芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1基因的克隆及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

楊青青， 劉潔霞， 徐志勝， 馮 凱， 黃 瑩， 熊愛(ài)生

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210095)

芹菜(ApiumgraveolensLinn.)隸屬于傘形科(Apiaceae)芹屬(ApiumLinn.)，是一種重要的葉菜類(lèi)蔬菜作物。芹菜原產(chǎn)于地中海和中東地區(qū)，在中國(guó)有著悠久的栽培歷史[1]。芹菜具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，富含類(lèi)胡蘿卜素、維生素、類(lèi)黃酮以及揮發(fā)性芳香成分，全株可入藥[2]。非生物脅迫是影響芹菜生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因子，如高溫、低溫、干旱和鹽脅迫會(huì)破壞芹菜細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，打亂植株自身的水分平衡，對(duì)芹菜植株的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生較大的影響，進(jìn)而影響芹菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。

ICE(inducerofCBFexpression)基因是誘導(dǎo)CBF基因家族表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，在植物中普遍存在。已有研究結(jié)果[4]表明：ICE蛋白定位于細(xì)胞核中，在低溫條件下，ICE蛋白被激活，達(dá)到活躍狀態(tài)，可以和CBF基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件有效結(jié)合，激活植物體內(nèi)響應(yīng)冷脅迫相關(guān)的代謝來(lái)抵御寒冷脅迫。對(duì)植物抗寒分子機(jī)制的研究結(jié)果[5]表明：冷脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)抗凍相關(guān)基因的表達(dá)，并且冷誘導(dǎo)基因(COR)在高等植物體內(nèi)普遍存在。ICE基因在植物遭遇低溫脅迫時(shí)，能夠識(shí)別CBF基因啟動(dòng)子中的冷調(diào)控元件ICE box，誘導(dǎo)CBF/DREB調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而提高植物的抗寒性[6-7]。ICE蛋白可以通過(guò)多種方式調(diào)控不同低溫應(yīng)答基因[7]。近年來(lái)，人們對(duì)植物抗寒基因ICE的研究取得了一定的進(jìn)展，ICE1基因的發(fā)現(xiàn)為提高植物的抗寒性提供了新的途徑。目前，已經(jīng)從茶樹(shù)〔Camelliasinensis(Linn.) O. Ktze.〕[4]、擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕[8]、異色菊〔Chrysanthemumdichrum(C. Shih) H. Ohashi et Yonek.〕[9]、蘿卜(RaphanussativusLinn.)[10]、蘋(píng)果(MaluspumilaMill.)[11]和胡蘿卜(Daucuscarotavar.sativaHoffm.)[12]等植物中分離鑒定出ICE基因，且通過(guò)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入ICE基因的植物抗逆性均有提高[13]。

芹菜品種‘津南實(shí)芹’(‘Jinnan Shiqin’)植株緊湊直立、分枝少、顏色淡綠、葉片肥大、不易先期抽薹，在中國(guó)南北地區(qū)四季均可以栽培[14]。本研究從芹菜品種‘津南實(shí)芹’中克隆得到AgICE1基因，對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)AgICE1基因在高溫、低溫、干旱及高鹽4種非生物脅迫下的相對(duì)表達(dá)水平，以期為進(jìn)一步開(kāi)展芹菜ICE轉(zhuǎn)錄因子的逆境調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，并為深入了解AgICE1基因在芹菜抵御非生物脅迫中的功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

芹菜品種‘津南實(shí)芹’由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。供試材料栽植于晝溫25 ℃、夜溫18 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1、空氣相對(duì)濕度60%～70%的人工氣候室內(nèi)。采集4月齡植株的根、葉柄和葉片，樣品采集后立即用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱，用于總RNA提取、cDNA合成及基因表達(dá)分析[15]。此外，選取長(zhǎng)勢(shì)均一的4月齡植株進(jìn)行高溫(38 ℃)、低溫(4 ℃)、干旱(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)20% PEG6000)和高鹽(0.2 mol·L-1NaCl)4種非生物脅迫處理，對(duì)照組用ddH2O處理，每個(gè)處理設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)。分別取處理0、1、2、4、8和24 h植株上部生長(zhǎng)健康的葉片，采用上述方法速凍，用于總RNA提取、cDNA合成及基因表達(dá)分析。

大腸桿菌菌株DH5α為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；凝膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；pMD19-T質(zhì)粒載體、TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000、SYBR?PremixExTaqTM試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 基于作者所在課題組保存的芹菜轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[16]，通過(guò)與其他物種ICE基因序列BLAST比對(duì)分析獲得芹菜品種‘津南實(shí)芹’ICE1基因的序列。根據(jù)開(kāi)放閱讀框(ORF)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，芹菜品種‘津南實(shí)芹’ICE1基因正向引物AgICE1-F的序列為5′-A￣T￣G￣C￣T￣C￣C￣C￣C￣A￣C￣C￣T￣C￣A￣A￣A￣C G￣A￣C￣G￣T-3′，反向引物AgICE1-R的序列為5′-C￣T￣A A￣A￣T￣T￣G￣C￣G￣C￣C￣A￣T￣G￣A￣A￣A￣A￣C￣C￣A￣G-3′。以‘津南實(shí)芹’葉片的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，包含cDNA模板1 μL、正向引物和反向引物各1 μL、ddH2O 7 μL以及ExTaq酶10 μL。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量濃度12 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測(cè)，回收產(chǎn)物連接pMD19-T質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α中，挑取單菌落搖菌，經(jīng)PCR檢測(cè)后交由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 氨基酸序列分析 各植物ICE轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列均來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，采用ExPASy網(wǎng)站(https：∥web.expasy.org/protparam/)的相關(guān)軟件對(duì)芹菜品種‘津南實(shí)芹’ICE1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸組成、理論相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)(pI)進(jìn)行分析[17]；采用DNAMAN軟件進(jìn)行ICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的多重比對(duì)及蛋白質(zhì)的親水性和疏水性預(yù)測(cè)，利用Blast Conserved Domains Search(https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)芹菜品種‘津南實(shí)芹’ICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行保守域預(yù)測(cè)，采用MEGA5對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行測(cè)試和編輯，生成報(bào)告圖形[18]。

1.2.3 RT-qPCR 根據(jù)SYBR?PremixExTaqTM試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行RT-qPCR，然后通過(guò)IQTM5 Real-time PCR System完成RT-qPCR檢測(cè)。相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算采用參照基因的ΔCT法，相對(duì)表達(dá)水平是基于處理組與對(duì)照組之間目標(biāo)基因相對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)量的比較[19]。以芹菜的actin基因作為內(nèi)參基因，該基因正向引物的序列為5′-A￣G￣A￣A￣G￣T￣C￣C￣T￣G￣T￣T￣C￣C￣A G￣C￣C￣G￣T￣C￣T￣T-3′，反向引物的序列為5′-C￣G￣A￣A￣C￣C￣A￣C C￣A￣C￣T￣G￣A￣G￣C￣A￣C￣T￣A￣T￣G￣T￣T-3′。用于AgICE1基因表達(dá)分析的正向引物AgICE1-qF的序列為5′-C￣T￣G￣C￣T￣T￣T A￣T￣C￣C￣C￣C￣T￣G￣C￣A￣T￣T￣T￣C￣C￣T-3′，反向引物AgICE1-qR的序列為5′-C￣A￣G￣T￣A￣C￣T￣A￣G￣T￣T￣A￣A￣C￣A￣A￣A￣G￣C￣T￣A￣A-3′。同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參基因與目標(biāo)基因，每個(gè)樣品分別設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。PCR反應(yīng)體系總體積20.0 μL，包含ddH2O 7.2 μL、SYBR Green Ⅰ mix 10.0 μL，cDNA模板2.0 μL以及正向熒光定量引物和反向熒光定量引物各0.4 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)；通過(guò)從65 ℃至95 ℃逐步擴(kuò)增加熱獲得熔解曲線。

采用Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，采用one-way ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用EXCEL 2007和SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析RT-qPCR數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 芹菜品種‘津南實(shí)芹’ICE1基因的克隆

以芹菜品種‘津南實(shí)芹’未經(jīng)脅迫處理葉片的cDNA為模板，用引物AgICE1-F和AgICE1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條長(zhǎng)約1 400 bp的目的片段(圖1)，片段大小與預(yù)期一致。將回收產(chǎn)物依次進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序，獲得芹菜品種‘津南實(shí)芹’ICE1基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列，命名為AgICE1基因。測(cè)序結(jié)果(圖2)顯示：克隆得到的AgICE1基因含有1個(gè)長(zhǎng)度為1 455 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼484個(gè)氨基酸。

2.2 芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列及其理化性質(zhì)分析

通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明：芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列與大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕、擬南芥和歐洲油菜(BrassicanapusLinn.)等植物的ICE1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列一致性較高(圖3)。

氨基酸組成及理化性質(zhì)分析結(jié)果(表1)顯示：芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子和其他植物ICE1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列的理論相對(duì)分子質(zhì)量在36 000～59 000之間，氨基酸殘基數(shù)在340～540之間，脂肪族氨基酸的比例明顯高于芳香族氨基酸的比例，芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子中酸性氨基酸的比例高于堿性氨基酸的比例，而其他植物ICE1轉(zhuǎn)錄因子中的堿性氨基酸的比例均高于酸性氨基酸的比例。

*： 終止密碼子Stop codon.

Ag： 芹菜品種‘津南實(shí)芹’Cultivar ‘Jinnan Shiqin’ of Apium graveolens Linn.； Gm： 大豆Glycine max (Linn.) Merr.； At： 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； Bn： 歐洲油菜Brassica napus Linn.； Sl： 番茄Solanum lycopersicum Linn.； Mp： 蘋(píng)果Malus pumila Mill.； Rs： 蘿卜Raphanus sativus Linn.； La： 獨(dú)行菜Lepidium apetalum Willd.； Bro： Brassica rapa subsp. oleifera (DC.) Metzg.

表1芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子和其他植物ICE1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸組成及理化性質(zhì)

Table1AminoacidcompositionandphysicochemicalpropertyofAgICE1transcriptionfactorfromcultivar‘JinnanShiqin’ofApiumgraveolensLinn.andICE1transcriptionfactorsfromotherspecies

種類(lèi)1)Species1)登錄號(hào)Accession No.氨基酸殘基數(shù)Number of amino acid residue理論相對(duì)分子質(zhì)量Theoretical relative molecular mass理論等電點(diǎn)Theoretical isoelectric point比例/% Percentage堿性氨基酸Basic amino acid酸性氨基酸Acidic amino acid脂肪族氨基酸Aliphatic amino acid芳香族氨基酸Aromatic amino acid總平均疏水性Grand average of hydrophobicityAgAgr22229484531 3615.0911.613.056.47.5-0.533GmNM_001254339.1531494 1475.4112.610.274.46.5-0.524AtAY195621.1404535 3895.5311.69.669.36.7-0.519BnJF268687.1499532 1415.0511.48.868.26.4-0.415SlJX625139.1531583 3715.3811.89.669.07.0-0.569MpEF495202.1531574 0015.5112.010.172.25.5-0.532RsHQ891287.1421457 9545.4112.812.173.36.9-0.444LaAGZ13680.1344368 3599.7213.27.380.07.3-0.032BroADZ24264.1497530 4945.1111.49.071.76.2-0.417

1)Ag： 芹菜品種‘津南實(shí)芹’Cultivar ‘Jinnan Shiqin’ ofApiumgraveolensLinn.； Gm： 大豆Glycinemax(Linn.) Merr.； At： 擬南芥Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.； Bn： 歐洲油菜BrassicanapusLinn.； Sl： 番茄SolanumlycopersicumLinn.； Mp： 蘋(píng)果MaluspumilaMill.； Rs： 蘿卜RaphanussativusLinn.； La： 獨(dú)行菜LepidiumapetalumWilld.； Bro：Brassicarapasubsp.oleifera(DC.) Metzg.

利用Blast Conserved Domains Search分析芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的保守域，結(jié)果(圖4)顯示：AgICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列在第300位至第346位氨基酸間含有bHLH保守域。

圖4 芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的保守域預(yù)測(cè)

2.3 芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化分析

根據(jù)芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子與其他植物的ICE1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

結(jié)果(圖5)顯示：傘形科的芹菜品種‘津南實(shí)芹’與薔薇科(Rosaceae)的蘋(píng)果的進(jìn)化關(guān)系最近。十字花科(Brassicaceae)的歐洲油菜、Brassicarapasubsp.oleifera(DC.) Metzg.、擬南芥和蘿卜聚為同一分支，茄科(Solanaceae)的番茄(SolanumlycopersicumLinn.)以及芹菜品種‘津南實(shí)芹’和蘋(píng)果聚為同一分支，但是豆科(Fabaceae)的大豆和十字花科的獨(dú)行菜(LepidiumapetalumWilld.)分別聚為單獨(dú)的分支。總體上看，ICE1轉(zhuǎn)錄因子在不同植物間呈現(xiàn)明顯的種屬特性，同科植物的親緣關(guān)系更近。

Ag： 芹菜品種‘津南實(shí)芹’Cultivar ‘Jinnan Shiqin’ of Apium graveolens Linn.； Gm： 大豆Glycine max (Linn.) Merr.； At： 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； Bn： 歐洲油菜Brassica napus Linn.； Sl： 番茄Solanum lycopersicum Linn.； Mp： 蘋(píng)果Malus pumila Mill.； Rs： 蘿卜Raphanus sativus Linn.； La： 獨(dú)行菜Lepidium apetalum Willd.； Bro： Brassica rapa subsp. oleifera (DC.) Metzg.

2.4 芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的親水性和疏水性分析

采用DNAMAN軟件對(duì)芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行親水性和疏水性分析，結(jié)果(圖6)表明：AgICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的親水性區(qū)域中，第300位至第312位氨基酸親水性最強(qiáng)；疏水性區(qū)域中，第441位至第447位氨基酸疏水性最強(qiáng)?？傮w上看，AgICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的親水性區(qū)域多于疏水性區(qū)域，為親水性蛋白。

圖6 芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的親水性(A)和疏水性(B)

2.5 芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1基因在不同組織和逆境處理下的表達(dá)特性分析

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果(圖7)表明：芹菜品種‘津南實(shí)芹’根、葉柄以及葉片中均能夠檢測(cè)到AgICE1基因的表達(dá)，但其在不同組織中相對(duì)表達(dá)水平的差異較大。AgICE1基因在葉片中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于根和葉柄中的相對(duì)表達(dá)水平，且根和葉柄間相對(duì)表達(dá)水平的差異不顯著。

高溫(38 ℃)、低溫(4 ℃)、干旱(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)20% PEG6000)和高鹽(0.2 mol·L-1NaCl)4種非生物脅迫處理下芹菜品種‘津南實(shí)芹’葉片中AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平見(jiàn)圖8。結(jié)果表明：不同非生物脅迫處理下芹菜品種‘津南實(shí)芹’葉片中AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平差異較大。

高溫處理1 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平較處理0 h略有降低；高溫處理2、4和8 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平較處理0 h有所升高，分別為處理0 h的2.48、4.67和2.61倍；高溫處理24 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平較處理0～8 h顯著升高，為處理0 h的9.45倍。

低溫處理1 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平較處理0 h升高，為處理0 h的1.66倍；低溫處理4 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平較處理0 h有所降低；低溫處理8 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平與處理0 h相比無(wú)明顯變化；低溫處理2和24 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平均顯著增加，分別為處理0 h的3.17和4.53倍。

不同的小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著Different lowercases indicate the significant difference at 0.05 level.

不同的小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著Different lowercases indicate the significant difference at 0.05 level.A： 高溫(38 ℃)High temperature (38 ℃)； B： 低溫(4 ℃)Low temperature (4 ℃)； C： 干旱(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)20% PEG6000)Drought (mass volume fraction of 20% PEG6000)； D： 高鹽(0.2 mol·L-1 NaCl)High salt (0.2 mol·L-1 NaCl).

干旱處理1 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平較處理0 h顯著升高，為處理0 h的4.29倍；干旱處理2和8 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平均較處理0 h有所升高，分別為處理0 h的1.24和2.02倍；干旱處理4 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平最高，為處理0 h的9.03倍；干旱處理24 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平較處理0 h略有降低。

高鹽處理1～24 h，AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平均較處理0 h有不同程度的升高，分別為處理0 h的3.30、1.55、2.30、2.54和2.95倍，其中，高鹽處理1 hAgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平最高。

3 討論和結(jié)論

低溫脅迫是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中常見(jiàn)的一種非生物脅迫，不僅會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致植株死亡[20]。芹菜作為重要的葉菜類(lèi)蔬菜作物，在其栽培過(guò)程中經(jīng)常受到因氣候變化及不良土壤環(huán)境引起的非生物脅迫，嚴(yán)重影響芹菜的正常生長(zhǎng)發(fā)育。本研究從芹菜品種‘津南實(shí)芹’中克隆獲得AgICE1基因。該基因的開(kāi)放閱讀框編碼484個(gè)氨基酸，其氨基酸序列的第300位至第346位氨基酸間包含bHLH保守域。與其他植物ICE1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果表明：ICE1轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化上具有保守性。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析可發(fā)現(xiàn)，ICE1轉(zhuǎn)錄因子在同科植物間的親緣關(guān)系更近。RT-qPCR結(jié)果顯示：芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1基因在根、葉柄和葉片中均可表達(dá)但是相對(duì)表達(dá)水平差異較大，其在葉片中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于根和葉柄，說(shuō)明該基因的表達(dá)存在明顯的組織特異性。高溫(38 ℃)、低溫(4 ℃)、干旱(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)20% PEG6000)和高鹽(0.2 mol·L-1NaCl)4種非生物脅迫處理下芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1基因的相對(duì)表達(dá)水平總體上有不同程度的升高，說(shuō)明AgICE1轉(zhuǎn)錄因子與非生物脅迫調(diào)控相關(guān)。

已有研究結(jié)果表明：植物中許多基因家族的轉(zhuǎn)錄因子與植物的抗逆性有關(guān)，這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)特異性識(shí)別并結(jié)合下游基因啟動(dòng)子中的順式作用元件來(lái)調(diào)控植物的抗逆應(yīng)答，如CBF/DREB是一類(lèi)可以調(diào)控多個(gè)與干旱、高鹽及低溫脅迫相關(guān)的功能基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物抵抗非生物脅迫中起重要作用[21-22]。ICE1轉(zhuǎn)錄因子可以與CBF3基因上游啟動(dòng)子結(jié)合從而激活CBF3基因的表達(dá)。黃瑩等[12]認(rèn)為，缺失ICE1基因的擬南芥會(huì)引起CBF3基因表達(dá)變化，使植物喪失抗寒能力；但在高溫條件下，擬南芥中CBF3基因未被激活，由此推測(cè)ICE1轉(zhuǎn)錄因子與CBF3基因上游啟動(dòng)子的結(jié)合存在低溫誘導(dǎo)型的修飾調(diào)控。也有研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過(guò)量表達(dá)CBF3基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥不僅抗寒性增強(qiáng)，而且對(duì)干旱和高鹽脅迫也具有一定的抗性[23]。目前對(duì)ICE轉(zhuǎn)錄因子激活CBF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族的研究多集中于其在抗低溫脅迫中的重要作用，而對(duì)其他非生物脅迫響應(yīng)的研究報(bào)道較少，因此，關(guān)于ICE1基因在非生物脅迫中具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究[24]。

高等植物抵抗非生物脅迫的生理生化過(guò)程非常復(fù)雜，有研究認(rèn)為，植物的耐受性與其體內(nèi)的抗氧化酶活性相關(guān)[25]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧毒害細(xì)胞，植物本身可以通過(guò)產(chǎn)生抗氧化酶來(lái)清除這些有害物質(zhì)，從而增強(qiáng)其抗逆能力[26-27]。已有的抗逆性相關(guān)研究結(jié)果[28]表明：植物在抵抗逆境過(guò)程中有著復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文研究了芹菜品種‘津南實(shí)芹’AgICE1基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)，對(duì)了解AgICE1基因在芹菜抗逆境脅迫中發(fā)揮的作用提供了參考，但對(duì)芹菜的抗逆性研究還需從分子及生理生化等方面進(jìn)行深入探討。