根瘤菌對(duì)Cu脅迫下白三葉生長(zhǎng)和Cu含量的影響

鄒萌萌， 周衛(wèi)紅，2， 張靜靜， 陶春柳， 劉曉青， 李建龍，①

(1. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京 210093； 2. 江蘇科技大學(xué)蘇州理工學(xué)院， 江蘇 張家港 215600；3. 蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 蘇州 215411； 4. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 江蘇 南京 210095)

Cu是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素，能夠影響植物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞氧化還原反應(yīng)，并調(diào)節(jié)植物體重要代謝過(guò)程；Cu還是葉綠體中質(zhì)體藍(lán)素的組成成分，參與光電子傳遞過(guò)程，利于葉綠素的合成和穩(wěn)定。然而，隨著中國(guó)工業(yè)化和城市化進(jìn)程的快速推進(jìn)，土壤Cu污染問(wèn)題日益突出。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，大量或長(zhǎng)期使用含Cu殺菌劑導(dǎo)致土壤Cu含量急劇升高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)植物生長(zhǎng)需要的土壤Cu含量的閾值，致使植物葉片光合作用受阻，不利于植株生長(zhǎng)[1-3]，因此，亟待修復(fù)Cu污染土壤。

植物修復(fù)技術(shù)是指利用重金屬超積累或耐受植物修復(fù)重金屬污染土壤，具有成本低廉、美化環(huán)境、提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和土壤肥力等優(yōu)點(diǎn)，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。但是，目前發(fā)現(xiàn)的耐受植物對(duì)土壤重金屬污染的耐受性均較低，而超富集植物又存在植株矮小、生長(zhǎng)緩慢和修復(fù)土壤周期長(zhǎng)等問(wèn)題，均難以滿足修復(fù)高污染土壤和快速修復(fù)污染土壤的需要[5-6]。牧草具有生長(zhǎng)快、生物量大、重金屬吸收量多且易于栽培管理等特點(diǎn)，近年來(lái)成為修復(fù)重金屬污染土壤的研究熱點(diǎn)[7]。白三葉(TrifoliumrepensLinn.)又名白車軸草，為普遍栽種的豆科(Fabaceae)多年生優(yōu)良牧草，對(duì)土壤Cu污染具有一定的耐受性和富集能力[8-9]。

根瘤菌是廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，常與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物的抗病性和抗逆性。根瘤菌與豆科植物形成的共生體系在重金屬污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用及潛力逐漸受到研究者的關(guān)注[10]。研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌Bradyrhizobiumsp. (vigna)能顯著提高綠豆〔Vignaradiata(Linn.) Wilczek〕的產(chǎn)量及N和P的吸收量[11]；接種根瘤菌SinorhizobiummelilotiCCNWSX0020使天藍(lán)苜蓿(MedicagolupulinaLinn.)的生物量和Cu含量分別增加了78.2%和39.3%[12]。

為了探究根瘤菌對(duì)Cu污染土壤中白三葉Cu耐受性的影響，作者采用盆栽法比較了Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組(接種滅菌的2.7×109CFU·mL-1RhizobiumtrifoliiACCC18017菌懸液)和接菌組(先后接種2.7×109和2.3×109CFU·mL-1R.trifoliiACCC18017菌懸液)白三葉的株高、根長(zhǎng)、地上部和地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、葉片葉綠素含量及地上部和地下部的Cu含量，以期明確根瘤菌對(duì)Cu污染土壤中白三葉生長(zhǎng)和Cu吸收的影響，為利用根瘤菌-白三葉共生體系修復(fù)Cu污染土壤提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)使用的白三葉種子購(gòu)自北京百綠集團(tuán)。挑選籽粒飽滿、大小均勻的種子，先用蒸餾水浸泡24 h，再用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇滅菌3～5 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次，備用。

實(shí)驗(yàn)使用的根瘤菌為三葉草根瘤菌R.trifoliiACCC18017，由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。實(shí)驗(yàn)前，對(duì)根瘤菌的耐Cu能力進(jìn)行檢測(cè)，該菌株在Cu濃度為0.6 mmol·L-1的酵母甘露醇(YMA)固體培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)使用的土壤取自南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院后山。取0～20 cm土層的土壤，過(guò)篩(孔徑0.8 mm)，室溫放置3～4 d，待土壤自然風(fēng)干后，將其與營(yíng)養(yǎng)土(購(gòu)自南京斑馬實(shí)驗(yàn)耗材有限公司)按照質(zhì)量比2∶1的比例混合均勻后作為栽培基質(zhì)。栽培基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)含量為32.70 g·kg-1，全氮含量為2.43 g·kg-1，堿解氮含量為74.26 mg·kg-1，速效磷含量為0.18 g·kg-1，速效鉀含量為0.18 g·kg-1，Cu含量為33.36 mg·kg-1，pH 7.15。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 使用YMA固體培養(yǎng)基先將三葉草根瘤菌R.trifoliiACCC18017活化，再將活化的根瘤菌接種至YMA液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃條件下150 r·min-1振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別獲得濃度為2.7×109和2.3×109CFU·mL-1的菌懸液。

1.2.2 盆栽實(shí)驗(yàn) 于2017年9月5日在南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院露天陽(yáng)臺(tái)進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。稱取適量CuSO4固體粉末，加水制成濃度分別為0.011 8、0.023 6和0.035 4 mol·L-1的CuSO4溶液；分別取上述CuSO4溶液各200 mL，逐層噴灑到栽培基質(zhì)中，并攪拌均勻，使栽培基質(zhì)中的Cu添加量分別為500、1 000和1 500 mg·kg-1，Cu添加量為0 mg·kg-1的栽培基質(zhì)噴灑200 mL蒸餾水。將各組栽培基質(zhì)分別裝入直徑16 cm、高20 cm的塑料花盆中，每盆裝入栽培基質(zhì)1.5 kg，室溫下靜置2周。將供試白三葉種子平均分成2組，一組置于2.7×109CFU·mL-1菌懸液中浸泡10 min，作為接菌組；另一組用滅菌的2.7×109

CFU·mL-1菌懸液浸泡10 min，作為對(duì)照組。將白三葉種子均勻撒播在栽培基質(zhì)中，覆土厚度0.5～1.0 cm，每組播種6盆，每盆30粒種子，各3個(gè)重復(fù)。待幼苗高2～3 cm時(shí)，對(duì)接菌組幼苗進(jìn)行2次接菌，用注射器沿植株根部注入2.3×109CFU·mL-1菌懸液，每盆注入8 mL。待幼苗高10 cm時(shí)間苗，每盆保留長(zhǎng)勢(shì)良好的幼苗15株。實(shí)驗(yàn)期間定期澆水，保持栽培基質(zhì)的含水量為田間最大持水量的60%～70%。用托盤收集滲出的水，將滲出的水重新澆入花盆中。

1.2.3 根瘤菌-白三葉共生體系檢測(cè) 為了確保接菌組白三葉植株根部接種上根瘤菌，培養(yǎng)結(jié)束后，每盆選取1株白三葉植株，采集植株根部根瘤，先用無(wú)菌水沖洗干凈，再用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡30 s，接著用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%AgCl2溶液殺菌5 min，最后用無(wú)菌水沖洗6次。將滅菌的根瘤置于2片無(wú)菌載玻片之間，用力擠壓使根瘤破碎，用接種環(huán)沾取適量汁液，在YMA固體培養(yǎng)基上劃線，置于28 ℃條件下培養(yǎng)2 d；待長(zhǎng)出菌落后，將培養(yǎng)基上的菌落與R.trifoliiACCC18017進(jìn)行形態(tài)學(xué)對(duì)比。此外，對(duì)接菌組白三葉根部的根瘤菌進(jìn)行耐Cu能力檢測(cè)，比較該根瘤菌的耐Cu能力與R.trifoliiACCC18017的耐Cu能力是否相同。若培養(yǎng)菌落的形態(tài)特征和耐Cu能力與R.trifoliiACCC18017均相同，則認(rèn)為培養(yǎng)出的菌株為R.trifoliiACCC18017。

1.2.4 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 種植12周后，每盆隨機(jī)選取6株白三葉植株，使用直尺(精度1 mm)測(cè)量植株的株高，結(jié)果取平均值；挖出完整植株，盡量避免破壞根瘤，先用自來(lái)水輕輕沖洗，洗凈根瘤和根部表面的泥土和雜質(zhì)，再用去離子水浸泡30 min，使用直尺測(cè)量植株的主根長(zhǎng)度，結(jié)果取平均值。

將每盆的所有植株挖出，自來(lái)水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，將植株分成地上部和地下部2個(gè)部分，使用電子天平(精度0.01 g)分別稱量每盆所有植株地上部和地下部的總質(zhì)量，即地上部和地下部的鮮質(zhì)量；分別將每盆所有植株地上部和地下部裝入信封中，先在105 ℃條件下殺青30 min，再在75 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，分別稱量每盆所有植株地上部和地下部的總質(zhì)量，即地上部和地下部的干質(zhì)量。

1.2.5 葉片葉綠素含量測(cè)定 隨機(jī)選取白三葉成熟葉片，每盆約0.1 g，準(zhǔn)確稱量后剪碎，放入具塞玻璃試管中；加入10 mL丙酮-乙醇混合液，黑暗條件下提取14 h；用756MC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華儀器科技有限公司)測(cè)定提取液在波長(zhǎng)645和663 nm下的OD值。參照文獻(xiàn)[13]，根據(jù)公式“葉綠素a含量=(12.70OD663-2.69OD645)·(V/1 000m)”、“葉綠素b含量=(22.99OD645-4.68OD663)·(V/1 000m)”和“總?cè)~綠素含量=(20.20OD645+8.02OD663)·(V/1 000m)”分別計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。式中，OD645和OD663分別為提取液在波長(zhǎng)645和663 nm下的OD值，V為提取液體積，m為葉片鮮質(zhì)量。并且，計(jì)算葉綠素a含量與葉綠素b含量的比值。

1.2.6 Cu含量測(cè)定 將烘干的地上部和地下部樣品粉碎，分別取0.2 g樣品，放入聚四氟乙烯消解罐中；依次加入5 mL濃HNO3和2 mL H2O2，微波(功率1 600 W)消解20 min；待溶液澄清后，定容至50 mL；過(guò)濾，使用ICAP6300電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)測(cè)定地上部和地下部的Cu含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用EXCEL 2010軟件計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行LSD單因素方差分析，采用Origin Pro 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 根瘤菌對(duì)Cu脅迫下白三葉生長(zhǎng)的影響

2.1.1 對(duì)株高和根長(zhǎng)的影響 根瘤菌對(duì)Cu脅迫下白三葉株高和主根長(zhǎng)的影響見(jiàn)表1。由表1可以看出：Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組(先后接種2.7×109和2.3×109CFU·mL-1R.trifoliiACCC18017菌懸液)白三葉的株高均高于對(duì)照組(接種滅菌的2.7×109CFU·mL-1R.trifoliiACCC18017菌懸液)，分別較對(duì)照組增加了19.5%、12.6%、27.7%和14.1%；其中，Cu添加量為0和1 000 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的株高顯著(P<0.05)高于對(duì)照組。Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的株高顯著高于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤；Cu添加量為500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組白三葉的株高隨著Cu添加量提高而顯著降低，而Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的株高顯著高于Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1的土壤，但Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的株高差異不顯著。

由表1還可以看出：Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的主根長(zhǎng)均大于對(duì)照組，分別較對(duì)照組增加了2.0%、7.3%、9.7%和12.4%，但不同Cu添加量土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的主根長(zhǎng)差異均不顯著。Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的主根長(zhǎng)均最長(zhǎng)，Cu添加量為500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的主根長(zhǎng)均隨著Cu添加量提高而降低，且不同Cu添加量土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的主根長(zhǎng)差異均不顯著。

土壤Cu添加量/(mg·kg-1)Cu addition in soil株高/cm Height主根長(zhǎng)/cm Main root lengthCKTCKT08.95±0.50Bb10.66±0.73Ab17.03±1.78Aa17.33±2.43Aa50012.04±1.07Aa13.56±1.07Aa19.61±0.40Aa21.03±2.50Aa1 0009.03±0.65Bb11.53±0.63Ab17.22±1.57Aa18.89±1.05Aa1 5006.95±0.41Ac10.22±0.79Ab14.73±1.40Aa16.57±0.41Aa

1)CK： 對(duì)照組(接種滅菌的2.7×109CFU·mL-1RhizobiumtrifoliiACCC18017菌懸液) The control group (inoculated with sterilized 2.7×109CFU·mL-1RhizobiumtrifoliiACCC18017 suspension)； T： 接菌組(先后接種2.7×109和2.3×109CFU·mL-1R.trifoliiACCC18017菌懸液) Inoculation group (successively inoculated with 2.7×109and 2.3×109CFU·mL-1R.trifoliiACCC18017 suspensions). 同行中不同大寫字母表示同一指標(biāo)在對(duì)照組和接菌組間差異顯著(P<0.05) Different capitals in the same row indicate the significant (P<0.05)difference in the same index between the control group and inoculation group； 同列中不同小寫字母表示同一指標(biāo)在不同Cu添加量土壤間差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference in the same index among soils with different Cu additions.

2.1.2 對(duì)鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響 根瘤菌對(duì)Cu脅迫下白三葉地上部和地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響見(jiàn)圖1。由圖1可以看出：Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地上部鮮質(zhì)量均高于對(duì)照組，分別較對(duì)照組增加了28.8%、32.1%、29.0%和7.2%；其中，Cu添加量為0、500和1 000 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地上部鮮質(zhì)量顯著高于對(duì)照組。Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地上部鮮質(zhì)量顯著高于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤；Cu添加量為500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地上部鮮質(zhì)量隨著Cu添加量提高而降低，其中，Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地上部鮮質(zhì)量顯著高于Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1的土壤，Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組白三葉的地上部鮮質(zhì)量則低于或顯著低于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤，而Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地上部鮮質(zhì)量顯著低于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤。

： 對(duì)照組(接種滅菌的2.7×109 CFU·mL-1 Rhizobium trifolii ACCC18017菌懸液) The control group (inoculated with sterilized 2.7×109 CFU·mL-1 Rhizobium trifolii ACCC18017 suspension)； ： 接菌組(先后接種2.7×109和2.3×109 CFU·mL-1 R. trifolii ACCC18017菌懸液) Inoculation group (successively inoculated with 2.7×109 and 2.3×109 CFU·mL-1 R. trifolii ACCC18017 suspensions). 不同大寫字母表示同一指標(biāo)在對(duì)照組和接菌組間差異顯著(P<0.05) Different capitals indicate the significant (P<0.05) difference in the same index between the control group and inoculation group； 不同小寫字母表示同一指標(biāo)在不同Cu添加量土壤間差異顯著(P<0.05) Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference in the same index among soils with different Cu additions.

由圖1還可以看出：Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地下部鮮質(zhì)量均高于對(duì)照組，分別較對(duì)照組增加了37.8%、29.8%、43.5%和22.8%；其中，Cu添加量為0、500和1 000 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地下部鮮質(zhì)量顯著高于對(duì)照組。Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地下部鮮質(zhì)量顯著高于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤；Cu添加量為500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地下部鮮質(zhì)量隨著Cu添加量提高而降低，其中，Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地下部鮮質(zhì)量顯著高于Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1的土壤，Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組白三葉的地下部鮮質(zhì)量顯著低于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤，而Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地下部鮮質(zhì)量則低于或顯著低于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤。

由圖1還可以看出：Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地上部干質(zhì)量均高于對(duì)照組，分別較對(duì)照組增加了91.3%、81.8%、52.1%和24.1%；其中，Cu添加量為0、500和1 000 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地上部干質(zhì)量顯著高于對(duì)照組。Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地上部干質(zhì)量顯著高于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤；Cu添加量為500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地上部干質(zhì)量隨著Cu添加量提高而降低，其中，Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地上部干質(zhì)量顯著高于Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1的土壤，而Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組的白三葉地上部干質(zhì)量與Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤差異不顯著。

由圖1還可以看出：Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地下部干質(zhì)量均高于對(duì)照組，分別較對(duì)照組增加了29.0%、44.4%、6.3%和8.3%；其中，Cu添加量為0和500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地下部干質(zhì)量顯著高于對(duì)照組。Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地下部干質(zhì)量高于或顯著高于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤；Cu添加量為500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地下部干質(zhì)量隨著Cu添加量提高而降低，而Cu添加量為1 000 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉的地下部干質(zhì)量與Cu添加量為1 500 mg·kg-1的土壤差異不顯著。

2.1.3 對(duì)葉片葉綠素含量的影響 根瘤菌對(duì)Cu脅迫下白三葉葉片葉綠素含量的影響見(jiàn)表2。由表2可以看出：Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉葉片的葉綠素a含量均高于對(duì)照組，分別較對(duì)照組增加了33.0%、12.7%、4.3%和27.4%，但無(wú)顯著差異。Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉葉片的葉綠素a含量最高，Cu添加量為500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉葉片的葉綠素a含量基本上隨著Cu添加量提高而降低，并且，對(duì)照組和接菌組白三葉葉片的葉綠素a含量在不同Cu添加量土壤中無(wú)顯著差異。

由表2還可以看出：Cu添加量為0 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉葉片的葉綠素b含量相同；Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉葉片的葉綠素b含量低于對(duì)照組；而Cu添加量為1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉葉片的葉綠素b含量均高于對(duì)照組，分別較對(duì)照組增加了39.3%和16.7%。對(duì)照組和接菌組白三葉葉片的葉綠素b含量隨Cu添加量提高而波動(dòng)。不同Cu添加量土壤中及對(duì)照組和接菌組間白三葉葉片的葉綠素b含量差異均不顯著。

由表2還可以看出：Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組和接菌組白三葉葉片的總?cè)~綠素含量和葉綠素a含量與葉綠素b含量的比值(Chla/Chlb)的變化趨勢(shì)與葉綠素a含量變化基本一致，并且，不同Cu添加量土壤中及對(duì)照組和接菌組白三葉葉片的總?cè)~綠素含量和Chla/Chlb值差異均不顯著。

土壤Cu添加量/(mg·kg-1)Cu addition in soil葉綠素a含量/(mg·kg-1) Content of chlorophyll a葉綠素b含量/(mg·kg-1) Content of chlorophyll bCKTCKT01.09±0.08Aa1.45±0.10Aa0.27±0.02Aa0.27±0.05Aa5001.42±0.12Aa1.60±0.09Aa0.41±0.05Aa0.38±0.03Aa1 0001.38±0.12Aa1.44±0.12Aa0.28±0.04Aa0.39±0.04Aa1 5001.13±0.08Aa1.44±0.11Aa0.30±0.04Aa0.35±0.02Aa土壤Cu添加量/(mg·kg-1)Cu addition in soil總?cè)~綠素含量/(mg·kg-1) Content of total chlorophyllChla/ChlbCKTCKT01.37±0.10Aa1.73±0.05Aa3.68±0.20Aa3.97±0.12Aa5001.67±0.11Aa1.98±0.09Aa4.02±0.33Aa4.26±0.35Aa1 0001.67±0.09Aa1.83±0.12Aa3.86±0.24Aa4.18±0.70Aa1 5001.43±0.12Aa1.79±0.10Aa3.49±0.12Aa3.75±0.37Aa

1)CK： 對(duì)照組(接種滅菌的2.7×109CFU·mL-1RhizobiumtrifoliiACCC18017菌懸液) The control group (inoculated with sterilized 2.7×109CFU·mL-1RhizobiumtrifoliiACCC18017 suspension)； T： 接菌組(先后接種2.7×109和2.3×109CFU·mL-1R.trifoliiACCC18017菌懸液) Inoculation group (successively inoculated with 2.7×109and 2.3×109CFU·mL-1R.trifoliiACCC18017 suspensions)； Chla/Chlb： 葉綠素a含量與葉綠素b含量的比值 Ratio of content of chlorophyllato content of chlorophyllb. 同行中不同大寫字母表示同一指標(biāo)在對(duì)照組和接菌組間差異顯著(P<0.05) Different capitals in the same row indicate the significant (P<0.05) difference in the same index between the control group and inoculation group； 同列中不同小寫字母表示同一指標(biāo)在不同Cu添加量土壤間差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference in the same index among soils with different Cu additions.

2.2 根瘤菌對(duì)Cu脅迫下白三葉Cu含量的影響

根瘤菌對(duì)Cu脅迫下白三葉地上部和地下部Cu含量的影響見(jiàn)圖2。由圖2可以看出：Cu添加量為0、500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組(先后接種2.7×109和2.3×109CFU·mL-1R.trifoliiACCC18017菌懸液)白三葉的地上部Cu含量均高于對(duì)照組(接種滅菌的2.7×109CFU·mL-1R.trifoliiACCC18017菌懸液)，分別較對(duì)照組增加了19.9%、34.5%、40.1%和7.0%；其中，Cu添加量為500和1 000 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地上部Cu含量顯著(P<0.05)高于對(duì)照組。對(duì)照組白三葉的地上部Cu含量隨著Cu添加量提高而顯著升高；接菌組白三葉的地上部Cu含量在Cu添加量為0～1 000 mg·kg-1土壤中隨著Cu添加量提高而顯著升高，在Cu添加量為1 000 mg·kg-1土壤中達(dá)到最大值，但在Cu添加量為1 500 mg·kg-1土壤中顯著降低。

由圖2還可以看出：Cu添加量為500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地下部Cu含量均高于對(duì)照組，分別較對(duì)照組增加了55.4%、36.4%和8.5%；其中，Cu添加量為500和1 000 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地下部Cu含量顯著高于對(duì)照組。對(duì)照組和接菌組白三葉的地下部Cu含量基本上隨著Cu添加量提高而升高；Cu添加量為1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組白三葉的地下部Cu含量顯著高于其他Cu添加量土壤，而接菌組白三葉的地下部Cu含量顯著高于Cu添加量為0和500 mg·kg-1的土壤，但不顯著高于Cu添加量為1 000 mg·kg-1的土壤。

： 對(duì)照組(接種滅菌的2.7×109 CFU·mL-1 Rhizobium trifolii ACCC18017菌懸液) The control group (inoculated with sterilized 2.7×109 CFU·mL-1 Rhizobium trifolii ACCC18017 suspension)； ： 接菌組(先后接種2.7×109和2.3×109 CFU·mL-1 R. trifolii ACCC18017菌懸液) Inoculation group (successively inoculated with 2.7×109 and 2.3×109 CFU·mL-1 R. trifolii ACCC18017 suspensions). 不同大寫字母表示同一指標(biāo)在對(duì)照組和接菌組間差異顯著(P<0.05) Different capitals indicate the significant (P<0.05) difference in the same index between the control group and inoculation group； 不同小寫字母表示同一指標(biāo)在不同Cu添加量土壤間差異顯著(P<0.05) Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference in the same index among soils with different Cu additions.

3 討論和結(jié)論

本研究結(jié)果顯示：Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組白三葉的株高、地上部和地下部的鮮質(zhì)量及地上部干質(zhì)量均顯著(P<0.05)高于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤，其主根長(zhǎng)和地下部干質(zhì)量也高于Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤；Cu添加量為1 000 mg·kg-1土壤中不接菌白三葉的株高、地上部鮮質(zhì)量及地上部和地下部干質(zhì)量與Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤無(wú)顯著差異。另外，Cu添加量為500、1 000和1 500 mg·kg-1土壤中對(duì)照組白三葉的主根長(zhǎng)，葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量及Chla/Chlb值與Cu添加量為0 mg·kg-1的土壤無(wú)顯著差異；對(duì)照組白三葉的地上部和地下部Cu含量均隨著Cu添加量提高而顯著升高。說(shuō)明白三葉對(duì)Cu脅迫具有較好的耐受性，能夠適應(yīng)一定程度的Cu污染土壤環(huán)境，因此，可將白三葉作為修復(fù)Cu污染土壤的備選植物。

相關(guān)研究結(jié)果[14-16]表明：適量的Cu能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，但當(dāng)植物體內(nèi)Cu含量過(guò)高時(shí)，Cu2+將替代葉綠素中心的Mg2+，破壞植物的光合作用，干擾植物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)平衡，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。本研究中， Cu添加量為500 mg·kg-1Cu土壤中對(duì)照組白三葉的株高、主根長(zhǎng)、地上部和地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量以及葉片葉綠素含量(包括葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量及Chla/Chlb值)均最高，說(shuō)明在該Cu脅迫條件下白三葉生長(zhǎng)良好，很可能是Cu對(duì)白三葉生長(zhǎng)起到了一定的促進(jìn)作用，具體作用機(jī)制有待深入研究。

根瘤菌能夠通過(guò)多種方式促進(jìn)植物生長(zhǎng)，包括通過(guò)固氮作用提供植物生長(zhǎng)所需的N、促進(jìn)植物對(duì)P及其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[9]、分泌植物激素(如IAA)和特異性酶及改變土壤理化性質(zhì)等[17-18]。本研究中，不同Cu添加量土壤中接菌組白三葉的株高、主根長(zhǎng)、地上部和地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均高于對(duì)照組，尤其是Cu添加量為0、500和1 000 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的株高及地上部和地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量基本上顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明根瘤菌R.trifoliiACCC18017能夠促進(jìn)白三葉生長(zhǎng)。

植物中的重金屬含量是評(píng)價(jià)植物修復(fù)重金屬污染土壤能力及其對(duì)重金屬脅迫耐受性的重要指標(biāo)。本研究中，Cu添加量為500和1 000 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉的地上部和地下部Cu含量較對(duì)照組顯著升高，說(shuō)明根瘤菌R.trifoliiACCC18017能夠促進(jìn)Cu添加量為500和1 000 mg·kg-1土壤中白三葉對(duì)Cu的吸收。韋革宏等[19]認(rèn)為，根瘤菌不但能通過(guò)促進(jìn)共生植物生長(zhǎng)、提高共生植物生物量的方式增強(qiáng)植物對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)，還能通過(guò)分泌有機(jī)酸和酶等改變土壤中重金屬元素的生物有效性，促進(jìn)植物對(duì)重金屬元素的吸收和累積。植物對(duì)土壤中重金屬元素的去除率主要取決于體內(nèi)重金屬元素的總量，即植株干質(zhì)量與重金屬含量的乘積[20]?？傮w來(lái)看，Cu添加量為500和1 000 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉地上部和地下部的干質(zhì)量及Cu含量顯著高于對(duì)照組，并且Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉地上部和地下部的干質(zhì)量顯著高于Cu添加量為1 000 mg·kg-1的土壤，而Cu添加量為500 mg·kg-1土壤中接菌組白三葉地上部和地下部的Cu含量顯著低于Cu添加量為1 000 mg·kg-1的土壤，說(shuō)明根瘤菌R.trifoliiACCC18017利于白三葉修復(fù)一定程度的Cu污染土壤。

通常情況下，重金屬元素對(duì)植物的毒害作用主要表現(xiàn)為植物體內(nèi)的活性氧和膜脂過(guò)氧化物等理化指標(biāo)的變化[21-22]，而本研究?jī)H對(duì)Cu脅迫下白三葉的株高、主根長(zhǎng)、地上部和地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、葉片葉綠素含量及地上部和地下部的Cu含量進(jìn)行了研究，并未研究Cu脅迫對(duì)白三葉抗氧化系統(tǒng)的影響，因此，本研究結(jié)果并不能全面反映白三葉對(duì)Cu脅迫的響應(yīng)，有待后續(xù)深入研究。此外，本研究土壤中Cu添加量的最大值為1 500 mg·kg-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GB 15618—2018 《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》中農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)Cu篩選值的最大值(200 mg·kg-1)，因此，本研究模擬的Cu污染土壤與實(shí)際Cu污染土壤差異明顯，研究結(jié)果在實(shí)際Cu污染土壤修復(fù)中具有局限性。

綜上所述，接種根瘤菌R.trifoliiACCC18017能夠促進(jìn)白三葉生長(zhǎng)及其對(duì)土壤中Cu的吸收，利于白三葉修復(fù)一定程度的Cu污染土壤。