白三葉基因工程及逆境生理研究進(jìn)展

李金博,李詩剛,徐義炎,吳燕民

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京100081； 2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020； 3.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，深圳 518040)

白三葉(Trifoliumrepens)，又稱為白車軸草、白花苜蓿、荷蘭翹搖，是豆科(Leguminosae)三葉草屬的多年生匍匐型草本植物。按葉型分為大葉、中葉和小葉3種類型[1]。原產(chǎn)歐洲和小亞細(xì)亞，16世紀(jì)在荷蘭栽培種植，17世紀(jì)后傳入英國，隨后傳入新西蘭、美國等[2]。目前白三葉在世界上分布很廣，除南極洲外，各大洲均有分布。其中，在新西蘭、澳大利亞、丹麥、美國、荷蘭、俄羅斯等國栽培面積較大。而新西蘭、丹麥、美國3個(gè)國家也供應(yīng)了世界上55%以上的白三葉種子[3]。白三葉在我國大體分布于22°-51° N，80°-130° E地區(qū)，主要在四川、云南、貴州等省。在浙江、江蘇、湖南、湖北、廣西、福建、河北以及新疆、遼寧、吉林等省均有野生種，貴州除羅甸、榕江、銅仁、赤水等17個(gè)“高溫縣”未發(fā)現(xiàn)白三葉外，其它66個(gè)縣(市)均有野生種[4]。近年來，筆者在廣東、甘肅、河南也發(fā)現(xiàn)有白三葉的大面積分布。白三葉具有莖葉豐富、草質(zhì)細(xì)軟、營養(yǎng)價(jià)值高、適口性好、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，是優(yōu)良的豆科牧草。同時(shí)，由于白三葉具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、耐踐踏、恢復(fù)快、侵占性強(qiáng)、顏色碧綠均勻、花葉俱美、綠期長的優(yōu)良特性，使其成為城市綠化、美化山川的優(yōu)良草種，也是綴花草坪、庭院草坪、街道草坪、廠區(qū)草坪較為理想的觀花觀葉冷季型草坪草[5-6]。隨著我國城市綠化和生態(tài)修復(fù)的發(fā)展，白三葉在園林綠化上應(yīng)用越來越多，建坪面積曾一度占到了我國北方景觀草坪面積的15%左右[7-8]。白三葉的廣泛應(yīng)用也推動(dòng)了對(duì)其越來越深入的研究。

目前，全世界栽培的白三葉品種有300個(gè)以上[9]，選育品種最多的國家為丹麥、新西蘭、澳大利亞和荷蘭。國外從20世紀(jì)20年代初就開始進(jìn)行白三葉育種的研究，荷蘭首先育出白三葉品種Dutch。進(jìn)入40年代后，荷蘭、美國等先后育出Tammninges、Kenland等數(shù)10個(gè)白三葉和紅三葉草品種。新西蘭最早種植的草地胡依阿(Grasslands Huia)一度占據(jù)全世界白三葉種子市場的35%～40%[2]。目前,澳大利亞的海法(Haifa)、美國的拉迪(丁)諾(Ladino)、丹麥的郎代科(Klondike)等品種也逐漸開始在市場上占據(jù)較大份額。

我國對(duì)白三葉育種工作研究較少，主要集中在引種和適應(yīng)性栽培、品種比較方面。自1993年以來，為了篩選適于四川地區(qū)的白三葉品種材料，育種家們成功從美國白三葉品種拉丁諾中選育出川引拉丁諾，可以在海拔200～3 500 m栽培，并從不同白三葉品種間初步篩選出適于四川建坪用的草種，發(fā)掘出了具有四葉或五葉的變異復(fù)葉型的優(yōu)良新材料寶興白三葉以及葉面具有美麗斑紋的白三葉材料[10-11]。而夏先玖[12]對(duì)百綠集團(tuán)的4個(gè)白三葉品種進(jìn)行試驗(yàn)觀察，認(rèn)為Sustain和C6151白三葉再生好、產(chǎn)量高，越夏率超過80%，在四川盆地值得推廣。云貴地區(qū)是我國重要的白三葉種植區(qū)，種植面積大，分布范圍廣，引種時(shí)間長，云南分布較廣的國外引進(jìn)的“拉丁諾”、“草地休衣”、“海法”3個(gè)品種中，海法抗旱、抗熱、耐瘠薄能力強(qiáng)，適應(yīng)云南大部分地區(qū)，草地休衣適合在南溫帶地區(qū)栽培，拉丁諾在降雨較多地區(qū)宜做刈割草地品種[13-14]。2013年何靜等[15]引種了62份俄羅斯白三葉在貴州南部進(jìn)行適應(yīng)性觀察和篩選評(píng)價(jià)，選出兩種產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)，適合在貴州南部種植利用的白三葉，并選出3種抗旱性好、植株侵占性強(qiáng)、可作為草坪型品種推廣的白三葉材料。長江中下游地區(qū)也是白三葉重要生長地區(qū)，研究者歷時(shí)十年從美國瑞加和路易斯安那白三葉品種中選育出抗旱耐熱性較好的白三葉品種鄂牧一號(hào)[16]，并于2009年從俄羅斯的6個(gè)野生白三葉材料中篩選出2、5、6號(hào)適合在長江中下游推廣應(yīng)用的白三葉品種[17]，為下一步選育優(yōu)良品種奠定了基礎(chǔ)。我國白三葉品種較少，選育還處在起步階段，與國外相比還有相當(dāng)大的差距。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，白三葉在轉(zhuǎn)基因、逆境生理及遺傳多樣性等方面的研究也得到了極大的發(fā)展，為其應(yīng)用和發(fā)展提供了新的材料及研究方向。

1 白三葉再生體系的建立

1.1經(jīng)過愈傷組織階段再生途徑 白三葉的離體胚、根、葉柄、下胚軸等多種外植體在組織培養(yǎng)條件下都可經(jīng)過愈傷組織階段。自1980年Gresshoff[19]懸浮培養(yǎng)白三葉成熟胚，利用原生質(zhì)體誘導(dǎo)愈傷組織形成完整植株以來，白三葉莖尖和白三葉葉片外植體成為了研究人員的試驗(yàn)方向，并成功形成愈傷組織，得到完整植株[20-21]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，基因型及外植體類型不同，其形成愈傷組織及完整植株的能力顯著不同[22]。1982年Bhojwani等[23]以白三葉葉肉原生質(zhì)體為外植體得到了愈傷組織及植株。其后，研究者以白三葉幼苗切段、莖尖、莖段等外植體也都分別獲得了愈傷組織及完整植株[24-26]。而1989年Yamada[27]選擇出一種能高度再生原生質(zhì)體的白三葉基因型。

我國開展白三葉研究較晚。自1992年，安利佳和李鳳霞[28]研究了白三葉的愈傷組織的誘導(dǎo)和植株的再生的方法和技術(shù)以來，研究人員分別利用白三葉葉片和未成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，并獲得胚性細(xì)胞懸浮系[29-31]。

1.2外植體直接再生途徑 外植體在NAA和BAP的培養(yǎng)基上都很容易培養(yǎng)生長，并且其再生性能在多種基因型白三葉上得到驗(yàn)證，同時(shí)外植體直接再生8～9周即可定植，相比愈傷組織培養(yǎng)6～9個(gè)月極大縮短了培養(yǎng)時(shí)間，并避免了體細(xì)胞克隆異常的問題。研究人員認(rèn)為，子葉葉柄部是較好的快速再生的外植體來源，萌發(fā)3 d的子葉直接再生出植株，轉(zhuǎn)化率為1%。而用吸漲種子的子葉器官再生生出植株，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到50%[32-33]。

我國在20世紀(jì)90年代后開始相關(guān)方面的研究。白三葉莖尖細(xì)胞分化能力最強(qiáng)，子葉分化能力較低，胚軸下部幾乎不分化[34-35]。周建明從白三葉成熟胚上成功誘導(dǎo)白三葉不定芽的生長后，又成功利用白三葉子葉培養(yǎng)出再生植株[36]，為后來研究者的工作奠定了基礎(chǔ)。

2 白三葉轉(zhuǎn)基因研究

自從1987年White和Grenwood[37]首次用含有雙元載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化白三葉品種WR8匍匐莖并成功獲得轉(zhuǎn)化體以來，白三葉轉(zhuǎn)基因研究得到迅速發(fā)展，目前主要集中在抗病蟲[38-47]、抗逆[48-57]、磷的吸收利用[58-61]、品質(zhì)改良[62-69]等方面(表1)。

2.1抗病蟲 白三葉生長過程中容易受到苜蓿花葉病毒(AMV)、白三葉花葉病毒(WCMV)、三葉草黃脈病毒(CYVV)等病毒病的危害，并在生產(chǎn)上造成極大的損失[39]。針對(duì)WCMV病毒編碼一個(gè)復(fù)制酶、三個(gè)肌動(dòng)蛋白和一個(gè)外殼蛋白的結(jié)構(gòu)，科研工作者開發(fā)出相應(yīng)的免疫病毒轉(zhuǎn)基因序列[40]。研究發(fā)現(xiàn)，WCMV外殼蛋白(WCMV-CP)的積累可以降低病毒的擴(kuò)展速度，推遲病毒的發(fā)生[41-42]。近些年來，Ludlow等[43-44]利用來源于復(fù)制酶的RNAi處理白三葉獲得了高效表達(dá)抗病性的轉(zhuǎn)基因植株。而AMV的防治也取得了一定進(jìn)展，AMV病毒編碼MP和CP復(fù)制酶，但僅有AMV-CP才有表達(dá)效果。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源AMV-CP轉(zhuǎn)入白三葉子葉中，得到具有抗卡拉霉素轉(zhuǎn)基因再生植株，經(jīng)過檢測證明外源目的基因已經(jīng)整合到白三葉基因組中并得到了表達(dá)，并具有較好的抗性表現(xiàn)[45-46]。

鱗翅類昆蟲對(duì)白三葉的生長會(huì)造成嚴(yán)重危害。目前，一系列蛋白酶抑制劑(PIs)、凝集素、淀粉酶抑制劑、內(nèi)霉素等抗蟲基因得到了廣泛的應(yīng)用。Voisey等[47]將BtCryBa和PIs基因轉(zhuǎn)入白三葉，研究發(fā)現(xiàn)BPT1表達(dá)水平較低，能夠減緩幼蟲的生長，CryBa得到中等水平的表達(dá)，抑制了幼蟲的進(jìn)食并可縮短其壽命。

表1 白三葉轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展Table 1 Transgenic research of white clover

2.2抗逆 培育具有滲透脅迫抗性、耐鋁性強(qiáng)的白三葉是育種的重要目標(biāo)。白三葉可以通過根尖有機(jī)酸的合成來抑制其對(duì)鋁離子的吸收，增強(qiáng)對(duì)鋁毒害的抗性。白三葉有機(jī)酸合成關(guān)鍵酶主要有檸檬酸酶(CS)、蘋果酸酶(neMDH)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PC)[48]等。將細(xì)菌的檸檬酸合成酶基因轉(zhuǎn)入白三葉后，能夠促使白三葉根部分泌更多的檸檬酸，抑制白三葉根尖對(duì)鋁離子的吸收，提高白三葉的耐鋁性，顯著提高其對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)性，在較高濃度的鋁離子濃度條件下轉(zhuǎn)基因植株仍然正常生長[49]。通過轉(zhuǎn)基因研究控制有機(jī)酸合成酶關(guān)鍵基因CaMV35S啟動(dòng)子、TrPT1的作用，發(fā)現(xiàn)根的生長和葉片生物量在鋁脅迫下比對(duì)照明顯加快或增多[50-52]，進(jìn)一步說明白三葉有機(jī)酸可以有效增強(qiáng)其抗鋁能力。

植物抗旱耐鹽堿研究已取得了長足的進(jìn)步，科技人員克隆出一系列相關(guān)基因，并獲得了大量的抗旱耐鹽植物，而白三葉相對(duì)發(fā)展較晚，取得成果較少。轉(zhuǎn)錄因子WXP1和P5CS基因均能較好地提高植物抗旱性，研究人員將這兩個(gè)基因成功導(dǎo)入白三葉中，經(jīng)過對(duì)比，轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照抗旱生理指標(biāo)均有一定程度的提高[53-54]。為了提高白三葉的耐鹽性，在克隆研究了各種具有一定耐鹽效果的基因后，陳傳芳等[55]、趙志文等[56]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將山菠菜(Prunellaasiatica)甜菜堿醛脫氫酶(BADH)、反義磷脂酶基因PLDγ轉(zhuǎn)入白三葉受體，分子檢測說明已經(jīng)成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，并證明了轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜在鹽脅迫下受到了保護(hù)，具有一定的耐鹽性。而從擬南芥(Arabidopsisthaliana)液泡膜的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1轉(zhuǎn)入白三葉胡依阿，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的耐受性顯著提高，植株總?cè)~面積和地上部分干質(zhì)量更是顯著大于對(duì)照[57]。

2.3土壤中磷的利用 磷素在土壤中易被吸附固定，導(dǎo)致植物吸收利用磷元素的能力急劇下降。研究發(fā)現(xiàn)，在磷缺乏條件下，植物分泌的植酸酶顯著增加，研究人員將植酸酶的表達(dá)作為轉(zhuǎn)基因育種的一個(gè)重要目標(biāo)[58]。Ma等[59]利用農(nóng)桿菌接種將植酸酶基因MtPHY1和酸性磷酸酶基因轉(zhuǎn)入白三葉，比對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株生物量顯著增加，磷含量也有大幅度提高。為了獲得具有較高磷吸收效率的白三葉植株，韓勝芳等[60]、谷俊濤等[61]分別利用子葉下胚軸為外植體，通過農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化途徑，建立了高效表達(dá)黑曲霉PhyA基因和異源表達(dá)白羽扇豆(Lupinusalbus)酸性磷酸酶APase基因的白三葉草轉(zhuǎn)基因系，高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系植株的磷素累積量、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量顯著增加，證明外源轉(zhuǎn)化PhyA基因和APase基因均能顯著增強(qiáng)白三葉利用有機(jī)態(tài)磷的能力。

2.4品質(zhì)改良 白三葉體內(nèi)蛋白質(zhì)，特別是甲硫氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸可以顯著增加羊的生產(chǎn)量和羊毛的生產(chǎn)量[62-64]。豌豆清蛋白基因能夠有效增加白三葉蛋白質(zhì)含量，并且增加葉片的壽命[65-66]。而編碼蛋白基因在不同啟動(dòng)子作用下可以有效積累編碼蛋白，在研究了3種啟動(dòng)子Assu、Lssu、CAMV35S后發(fā)現(xiàn)，Assu啟動(dòng)子作用下SSA蛋白積累最高，可以提高葉蛋白含量的0.1%[67]。而轉(zhuǎn)富硫玉米(Zeamays)儲(chǔ)存蛋白基因也能明顯改善白三葉的飼用價(jià)值[68]。另外,Lepage等[69]利用農(nóng)桿菌將果聚糖轉(zhuǎn)移酶基因SacB轉(zhuǎn)化白三葉，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株莖中可溶性碳水化合物積累增加。

3 白三葉遺傳多樣性分析

種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是品種改良和育種的基礎(chǔ)，世界各國紛紛開展了相關(guān)方面的研究[70-80](表2)。

3.1形態(tài)學(xué)水平多樣性分析 形態(tài)標(biāo)記是植物遺傳多樣性分析的重要方面。Widdcup等[70]從美國東部收集了98個(gè)白三葉集群并與美國的拉迪諾，新西蘭的5個(gè)品種共同栽植，通過比較材料間葉片大小、綠期、越夏性等生理生態(tài)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)美國白三葉材料在新西蘭表現(xiàn)大多不如新西蘭本地品種，但也有幾個(gè)表現(xiàn)性狀較好的材料，可以通過與當(dāng)?shù)仄贩N回交雜交進(jìn)行改良，形成新的優(yōu)良品種[70]。為了進(jìn)一步搜集選育優(yōu)良的白三葉品種，Dzene等[71]對(duì)從19個(gè)國家收集的46份白三葉材料分析比較越冬性、花期、葉質(zhì)量、花序小花數(shù)等形態(tài)生理性狀，選出‘Dubraux’、‘Gigant’ 、‘Huia’ (New Zealand) 和‘Ecotype 2005’共4份材料，具有高產(chǎn)、早熟等優(yōu)良性狀。近年來我國也通過對(duì)白三葉形態(tài)標(biāo)記的研究和分類，在白三葉基礎(chǔ)研究上得到了較快發(fā)展。為了探尋各地白三葉遺傳變異情況，研究者對(duì)喀斯特地區(qū)不同年齡草地白三葉葉數(shù)、生長點(diǎn)數(shù)、中葉長、中葉長寬比等性狀進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，葉質(zhì)量、莖質(zhì)量、根質(zhì)量、地上生物量等指標(biāo)的種群內(nèi)變異系數(shù)則隨著草地年限的增加而增大[72]。新疆地區(qū)分布有白三葉，研究者收集了13份白三葉材料并對(duì)株高、葉形、葉色、花色等性狀進(jìn)行了遺傳多樣性分析，將其劃分為3類，為以后的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[73]。王建麗等[74]和李州等[75]對(duì)所收集的白三葉材料主要數(shù)量性狀的變異和相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)種質(zhì)材料存在著豐富的遺傳多樣性，各個(gè)數(shù)量性狀間均呈正相關(guān)，能為各類白三葉育種和遺傳研究提供較為豐富的親本材料[74-75]。

3.2分子水平遺傳多樣性分析 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記也在遺傳多樣性分析中發(fā)揮出越來越重要的作用。Kolliker等[76]利用AFLP對(duì)52份白三葉材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，品種相似系數(shù)從0.42到0.92。在此基礎(chǔ)上為了探究SSR在白三葉遺傳多樣性分析中的作用，Jahufer等[77]利用39對(duì)SSR引物對(duì)32份白三葉材料遺傳多態(tài)性分析，將其聚類到14個(gè)群組，平均相似系數(shù)為0.56，聚類結(jié)果與已知的基因型關(guān)系分析相似，說明SSR標(biāo)記可以有效對(duì)白三葉進(jìn)行遺傳多樣性分析。利用AFLP和RAPD技術(shù)，Badr等[81]也對(duì)一些白三葉材料構(gòu)建了指紋圖譜，揭示了其親緣關(guān)系，并對(duì)其遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了一定推測。我國分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展較晚，但也探究建立了穩(wěn)定可靠的白三葉RAPD技術(shù)體系，為白三葉遺傳多樣性RADP分析奠定基礎(chǔ)[79]，并利用形態(tài)學(xué)性狀遺傳多樣性分析和等位酶分析遺傳多樣性對(duì)多份白三葉材料進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法聚類分析結(jié)果不完全一致。但從總體來看，它們都可以從不同的側(cè)面來反映白三葉的遺傳多樣性，而且其結(jié)果也基本一致[80]。張婧源等[78]對(duì)來自五大洲的41份白三葉材料通過優(yōu)化后的SRAP進(jìn)行遺傳多樣性分析，證明白三葉種質(zhì)材料有豐富的遺傳多態(tài)性，且能將來自于同一地方的白三葉聚類，可靠性較高。

表2 白三葉遺傳多樣性研究Table 2 Genetic diversity research of white clover

4 白三葉逆境生理研究

4.1干旱 白三葉根系較淺，對(duì)水分比較敏感，容易遭受干旱脅迫，因此，研究其抗旱性差異及抗旱生理對(duì)其廣泛應(yīng)用具有重要意義。干旱脅迫時(shí)，植物膜結(jié)構(gòu)受到破壞、脯氨酸在植物體內(nèi)積累、葉綠素合成減少[82-85]。利用盆栽白三葉進(jìn)行土壤干旱處理，發(fā)現(xiàn)白三葉葉片細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性提高，體內(nèi)游離脯氨酸急劇積累，葉綠素急速分解，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)[86]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)白三葉植株葉、莖、根等器官及其生長部位的細(xì)胞質(zhì)膜通透性、丙二醛、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白質(zhì)含量及SOD活性比較研究發(fā)現(xiàn)，抗逆性物質(zhì)積累根大于莖，莖大于葉，葉是植株中對(duì)干旱脅迫最敏感的部位，可作為抗旱脅迫的檢測位點(diǎn)?？购蛋兹~品種通過增加可溶性糖、脯氨酸含量提高滲透勢(shì)及增加深根數(shù)量的能力顯著大于抗旱性差的品種[87-88]。生理形態(tài)指標(biāo)的變化在抗旱品種選擇中起了重要作用，朱旺生[89]通過研究干旱脅迫對(duì)不同白三葉品種幼苗形態(tài)、生長和生理指標(biāo)的影響，認(rèn)為白三葉品種百霸抗旱性能顯著好于考拉和鋪地。

4.2溫度 在我國北方，白三葉容易受低溫影響，冬季萎黃干枯比其他草坪草[早熟禾(Poaspp.)、高羊茅(Festucaarundinacea)等]早，來年返青卻又相對(duì)較晚，且返青均勻度差，影響了白三葉的開發(fā)利用，因此，人們不斷探究白三葉的抗寒機(jī)理，以期選出具有較好抗寒性的品種。研究發(fā)現(xiàn),白三葉匍匐莖頂端和腋芽組織耐凍性比較強(qiáng)，匍匐莖的生活力決定于頂芽、腋芽和維管束等特定器官的生機(jī)能力[90]。而溫度降低時(shí)，白三葉各項(xiàng)生理指標(biāo)也具有顯著變化，丙二醛含量逐漸上升，電導(dǎo)率升高，而SOD和POD活性表現(xiàn)出先降低后上升再下降的趨勢(shì)[91-92]。植物本身生理結(jié)構(gòu)也極大影響其抗寒性，研究發(fā)現(xiàn)抗寒性強(qiáng)的白三葉品種，柵欄細(xì)胞葉綠體面積大，而韌皮部比率和導(dǎo)管直徑小[93]。這些研究為選育新的抗寒性強(qiáng)的品種提供了較好的理論和實(shí)踐依據(jù)。

隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，白三葉在南方也得到了大面積的使用推廣，但白三葉是優(yōu)良的冷季型草坪草，其最適合的生長溫度是19～24 ℃，冬季低溫在-15 ℃，具有較高越冬率，高溫條件下出現(xiàn)大面積枯萎減緩甚至停止生長，貴州地區(qū)旬氣溫超過27 ℃，極端氣溫超過37 ℃的地區(qū)均未發(fā)現(xiàn)白三葉[94]，探究白三葉耐熱機(jī)理，選育抗高溫白三葉成為近些年的研究熱點(diǎn)之一。人工模擬高溫發(fā)現(xiàn)，45 ℃是白三葉葉片在高溫脅迫下大量喪失水分的拐點(diǎn)，也是大量喪失水分的臨界溫度，同時(shí)也是細(xì)胞膜通透性變化的臨界溫度；在對(duì)白三葉體內(nèi)脯氨酸含量、葉綠素降解程度研究后發(fā)現(xiàn)，35 ℃屬于白三葉正常生長范圍，而40～45 ℃是白三葉忍耐高溫的臨界溫度，50 ℃則是白三葉的致死溫度[95]。白三葉種子發(fā)芽受溫度影響極大，在40 ℃脅迫下種子不發(fā)芽；在20～35 ℃內(nèi)處理種子可以縮短種子萌發(fā)所需的時(shí)間，但白三葉種子發(fā)芽率隨溫度升高而降低，通過變溫處理能夠顯著提高白三葉種子的發(fā)芽率[96]。張鶴山等[97]也比較了18種三葉草的耐熱性，為長江流域及以南方區(qū)域推薦了海法、克勞等耐熱性較強(qiáng)的白三葉品種。

4.3重金屬 在經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)，其所帶來的重金屬污染日漸成為世界性的難題并帶來嚴(yán)重的環(huán)境和健康的風(fēng)險(xiǎn)[98]。在眾多土壤修復(fù)方法中，植物修復(fù)相比其他物理化學(xué)方法來說具有成本低廉、無污染，對(duì)場地環(huán)境擾動(dòng)少等優(yōu)點(diǎn)[99]。在研究中發(fā)現(xiàn)白三葉是一種重要的重金屬土壤修復(fù)植物。白三葉生物量大、植株地上部分對(duì)銅吸收總量較高，對(duì)銅具有較強(qiáng)耐性，是良好的修復(fù)銅污染土壤的植物[100]。白三葉不僅僅對(duì)銅具有富集作用，當(dāng)鎘質(zhì)量濃度低于25 mg·L-1時(shí),三葉草對(duì)不同質(zhì)量濃度鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)基本接近1或大于1，表現(xiàn)出富集植物的特性[101]。同時(shí)，白三葉也對(duì)芘污染土壤具有較好的富集作用，在對(duì)比試驗(yàn)中，白三葉比對(duì)照富集芘率高20%～46%，具有良好的修復(fù)能力[102]。白三葉具有良好的土壤修復(fù)功能，在多種重金屬積累的土壤上，隨重金屬濃度的增加，吸收的重金屬總量隨之增加，但其對(duì)重金屬吸收具有一定的拮抗作用[103]，在利用中應(yīng)加以注意。

5 存在的問題、對(duì)策與展望

近年來白三葉在我國得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，但相比新西蘭、澳大利亞等國家,我國對(duì)白三葉的研究嚴(yán)重滯后，主要存在以下幾個(gè)問題：1)全世界已經(jīng)選育出白三葉品種300多個(gè)，而我國白三葉選育品種很少。因此，應(yīng)該加強(qiáng)白三葉選育力量，建立快速選育體系，提高品種選育速度，選育出我國自己的品種。2)我國在綠化和牧草種植上需要的大量白三葉種子主要依靠進(jìn)口，目前國內(nèi)還未有規(guī)?；陌兹~種子生產(chǎn)基地。需要進(jìn)一步探究我國白三葉種子生產(chǎn)的技術(shù)體系及生產(chǎn)制度，建立具有良好經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益的種子生產(chǎn)基地。3)我國幅員遼闊，地理?xiàng)l件復(fù)雜，白三葉在各地表現(xiàn)狀況不盡相同，各生態(tài)型白三葉品種缺少分類標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)性較差。應(yīng)當(dāng)收集我國各地的白三葉種質(zhì)資源并對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，選擇適合當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)類型的白三葉品種，指導(dǎo)當(dāng)?shù)氐陌兹~生產(chǎn)應(yīng)用。4)遺傳轉(zhuǎn)化體系目前較為單一，轉(zhuǎn)化效率不高，而實(shí)用性高的目的基因較少。未來應(yīng)深入探討白三葉遺傳轉(zhuǎn)化體系影響因素，完善遺傳轉(zhuǎn)化體系，加強(qiáng)具有高表達(dá)量目的基因的篩選，為實(shí)用性、商業(yè)化轉(zhuǎn)基因白三葉的發(fā)展奠定基礎(chǔ)[104]。

白三葉是優(yōu)質(zhì)豆科牧草，也是良好的地被植物，具有重要的生物學(xué)意義和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。在已有的白三葉研究基礎(chǔ)上，應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)白三葉育種、生理和轉(zhuǎn)基因等方面的研究。因此，針對(duì)我國白三葉生產(chǎn)和科研的實(shí)際情況，應(yīng)加強(qiáng)抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)豐富、生物量高的白三葉牧草的選育，同時(shí)隨著園林綠化的發(fā)展，具有特色、外形美觀的地被草坪白三葉也將是白三葉選育的重要方向。現(xiàn)代生物技術(shù)的興起為培育和改良植物品種提供了一條便捷和實(shí)用的途徑，利用傳統(tǒng)育種與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，通過多基因聚合育種、同效多基因育種和基因工程技術(shù)[105]，以期獲得具有較高蛋白質(zhì)含量、抗高熱、耐鹽堿、抗病蟲、觀賞性強(qiáng)的白三葉新品種。使得白三葉得到進(jìn)一步的發(fā)展和更加廣泛的應(yīng)用，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

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