RNAi抑制NOB1表達(dá)對(duì)肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖及p38MAPK磷酸化水平的影響

張 斌，劉 岳，林建清，倪亞安，毛盛名

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院(清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院)肝膽外科 廣東清遠(yuǎn) 511518

肝癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素引起的復(fù)雜病理過(guò)程，其受到細(xì)胞內(nèi)多種基因的嚴(yán)格調(diào)控[1]。研究[2]顯示，腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖和凋亡減少是肝癌發(fā)生及發(fā)展的重要原因。Nin1結(jié)合蛋白(Nin one binding protein, NOB1)是一種重要的多功能核蛋白，與組織炎癥、細(xì)胞凋亡等具有密切關(guān)系，參與核糖體40S小亞基組成，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用[3-4]。很多研究顯示，NOB1在腫瘤中高表達(dá)，目前已經(jīng)證實(shí)的有膠質(zhì)瘤[5]、胃癌[6]、肝癌[7]等。在肺癌細(xì)胞中的研究[8]表明，下調(diào)NOB1表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)在肝癌中活性降低，阻斷其激活可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[9]。有研究[10]表明，NOB1表達(dá)下調(diào)可以激活甲狀腺癌細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)通路。本研究觀察了下調(diào)NOB1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及p38MAPK磷酸化水平的影響，探討靶向NOB1治療肝癌的可行性，為研究NOB1在腫瘤中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑陰性對(duì)照(siRNA-NC)慢病毒和NOB1 siRNA慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建包裝，siRNA-NC序列為5’-TTCTC CGAACGTGTCACGT-3’，NOB1 siRNA序列為5’-CCAAGGAAGTGCAATTGCATA-3’;肝癌BEL-7402細(xì)胞購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司 ；NOB1、β-actin引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；NOB1抗體、p38MAPK抗體購(gòu)自上?？祈樕锟萍加邢薰?；磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)抗體、活化的Caspase-3(C-Caspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞分組和慢病毒感染將肝癌BEL-7402細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)添加慢病毒顆粒(MOI=10)繼續(xù)培養(yǎng)10 h，把培養(yǎng)液更換成含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)2 d后以嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染的肝癌細(xì)胞用于后續(xù)研究。肝癌細(xì)胞分為空白對(duì)照組、siRNA-NC組、NOB1 siRNA組 3組，其中siRNA-NC組、NOB1 siRNA組分別為穩(wěn)定感染siRNA-NC和NOB1 siRNA慢病毒的肝癌細(xì)胞，空白對(duì)照組為不做慢病毒感染的肝癌細(xì)胞。

1.3qRT-PCR檢測(cè)NOB1表達(dá)水平在3組細(xì)胞中添加1 mL的Trizol裂解液，吹打混合后，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：10.0 μL的2×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，1.2 μL的50 nmol的反轉(zhuǎn)錄引物，2.0 μL的RNA，0.2 μL的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，加DEPC水至20.0 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min。NOB1 上游引物5’-GAACCGGAGGAAGGAACTCACC-3’，下游引物5’-CCCAGATTTCTCATCTTCCAGTTTG-3’；β-actin 上游引物5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游引物5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。PCR反應(yīng)體系：10.00 μL的2×定量PCR Master Mix，0.08 μL的上、下游引物，2.00 μL的cDNA模板，0.40 μL的Taq DNA聚合酶，2.00 μL的cDNA模板，添加ddH2O至20.00 μL。PCR程序：95 ℃ 180 s；95 ℃12 s，62 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Westernblot檢測(cè)NOB1、p38MAPK、p-p38MAPK、C-Caspase-3表達(dá)水平在3組細(xì)胞中添加蛋白裂解液，完全裂解后4 ℃高速離心10 min，吸取蛋白上清液，添加Loading Buffer混合，100 ℃反應(yīng)5 min。配制50 g/L的濃縮膠和100 g/L的分離膠，每孔中添加40 μg的蛋白樣品，電泳2.5 h。把PVDF膜放在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡10 min，以30 mA電流進(jìn)行半干轉(zhuǎn)移，用50 g/L牛血清白蛋白封閉2 h，再把PVDF膜放在按1∶600稀釋的一抗反應(yīng)液中室溫反應(yīng)2 h。將PVDF膜與二抗孵育反應(yīng)1.5 h后，添加ECL顯色液。用Image J進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況取3組細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/mL，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，放于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育，分別在培養(yǎng)1、2、3、4 d后取出培養(yǎng)板，吸棄上清液，加入100 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL的CCK-8反應(yīng)液孵育4 h，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況取3組細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，1 000×g離心10 min，添加冰預(yù)冷后的PBS洗滌3次，與300 μL的Binding Buffer混勻，再添加PI和Annexin V-FITC工作液各5 μL，加入200 μL的Binding Buffer混勻，放在避光條件下孵育15 min，在60 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間NOB1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量，A值，凋亡率，C-Caspase-3、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞NOB1mRNA、蛋白表達(dá)水平的比較NOB1 siRNA能夠下調(diào)BEL-7402細(xì)胞中NOB1的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

2.2 3組細(xì)胞A值比較NOB1 siRNA組BEL-7402細(xì)胞在450 nm處的A值均降低，見(jiàn)表2。

1：空白對(duì)照組；2：siRNA-NC組；3：NOB1 siRNA組

組別nNOB1 mRNANOB1蛋白空白對(duì)照組31.00±0.010.68±0.09siRNA-NC組31.01±0.150.67±0.06NOB1 siRNA組30.43±0.06?0.28±0.04?F38.01235.211P<0.001<0.001

*：與空白對(duì)照組、siRNA-NC組比較，P<0.05

表2 3組細(xì)胞A值比較

*：與空白對(duì)照組、siRNA-NC組比較，P<0.05

2.3 3組細(xì)胞凋亡率和C-Caspase-3、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的比較NOB1 siRNA組BEL-7402細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中C-Caspase-3、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平升高，見(jiàn)圖2、3和表3。

1：空白對(duì)照組；2：siRNA-NC組；3：NOB1 siRNA組

1：空白對(duì)照組；2：siRNA-NC組；3：NOB1 siRNA組

組別n凋亡率/%C-Caspase-3p38MAPKp-p38MAPK空白對(duì)照組32.16±0.150.10±0.020.92±0.110.25±0.08siRNA-NC組32.17±0.200.11±0.040.90±0.100.27±0.06NOB1 siRNA組316.98±1.40?0.46±0.07?0.91±0.090.48±0.05?F325.56454.8260.03011.688P<0.001<0.0010.9710.009

*：與空白對(duì)照組、siRNA-NC組比較，P<0.05

3 討論

NOB1具有多種生物學(xué)功能，不僅參與調(diào)控20S蛋白酶體的成熟，還是19S核糖體調(diào)節(jié)亞基的組成部分，參與核糖體40S小亞基的組裝過(guò)程[11]，其表達(dá)水平的變化可以影響蛋白酶體及核糖體的合成。NOB1在人體的肝臟、脾臟等組織中表達(dá)，在結(jié)腸、胎盤(pán)等組織中低表達(dá)，參與人體組織發(fā)育和疾病發(fā)生[12]。NOB1在卵巢癌組織中的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均明顯高于卵巢良性腫瘤組織和正常卵巢組織，下調(diào)NOB1表達(dá)可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力[13]。在甲狀腺癌[10]、卵巢癌[12]、食管癌[14]等腫瘤組織中均已證實(shí)NOB1是一種癌基因，下調(diào)其表達(dá)可以降低癌細(xì)胞的增殖能力。NOB1在肝癌組織中的表達(dá)水平高于正常肝組織和肝硬化組織，且NOB1表達(dá)水平的高低與腫瘤的大小有關(guān)[7]。

增殖和凋亡是細(xì)胞重要的生物學(xué)特性，是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要途徑之一，細(xì)胞惡性增殖、凋亡減少是腫瘤發(fā)生的重要原因[15]。Caspase-3是目前公認(rèn)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子，其在正常情況下以沒(méi)有活性的酶原形式存在，只有活化后才具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，Caspase-3活化也是細(xì)胞凋亡不可逆反應(yīng)的標(biāo)志[16]。研究[17-18]表明，下調(diào)NOB1可以通過(guò)激活Caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，RNAi下調(diào)NOB1表達(dá)后的肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖能力降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中Caspase-3活化水平升高，下調(diào)NOB1具有抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。

p38MAPK蛋白是由360個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其在人體組織中均有表達(dá)，在細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過(guò)程中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，參與多種疾病的發(fā)生[19]。研究[20]顯示，p38MAPK過(guò)度激活抑制腫瘤的發(fā)生，p38MAPK在腫瘤組織中磷酸化水平降低，促進(jìn)其激活后可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖等惡性表型。p38MAPK不僅參與腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程，還參與NOB1調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的過(guò)程，在甲狀腺癌的研究[10]中發(fā)現(xiàn)，NOB1具有負(fù)調(diào)控細(xì)胞中p38MAPK活化水平的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)NOB1后的肝癌BEL-7402細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平升高。

NOB1在肝癌中發(fā)揮癌基因的作用，可能是肝癌治療的潛在靶點(diǎn)，下調(diào)NOB1具有抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與激活p38MAPK有關(guān)，這證實(shí)了NOB1在肝癌細(xì)胞中的作用。本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有對(duì)其具體的作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)上述部分進(jìn)行深入研究。