(jīng)成為現(xiàn)代生物科學(xué)的重要工具之一[2]。以2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)為契機(jī),熒光探針技術(shù)受到了人們的廣泛關(guān)注[3-6]。經(jīng)過(guò)多年探究,綠色熒光蛋白在生物醫(yī)學(xué)界已經(jīng)得到非常廣泛的應(yīng)用,以綠色熒光蛋白為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的多色熒光探針技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域[7-11]。

本文將科研新成果應(yīng)用到本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中,構(gòu)建一種合成條件溫和、操作簡(jiǎn)單的新型稀土熒光探針羧甲基纖維素/Tb(Ⅲ)復(fù)合物,應(yīng)用于自來(lái)水中Mn2+的檢測(cè)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,學(xué)生應(yīng)用自己合成的熒光探針檢測(cè)自己生活和工作中的用水,不僅提高了本科生在學(xué)科領(lǐng)域中的前瞻性,而且實(shí)驗(yàn)的實(shí)用性強(qiáng)、趣味性高,教學(xué)質(zhì)量大大提高,有利于培養(yǎng)本科生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新能力。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 CMC/Tb (Ⅲ) 復(fù)合物的制備

將3×10-4mol的TbCl3溶液,緩慢滴加至1%(w%)的羧甲基纖維素(CMC)的溶液中,并輔以攪拌,調(diào)節(jié)pH值至7,在70 ℃下反應(yīng)30 min,冷卻至室溫,用透析袋透析,用濃度為0.1 mol/L的AgNO3溶液檢測(cè)透析液中的Cl-,直至透析液無(wú)白色沉淀為止,然后將樣品置于60 ℃下烘干備用。該反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征,如傅里葉轉(zhuǎn)化紅外、掃描電鏡等均與文獻(xiàn)[12]一致,說(shuō)明所合成的產(chǎn)物為CMC/Tb(Ⅲ)復(fù)合物。

1.2 MnCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱量0.125 9 g的MnCl2固體,置于小燒杯中,加入適量的去離子水溶解后,移至10 mL的容量瓶中定容,得到濃度為0.1 mol/L的MnCl2溶液。用移液管移取不同體積的新鮮溶液,分別在100 mL的容量瓶中定容,得到濃度分別為1 mmol/L、0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、0.4 mmol/L、0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、0.08 mmol/L、0.06 mmol/L、0.04 mmol/L、0.02 mmol/L、0.01 mmol/L、1 μmol/L、0.1 μmol/L的MnCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 熒光探針對(duì)Mn2+的檢測(cè)

用移液管分別移取不同濃度的MnCl2溶液加入到1%的 CMC/Tb(Ⅲ)懸浮液中,將其混合均勻,反應(yīng)3 min后,移至石英比色皿中,置于熒光光譜儀中以波長(zhǎng)為 370 nm的激發(fā)光激發(fā)檢測(cè)其熒光光譜,通過(guò)對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針熒光光譜特性的變化的研究,探究不同濃度的Mn2+對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針熒光性質(zhì)的影響。

1.4 熒光探針對(duì)自來(lái)水中的Mn2+的檢測(cè)

采用加標(biāo)回收法[13]檢測(cè)自來(lái)水中Mn2+的濃度。實(shí)驗(yàn)中所用的自來(lái)水采集自某大學(xué)的食堂、宿舍及實(shí)驗(yàn)室3個(gè)不同的供水系統(tǒng)。將不同量的MnCl2加入到上述水樣中,制得濃度為10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的MnCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液。將不同濃度的MnCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別用移液管移取0.6 mL,加入至 2.4 mL質(zhì)量濃度為1%的CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針中, 反應(yīng)3 min后,測(cè)試其熒光強(qiáng)度的變化。測(cè)試條件與以上實(shí)驗(yàn)條件保持一致。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 熒光探針的選取

不同濃度的CMC/Tb (Ⅲ) 懸浮液在波長(zhǎng)為370 nm的激發(fā)光激發(fā)下的熒光性質(zhì)如圖1所示。從圖1的熒光發(fā)射圖譜中,可以觀察到在489、544、585 及 606 nm處共有4個(gè)發(fā)射峰,他們分別歸屬于從Tb3+的5D4能級(jí)到7FJ(J = 6, 5, 4, 3)能級(jí)的電子躍遷[14],這說(shuō)明制備的CMC/Tb(Ⅲ)懸浮液展現(xiàn)出鋱的特征發(fā)射圖譜。此外,隨著CMC/Tb (Ⅲ)濃度的增加,CMC/Tb (Ⅲ)懸浮液的熒光強(qiáng)度FI也在不斷增加。當(dāng)懸浮液的濃度控制在1%時(shí),該懸浮液依舊具有很高的熒光強(qiáng)度,該強(qiáng)度仍可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的熒光強(qiáng)度的檢測(cè)要求,并且該濃度條件下的懸浮液仍然具有很高的同質(zhì)性和穩(wěn)定性,出于成本和對(duì)環(huán)境保護(hù)等方面的綜合考慮,采用質(zhì)量濃度為1.0%的CMC/Tb (Ⅲ) 懸浮液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的熒光檢測(cè)探針。

圖1 不同濃度(0.5%～5%)的CMC/Tb(Ⅲ)懸浮液 熒光光譜對(duì)比

2.2 CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針對(duì)水溶液中Mn2+ 檢測(cè)的選擇性

圖2 陽(yáng)離子對(duì)CMC/Tb (Ⅲ)熒光強(qiáng)度的影響

陰離子對(duì)CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針熒光強(qiáng)度的影響如圖3所示。與上述陽(yáng)離子的影響類似,當(dāng)Mn2+加入至上述其他金屬離子與CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的混合溶液后,CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在544 nm處的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)明顯下降。這表明其他的金屬離子及陰離子對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的熒光強(qiáng)度并沒(méi)有明顯的影響,且當(dāng)其他陽(yáng)離子存在時(shí)并不會(huì)對(duì)Mn2+與CMC/Tb(Ⅲ)的相互作用產(chǎn)生干擾,也就是說(shuō)CMC/Tb(Ⅲ) 熒光探針對(duì)Mn2+的檢測(cè)具有很好的選擇性。

圖3 陰離子對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針熒光強(qiáng)度的影響

2.3 CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針對(duì)水溶液中Mn2+ 的熒光響應(yīng)

為了確定CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在對(duì)Mn2+檢測(cè)的應(yīng)用表現(xiàn),如檢測(cè)的靈敏性等,考察了不同濃度的Mn2+對(duì)CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同濃度的Mn2+對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)熒光強(qiáng)度的影響

在加入Mn2+后,熒光探針依舊表現(xiàn)出鋱的特征發(fā)射光譜,但是隨著Mn2+濃度的增加,CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在544 nm處的熒光強(qiáng)度也隨之降低,當(dāng) Mn2+的濃度增加至1 mmol/L時(shí),CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在544 nm處的熒光強(qiáng)度降低至最初強(qiáng)度的23.4%。另外,當(dāng)以365 nm紫外光照射CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針時(shí),可以觀察到明顯的綠色熒光,隨著Mn2+濃度的增加,CMC/Tb (Ⅲ) 熒光探針在紫外燈下發(fā)射的綠色熒光也逐漸變?nèi)?直至完全消失。CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的這種可見(jiàn)綠光顏色的變化,有助于通過(guò)肉眼對(duì)水溶液中Mn2+的存在與否進(jìn)行快速直觀的判斷。更重要的是,當(dāng)Mn2+的濃度范圍在0.1～100 μmol/L時(shí), CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針在544 nm處的熒光強(qiáng)度與Mn2+的濃度之間具有良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2=0.9924)。用Borràs方法[15]得到其檢出限為0.046 μmol/L(信噪比為3),該檢出限遠(yuǎn)低于美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(0.3 mg/L)以及世界衛(wèi)生組織(0.4 mg/L)在飲用水中的最高限量標(biāo)準(zhǔn)[16]。通過(guò)以上的分析和討論,發(fā)現(xiàn)CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針對(duì)于水溶液中Mn2+的檢測(cè)具有很高的靈敏性。

2.4 CMC/Tb (Ⅲ) 熒光探針對(duì)Mn2+的熒光響應(yīng)時(shí)間

為了提高CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針在Mn2+檢測(cè)中的準(zhǔn)確度,研究了二者之間的響應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。如圖5所示,Mn2+對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的熒光響應(yīng)非常迅速,在1 min內(nèi)熒光響應(yīng)已經(jīng)幾乎達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),這表明CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針對(duì)水溶液中的Mn2+具有快速響應(yīng)的能力,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)水溶液中Mn2+的快速檢測(cè)。為了確保Mn2+與CMC/Tb (Ⅲ) 熒光探針之間能夠完全反應(yīng),使實(shí)驗(yàn)具有更高的準(zhǔn)確性,選擇反應(yīng)時(shí)間為3 min作為在實(shí)際應(yīng)用中的檢測(cè)時(shí)間。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針熒光強(qiáng)度的影響

2.5 自來(lái)水中Mn2+的檢測(cè)

為了進(jìn)一步證明該探針在實(shí)際環(huán)境中的可用性和實(shí)用性,采用加標(biāo)回收法對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在檢測(cè)自來(lái)水中的Mn2+的應(yīng)用表現(xiàn)進(jìn)行了研究。將不同量的MnCl2樣品加入到自來(lái)水中配置得到MnCl2的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以CMC/Tb(Ⅲ)作為熒光探針對(duì)該樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表1所示。Mn2+在標(biāo)準(zhǔn)自來(lái)水溶液中的回收率在97.10% 到101.61%之間,并且所有樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD, n=5)小于2.04%。這些數(shù)據(jù)表明,CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在自來(lái)水中Mn2+的檢測(cè)中顯現(xiàn)出很好的準(zhǔn)確性和可行性。

表1 Mn2+ 在自來(lái)水樣品中的回收率

2.6 實(shí)驗(yàn)小結(jié)

(1) CMC/Tb(Ⅲ)復(fù)合物熒光探針在水溶液中Mn2+的檢測(cè)中顯現(xiàn)出快速熒光響應(yīng)的良好性能,并且對(duì)Mn2+的檢測(cè)上具有很高的選擇性和靈敏性。該探針對(duì)Mn2+的熒光響應(yīng)可以在1 min內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定,且其他離子對(duì)CMC/Tb(Ⅲ)探針檢測(cè)Mn2+的干擾性很小。

(3) 該探針可以應(yīng)用于自來(lái)水中Mn2+的檢測(cè),可實(shí)現(xiàn)對(duì)水溶液中Mn2+的快速檢測(cè)。與其他的 Mn2+檢測(cè)方法相比,所合成的CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針具有合成過(guò)程簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和的優(yōu)勢(shì),并且具有操作簡(jiǎn)便、靈敏性高、抗干擾性好的特點(diǎn)。

3 教學(xué)效果

3.1 開(kāi)拓知識(shí)視野

將研究領(lǐng)域中的前沿成果引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué),對(duì)學(xué)生來(lái)說(shuō),可以增加專業(yè)理論知識(shí),開(kāi)闊視野,提高專業(yè)興趣,激發(fā)好奇心,提升發(fā)現(xiàn)問(wèn)題的能力。

3.2 培養(yǎng)創(chuàng)新意識(shí)

通過(guò)該實(shí)驗(yàn),學(xué)生不僅能加深對(duì)本專業(yè)前沿領(lǐng)域的理解,還可聯(lián)系水安全這樣的熱點(diǎn)問(wèn)題,逐步培養(yǎng)學(xué)生形成創(chuàng)新意識(shí)所必需的素養(yǎng),諸如興趣愛(ài)好、求知欲望以及好奇心態(tài)等,從而培養(yǎng)學(xué)生對(duì)待創(chuàng)新的自覺(jué)的、主動(dòng)的態(tài)度[17]。