用于富集磷酸化合物的溫度敏感親和色譜材料的制備及其應(yīng)用

戴國(guó)鑫, 王 迪, 王 彥, 曹之涵, 戴榮繼

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081)

蛋白質(zhì)的可逆磷酸化,是一種極為重要且廣泛存在的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[1-5]。蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是受蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶共同作用的結(jié)果。這一過(guò)程參與調(diào)控了包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性調(diào)節(jié)、分子間相互識(shí)別和作用、細(xì)胞分裂和凋亡等幾乎所有重要的生命過(guò)程[6-9]。

異常的磷酸化過(guò)程會(huì)直接影響蛋白質(zhì)的諸多特性,包括蛋白質(zhì)間的作用機(jī)制、空間結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位等,進(jìn)而導(dǎo)致一些惡性疾病的發(fā)生,包括阿爾茨海默氏病、心血管疾病、糖尿病和癌癥等[10-14]。因此,對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行高效的分離鑒定,有助于全面深入地研究與思考,有利于更深層次地理解復(fù)雜的生命活動(dòng),闡明生理病理變化機(jī)理。

磷酸化蛋白質(zhì)的豐度往往很低,離子化程度小,其質(zhì)譜信號(hào)經(jīng)常被一些高豐度蛋白質(zhì)和大量非磷酸化蛋白質(zhì)掩蓋,導(dǎo)致無(wú)法分析鑒定。因此需要將低豐度的磷酸化蛋白質(zhì)富集后分析。目前,常用來(lái)富集和分離磷酸化蛋白質(zhì)的方法有免疫親和沉淀法、色譜法和化學(xué)修飾磷酸基團(tuán)法。其中方法最成熟、應(yīng)用最廣泛的是固定金屬離子親和色譜法和金屬氧化物親和色譜法[15-18]。但這兩種方法往往需要以切換流動(dòng)相的方式達(dá)到富集目的,而且流動(dòng)相通常為濃度較高的鹽溶液或是有機(jī)溶劑占比較高的混合液,這些條件均會(huì)對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能造成影響。

溫度敏感聚合物(temperature-responsive polymers)是一種智能高聚物。聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)因具有極窄的相變溫度區(qū)間(1～2 ℃)和接近人類(lèi)體溫的最低臨界溶解溫度(LCST, 31 ℃),而被深入研究并廣泛應(yīng)用[19,20]。

本文基于表面引發(fā)的可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(SI-RAFT)法,通過(guò)快速引入官能團(tuán)法制備了二氧化硅@聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-氨甲基膦酸)-鈦離子(Ⅳ)(silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+)溫度敏感色譜固定相,通過(guò)對(duì)4種類(lèi)固醇的分離,表征了其溫度敏感性能。對(duì)該材料的接枝構(gòu)象和使用時(shí)流動(dòng)相的pH值進(jìn)行了優(yōu)化。最后,在溫和pH條件下測(cè)試了其對(duì)三磷酸腺苷(ATP)的捕獲和釋放性能。實(shí)現(xiàn)了silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+對(duì)ATP的富集和快速分離,為在溫和條件下對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的富集奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司); VERTEX 70v FT-IR紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司); Quanta 200F場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡(美國(guó)FEI公司); PHI Quantera II掃描微區(qū)X射線光電子能譜儀(XPS,日本Ulvac-PHI公司); DISCOVERY熱失重分析儀(TGA)、Q2000差示掃描量熱儀(美國(guó)TA公司); FA2004電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司); STARTER 3100 pH計(jì)(上海奧豪斯儀器有限公司)。

NIPAAm為分析純,購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社;ATP純度≥98%, 4-二甲氨基吡啶(DMPA)、乙酰甘氨酸、N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)純度均≥99%,N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(NAS)純度為98%,偶氮二異丁腈(AIBN)、氨甲基磷酸(AMPA)均為分析純,以上均購(gòu)自北京百靈威科技有限公司;氨基化硅膠(silica@NH2)粒徑為5 μm,孔徑為3×10-8m,購(gòu)自天津博納艾杰爾科技有限公司;二硫化碳、三辛基甲基氯化銨、正十二硫醇純度均≥98%,三氯甲烷為分析純,以上均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫化可的松、地塞米松、丁酸氫化可的松、醋酸潑尼松龍純度均≥99%,均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。其他試劑如乙醇、甲醇、1,4-二氧六環(huán)、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃和二甲基甲酰胺等均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司,使用之前均用氫化鈣、無(wú)水硫酸鎂等試劑除水、蒸餾，待用。

1.2 色譜材料的制備

1.2.1鏈轉(zhuǎn)移劑(CTA)的制備

S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯的制備主要參照文獻(xiàn)提供的方法[21]。在250 mL三口圓底燒瓶中加入12 mL正十二硫醇、0.80 g三辛基甲基氯化銨和60 mL丙酮。在冰浴和氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下,滴加3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的氫氧化鈉溶液,攪拌20 min,然后將3 mL二硫化碳和6.5 mL丙酮一同注入三口燒瓶中,加入6 mL氯仿并繼續(xù)攪拌20 min。最后將13 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的氫氧化鈉溶液在30 min內(nèi)滴入,于室溫反應(yīng)12 h,加入100 mL水,在冰浴條件下用濃鹽酸酸化至pH值為3,抽濾,用100 mL異丙醇溶解固體,再次抽濾,收集濾液,濃縮,用正己烷重結(jié)晶,真空干燥,得到的金黃色晶體,即為S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯,作為CTA。

1.2.2CTA修飾硅膠(silica@CTA)的制備

30%接枝密度的silica@CTA:將1.0 g silica@NH2、0.6 g DMPA、60 mL二氯甲烷、0.486 g CTA和0.071 g乙酰甘氨酸加入三口瓶中,在氮?dú)獗Ｗo(hù)、冰浴條件下,將6 mL DIC在30 min內(nèi)滴入,于室溫反應(yīng)48 h。產(chǎn)品分別用二氯甲烷洗滌2次,用乙醇洗滌2次,用甲醇洗滌1次,并于45 ℃烘干。

50%接枝密度的silica@CTA:使用0.809 g CTA試劑和0.047 g乙酰甘氨酸,其余操作同制備30%接枝密度silica@CTA操作。

1.2.3silica@p(NIPAAm-co-NAS)的制備

將0.3 g 30%或50%接枝密度的silica@CTA、3.5 g NIPAAm、0.69 g NAS和15 mL 1,4-二氧六環(huán)加入到三口燒瓶中,在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下,加入30 mg AIBN,于60 ℃反應(yīng)12 h。產(chǎn)品用乙醇洗滌2次,用水洗滌2次,用甲醇洗滌1次,于50 ℃烘干。

1.2.4silica@p(NIPAAm-co-AMPA)的制備

將0.2 g AMPA溶于5 mL甲醇中,作為溶液A;將0.3 g silica@p(NIPAAm-co-NAS)溶于10 mL甲醇中,作為溶液B。在冰水浴條件下,將溶液A滴入溶液B中,反應(yīng)48 h,每隔2 h超聲5 min,最后用甲醇和水各洗滌3次,真空干燥。

1.2.5silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的制備

取0.25 g silica@p(NIPAAm-co-AMPA),溶于100 mmol/L Ti(SO4)2溶液中,攪拌8 h。攪拌完成后將產(chǎn)品離心分離并水洗3次,真空干燥后即得silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+,其合成流程圖見(jiàn)圖1。

圖 1 SI-RAFT法制備silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的流程圖Fig. 1 Flowchart of preparation of silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+ by surface initiated-reversible addition fragmentation chain transfer (SI-RAFT) methodNIPAAm: N-isopropylacrylamide; NAS: N-acryloxysuccinimide; AIBN: azodiisobutyronitrile.

1.2.6熱失重分析

TGA法測(cè)定各種材料的失重率,計(jì)算silica@p(NIPAAm-co-AMPA)的接枝率。測(cè)試條件:N2保護(hù),升溫速率為10 ℃/min,升溫范圍為30～800 ℃。

1.2.7差示掃描量熱(DSC)分析

DSC法用于表征溫度敏感聚合物的LCST。將silica@CTA和silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+在pH=7的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中溶脹達(dá)平衡,棄去水層得到水和硅膠。測(cè)試條件:N2保護(hù),升溫范圍為10～60 ℃,升溫速率為1 ℃/min。

1.2.8性能測(cè)試

使用實(shí)驗(yàn)室自制的裝柱系統(tǒng),將silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+溶解于甲醇中,裝入不銹鋼柱(50 mm×2.1 mm)中。成品柱連接到高效液相色譜儀上,用甲醇和水清洗待用。以4種類(lèi)固醇為分析對(duì)象,測(cè)試silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的溫度敏感性能,優(yōu)化其接枝構(gòu)象和使用該固定相時(shí)流動(dòng)相的pH值。以單磷酸腺苷(AMP)和NAS,以及ATP為分析對(duì)象測(cè)試該材料對(duì)含磷酸基團(tuán)的小分子化合物的捕獲和釋放性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 CTA的表征

對(duì)于RAFT法,CTA的使用是最重要的一環(huán),它直接決定反應(yīng)的成敗。本文選用活性較高的S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯作為CTA。合成CTA的反應(yīng)需要在強(qiáng)堿條件下進(jìn)行,并使用三辛基甲基氯化銨作為相轉(zhuǎn)移催化劑來(lái)實(shí)現(xiàn)合成。

通過(guò)分析CTA的傅里葉變換紅外光譜圖(見(jiàn)附圖1,http://www.chrom-China.com,下同),可以看出,1716 cm-1處歸屬于羧基中C=O的伸縮振動(dòng)峰；1280 cm-1處為硫酯基中C-S的伸縮振動(dòng)峰；1070 cm-1為硫酯基中C=S的伸縮振動(dòng)峰，而且在2918 cm-1處有明顯的C-H的彎曲振動(dòng)峰，說(shuō)明產(chǎn)物分子中含有羧基、硫酯基和亞甲基。通過(guò)分析核磁共振譜圖(見(jiàn)附圖2),進(jìn)一步證明合成的產(chǎn)物為S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯。

2.2 silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+制備過(guò)程的分析

先在silica@NH2表面修飾CTA,即制備silica@CTA。通過(guò)調(diào)整CTA和乙酰甘氨酸的比例控制硅膠表面CTA的密度,再用AIBN在硅膠表面引發(fā)NIPAAm和NAS的共聚,生成silica@p(NIPAAm-co-NAS)。然后利用氨甲基磷酸(AMPA)和NAS發(fā)生活性酯氨基置換反應(yīng),從而將磷酸基團(tuán)引入到高分子鏈上,即生成silica@p(NIPAAm-co-AMPA)。AMPA是鈦離子的螯合劑,由于其含有磷酸基團(tuán)而有利于提高材料的選擇性。最后,以Ti(SO4)2為鈦源,將鈦離子修飾在溫度敏感高分子鏈上,形成silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+。需要注意的是,在發(fā)生置換反應(yīng)時(shí)可能含有少量的NAS未參與反應(yīng),一般在材料制備好之后通過(guò)異丙胺來(lái)置換未反應(yīng)的NAS。

表 1 silica@NH2、silica@CTA、silica@p(NIPAAm-co-NAS)、silica@p(NIPAAm-co-AMPA)和 silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的組成元素含量Table 1 Constituent element contents of silica@NH2, silica@CTA, silica@p(NIPAAm-co-NAS), silica@p(NIPAAm-co-AMPA) and silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+ %

CTA: chain transfer agent; AMPA: (aminomethyl) phosphonic acid.

2.3 silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的表征

分別對(duì)silica@NH2、silica@CTA、silica@p(NIPAAm-co-NAS)和silica@p(NIPAAm-co-AMPA)進(jìn)行紅外光譜表征,鑒定合成材料中特殊官能團(tuán)的種類(lèi),結(jié)果見(jiàn)附圖3。對(duì)于silica@CTA(見(jiàn)附圖3b), 1 650 cm-1處為酰胺鍵中C=O的伸縮振動(dòng)峰,1 510 cm-1和1 470 cm-1為酰胺鍵中N-H的彎曲振動(dòng)峰,表明CTA被成功地接枝在硅膠上。對(duì)于silica@p(NIPAAm-co-NAS)(見(jiàn)附圖3c), 1 650 cm-1和1 550 cm-1為PNIPAAm的特征峰(酰胺Ⅰ和Ⅱ帶), 1 790 cm-1和1 740 cm-1為NAS中C=O的對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰,1 815 cm-1為NAS中琥珀酰亞胺中C=O的伸縮振動(dòng)峰,表明NIPAAm和NAS成功聚合。對(duì)于silica@p(NIPAAm-co-AMPA)(見(jiàn)附圖3d), NAS的3個(gè)特征峰較弱,在1 440 cm-1出現(xiàn)P-O的伸縮振動(dòng)峰,說(shuō)明AMPA已成功置換。

紅外光譜為定性測(cè)量方法,不能完全準(zhǔn)確地證明材料接枝情況。因此還需采用XPS來(lái)定量分析元素的組成。如表1所示,C 1代表碳元素,O 1s代表氧元素,N 1s代表氮元素,S 2p代表硫元素,P 2p代表磷元素,Ti 2p代表鈦元素。silica@NH2與silica@CTA相比,S元素從無(wú)到有,說(shuō)明S-1-十二烷基-S′-(α,α′-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯已成功接枝到硅膠表面;silica@p(NIPAAm-co-NAS)與silica@CTA相比,S元素的減少和O元素的增加,表明NIPAAm和NAS成功接枝到硅膠表面,佐證了紅外譜圖的結(jié)果;silica@p(NIPAAm-co-AMPA)與silica@p(NIPAAm-co-NAS)相比,其P元素的增加表明AMPA已成功置換。對(duì)于silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+,從表中可以看出,最終有0.54%的鈦離子被成功固定在色譜材料上。對(duì)比FT-IR和XPS的結(jié)果,表明silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+被成功合成。

小學(xué)低年級(jí)的學(xué)生對(duì)于識(shí)字學(xué)習(xí)，是他們的難點(diǎn)也是重點(diǎn)。因?yàn)閯偵闲W(xué)的學(xué)生還處于孩童階段，他們好動(dòng)頑皮，常會(huì)注意力不集中，但是有著強(qiáng)烈的好奇心。識(shí)字學(xué)習(xí)中可能認(rèn)得快也容易忘記。因此低年級(jí)學(xué)生的識(shí)字教學(xué)十分重要。

對(duì)于溫度敏感的色譜材料來(lái)說(shuō),接枝率是關(guān)乎其最終溫敏性能的重要參數(shù),而接枝率可以通過(guò)熱失重分析計(jì)算得到。附圖4為3種修飾硅膠的TGA圖。可以看出，silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+在100 ℃之前熱失重較小,主要是吸附在材料上的水分蒸發(fā)所致;250～450 ℃之間熱失重率變化最明顯,主要是接枝在硅膠表面上的聚合物和修飾基團(tuán)的受熱分解所致;當(dāng)溫度升到700 ℃時(shí),材料中的所有聚合物與修飾基團(tuán)完全被碳化,所以失重率已基本不變。silica@NH2、silica@CTA和silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+在100～700 ℃之間的失重率分別為5.20%、7.51%和23.18%,因此silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的接枝率為15.67%。

采用差示掃描量熱法表征silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的溫度敏感性能。附圖5為silica@CTA和silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的DSC圖。結(jié)果表明,silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+在36.5～45.6 ℃間有一個(gè)明顯的倒峰,其最低臨界溫度(LCST)為38.5 ℃。該材料相變溫度范圍在10 ℃之內(nèi),并具有溫度敏感性能。

2.4 silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的應(yīng)用研究

2.4.1溫度敏感性能測(cè)試

對(duì)于silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+,為進(jìn)一步考察其溫度敏感性能。選用4種類(lèi)固醇(氫化可的松、地塞米松、丁酸氫化可的松和醋酸潑尼松龍)作為標(biāo)準(zhǔn)分析物。觀察4種類(lèi)固醇在制備的色譜柱中的保留行為,以判斷材料對(duì)溫度的響應(yīng)的能力。如圖2所示,隨著溫度的升高,類(lèi)固醇色譜峰的個(gè)數(shù)從1個(gè)變成4個(gè),表明改變溫度能有效分離4種類(lèi)固醇。

圖 2 4種類(lèi)固醇在不同色譜柱溫度下的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the four kinds of steroids at the different column temperature Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; mobile phase: ultrapure water; flow rate: 0.15 mL/min; detection wavelength: 254 nm; injection volume: 3 μL. Peak identifications: 1. hydrocortisone; 2. dexamethasone; 3. hydrocortisone butyrate; 4. prednisolone acetate.

2.4.2接枝構(gòu)象的優(yōu)化及測(cè)試

類(lèi)固醇的分離結(jié)果表明所制備的材料具有良好的溫度敏感性能,符合溫度敏感材料的基本要求。silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+中引入了Ti4+離子,會(huì)影響水分子與溫敏材料間氫鍵的形成,從而對(duì)材料的溫敏性能產(chǎn)生影響。為了使材料的溫度敏感性能達(dá)到最佳,需要對(duì)silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+的接枝率和接枝密度進(jìn)行優(yōu)化。為此分別制備了接枝密度為30%和50%,以及接枝率在10%～15%、15%～20%、20%～25%和25%～30%之間共8種色譜材料,并探究其對(duì)類(lèi)固醇的分離效果(見(jiàn)附圖6)。結(jié)果表明,接枝密度為50%的修飾硅膠對(duì)醋酸潑尼松龍的分離效果要優(yōu)于接枝密度為30%的硅膠,而在兩種密度的硅膠中,當(dāng)接枝率在20%～25%時(shí),分離效果達(dá)到最佳。所以該材料的最佳接枝率為20%～25%,最佳接枝密度為50%。

圖 3 不同柱溫下AMP和NAS的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of adenosine monophosphate (AMP) and NAS at the different column temperatures Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; mobile phase: 48.5%(v/v)water-50%(v/v) acetonitrile (ACN)-1.5%(v/v) trifluoroacetic acid (TFA); detection wavelength: 260 nm; injection volume: 3 μL.

隨后用具有最佳構(gòu)象的材料對(duì)含磷酸基團(tuán)的化合物進(jìn)行分離,以AMP和NAS為分析對(duì)象。如圖3所示,當(dāng)柱溫為50 ℃時(shí),兩種物質(zhì)并沒(méi)有被完全分離;當(dāng)柱溫為10 ℃時(shí),兩種物質(zhì)被完全分開(kāi)。這是因?yàn)楫?dāng)溫度高于LCST時(shí),接枝在硅膠表面的溫度敏感高分子長(zhǎng)鏈處于蜷縮狀態(tài),修飾在長(zhǎng)鏈上的鈦離子被遮掩,不能與磷酸基團(tuán)充分接觸,所以并沒(méi)有起到分離AMP的作用;而當(dāng)溫度低于LCST時(shí),此時(shí)溫敏長(zhǎng)鏈處于伸展的狀態(tài),Ti4+充分暴露在流動(dòng)相中并與AMP發(fā)生相互作用,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)AMP的保留。隨著溫度上升,兩個(gè)物質(zhì)的色譜峰峰寬變大,這是分析物在聚合物鏈中擴(kuò)散的結(jié)果,屬于正?，F(xiàn)象。由此,達(dá)成了僅通過(guò)改變溫度就能實(shí)現(xiàn)對(duì)含有磷酸基團(tuán)的化合物的分離。

2.4.3流動(dòng)相pH值的優(yōu)化及測(cè)試

圖 4 不同流動(dòng)相pH值條件下PLP的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of pyridoxal phosphate (PLP) under the different pH values of the mobile phases Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; flow rate: 0.1 mL/min; detection wavelength: 260 nm; injection amount: 8 μL.

選取pH值分別為1、3、5和7的磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相測(cè)試材料對(duì)磷酸吡哆醛(PLP)的捕獲能力。如圖4所示,當(dāng)pH值從7降至3時(shí),PLP的保留時(shí)間逐漸增加,峰面積逐漸減少。這一現(xiàn)象符合固定鈦離子親和色譜的一般規(guī)律,當(dāng)pH值降低時(shí),Ti4+的酸性增強(qiáng)。由于電荷間相互作用,Ti4+與磷酸基團(tuán)的結(jié)合能力增強(qiáng),使PLP保留時(shí)間增加。當(dāng)pH降為3時(shí),PLP的色譜峰幾乎消失,這說(shuō)明固定相與PLP的結(jié)合能力達(dá)到最大,PLP幾乎完全被色譜柱捕獲。而當(dāng)pH值降為1時(shí),PLP的保留時(shí)間突然減小,說(shuō)明固定相對(duì)PLP幾乎沒(méi)有保留作用。這一現(xiàn)象和磷酸基團(tuán)的酸度有關(guān):當(dāng)酸性較強(qiáng)時(shí),磷酸基團(tuán)質(zhì)子化程度加強(qiáng),其羥基以H+的形式存在而失去和Ti4+的結(jié)合能力;當(dāng)堿性過(guò)強(qiáng)時(shí),Ti4+會(huì)以Ti(OH)4形式存在。因此過(guò)酸過(guò)堿都不利于磷酸基團(tuán)和鈦離子結(jié)合。故silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+捕獲磷酸化合物時(shí)的最優(yōu)pH值為3。

圖 5 在不同流動(dòng)相pH值條件下PLP和NAS的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of PLP and NAS under the different pH values of mobile phases Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; flow rate: 0.1 mL/min; detection wavelength: 280 nm; injection amount: 1 μL.

材料釋放磷酸化合物時(shí)流動(dòng)相的pH值也需要優(yōu)化,以PLP與NAS的混合樣品作為分析對(duì)象,考察流動(dòng)相pH值對(duì)材料釋放磷酸化合物的影響。如圖5所示,NAS中不含磷酸基團(tuán),故不能被色譜柱捕獲,均在進(jìn)樣后最先流出,故不參與討論。當(dāng)柱溫保持恒定(50 ℃),在30 min處切換流動(dòng)相pH值后,鈦離子與磷酸基團(tuán)之間的作用力消失,在40 min時(shí)PLP被完全釋放出來(lái),此時(shí)PLP的峰面積為完全釋放時(shí)的最大值(見(jiàn)圖5d)。當(dāng)保持流動(dòng)相pH值不變而改變柱溫時(shí),釋放效果會(huì)因pH值的不同而不同。當(dāng)pH=3時(shí),升溫后幾乎沒(méi)有色譜峰出現(xiàn),這說(shuō)明PLP并沒(méi)有被釋放出來(lái)(見(jiàn)圖5a);而隨著pH值的提高,PLP的峰面積逐漸增大,當(dāng)pH值上升至7時(shí),出現(xiàn)PLP的色譜峰(見(jiàn)圖5c),表明PLP被有效釋放,因此pH=7為材料釋放磷酸化合物時(shí)的最佳pH值。而此時(shí)PLP的峰面積與圖5d的峰面積幾乎相同,說(shuō)明該材料能通過(guò)改變溫度高效地釋放分析物,具有極佳的釋放性能。綜合以上結(jié)果,選用pH=7的流動(dòng)相進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)與分析。

選取ATP作為分析物,測(cè)試silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+對(duì)小分子磷酸化合物的捕獲和釋放性能。如圖6所示,曲線b和c分別表示在高溫(50 ℃)和低溫(10 ℃)的柱溫下ATP的色譜圖。可以看出,ATP的保留行為有明顯的溫度依賴(lài)性,柱溫為50 ℃時(shí),ATP在色譜柱上沒(méi)有保留,很快被洗脫;而柱溫為10 ℃時(shí),60 min內(nèi)ATP都沒(méi)有被洗脫下來(lái),證明被色譜柱完全捕獲。從曲線a可以看出,當(dāng)柱溫在進(jìn)樣后20 min由10 ℃升溫至50 ℃時(shí),低溫下捕獲的ATP被快速地釋放出來(lái)。以上結(jié)果表明silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+溫度敏感色譜材料可以?xún)H通過(guò)溫度的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化合物的捕獲和釋放。silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+具有優(yōu)良的釋放能力,被捕獲的ATP可以在7 min內(nèi)被釋放完全且回收率為85.2%。

圖 6 不同柱溫條件下ATP的色譜圖Fig. 6 Chromatograms of ATP at the different column temperatures Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; mobile phase: pH=7; flow rate: 0.1 mL/min; detection wavelength: 260 nm; injection volume: 3 μL.

2.4.4使用壽命研究

除了具有較好的釋放性能,silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+還具備使用壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)。雖然在使用過(guò)程中鈦離子會(huì)隨著使用次數(shù)的增加而減少,但是因?yàn)殁侂x子的固定條件溫和且固定成功率較高,因此可以通過(guò)在線補(bǔ)充的方式來(lái)恢復(fù)材料鈦離子的含量。如圖7所示,在使用兩周后(大于15次),該材料對(duì)于ATP的釋放性能降低,其釋放峰幾乎消失。而補(bǔ)充鈦離子后,材料釋放性能相應(yīng)提高,其釋放峰重新出現(xiàn)。

圖 7 鈦離子補(bǔ)充(a)前、(b)后ATP的色譜圖Fig. 7 Chromatograms of ATP (a) before and (b) after supplementation of titanium ion Stationary phase: silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+; mobile phase: pH=7; flow rate: 0.1 mL/min; detection wavelength: 260 nm; injection volume: 1 μL.

3 結(jié)論

本文基于SI-RAFT法,通過(guò)快速引入功能基團(tuán)成功制備了固定金屬離子溫度敏感親和色譜材料silica@p(NIPAAm-co-AMPA)-Ti4+。該富集材料具備溫度敏感性能，能實(shí)現(xiàn)在僅改變溫度不切換流動(dòng)相的條件下對(duì)磷酸化合物的在線選擇性富集與分離。該材料的成功合成為富集分離磷酸化蛋白質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。