瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合培養(yǎng)條件優(yōu)化及凍干菌粉的制備

王燕，王發(fā)美，張秀苑，白雪，賀紅軍

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005）

0 引 言

鼠李糖乳桿菌、瑞士乳桿菌作為應(yīng)用最為廣泛的益生菌，其產(chǎn)品在美國、芬蘭、德國、澳大利亞、日本等30多個(gè)國家、地區(qū)廣泛分布[1]。這兩株菌能夠耐酸性以及膽鹽等，并且在腸道定殖能力強(qiáng)，能夠抑制有害菌侵入，結(jié)合并排除毒素、預(yù)防齲齒、預(yù)防和治療腹瀉、改善免疫系統(tǒng)，加速感染后的恢復(fù)，預(yù)防和治療過敏等作用[2]。鼠李糖乳桿菌和瑞士乳桿菌混合培養(yǎng)，瑞士乳桿菌對(duì)培養(yǎng)基中的蛋白的代謝能力較強(qiáng)，通過胞外蛋白水解酶將蛋白水解成小分子多肽和氨基酸[3-5]，鼠李糖乳桿菌具有較強(qiáng)的耐酸性，并能夠利用多肽及氨基酸，因此當(dāng)兩株菌混合培養(yǎng)時(shí)，利用兩株菌細(xì)胞代謝差異性，提高兩株菌的存活率。本文在兩株菌混合培養(yǎng)的基礎(chǔ)上以MRS為基礎(chǔ)對(duì)碳源、氮源進(jìn)行優(yōu)化，并通過真空冷凍干燥技術(shù)制備凍干菌粉，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)，752N紫外可見分光光度計(jì)，BPX-272電熱恒溫培養(yǎng)箱，梅特勒FE20 pH計(jì)，MLS-3780高壓蒸汽滅菌器，eppendorf-5810高速冷凍離心機(jī)，真空冷凍干燥機(jī)。

1.2 菌種

瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌均由中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所分離篩選，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏號(hào)分別為QC-1 CCTCC M 2015539，QC-2 CCTCC M 2015540。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母浸膏5 g，乙酸鈉 5 g，檸檬酸氫二銨 2 g，牛肉膏 10 g，吐溫-80 1 mL，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH=6.8，瓊脂15 g。

1.4 方法

1.4.1 菌種的活化

將-80℃下甘油保存的瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在無菌操作下分別接種于液態(tài)MRS培養(yǎng)基中，后置37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h后，對(duì)發(fā)酵后的菌液進(jìn)行分離、純化，反復(fù)活化3～4代，進(jìn)行種子液制備[5-6]。

1.4.2 活菌計(jì)數(shù)的測定

本文所選用的活菌計(jì)數(shù)法為同種細(xì)菌菌液的吸光度(Abs)在一定范圍內(nèi)與菌體數(shù)量呈正比關(guān)系以及系數(shù)涂布平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。采用紫外可見分光光度計(jì)測定瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵液的吸光度值。

1.4.3 碳源的優(yōu)化

將MRS液體培養(yǎng)基中的主要碳源（葡萄糖）去掉，其他成分不變[6]，分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、乳糖∶葡萄糖=1∶1、葡萄糖∶麥芽糖=1∶1。并以瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌6%的接種量，接種比例為瑞士乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=1∶2，且瑞士乳桿菌要早于鼠李糖乳桿菌3 h進(jìn)行接種，在37℃下培養(yǎng)24 h[6-8]。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。

1.4.4 有機(jī)氮源的優(yōu)化

將MRS液體培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源（蛋白胨）去掉，其他成分不變，分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨作為氮源。培養(yǎng)條件同1.4.3，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照[8-11]。

1.4.5 凍干離心條件的優(yōu)化

在無菌環(huán)境下，將發(fā)酵液菌體移入50 mL無菌離心管中，配平，利用冷凍離心機(jī)（4℃）對(duì)菌液進(jìn)行離心，設(shè)置不同轉(zhuǎn)速（4 000 r/min、6 000 r/min、8 000 r/min、10 000 r/min），不同的時(shí)間（10 min、15 min）下進(jìn)行離心，離心后所得的上層菌液倒入無菌瓶中，使用滅菌處理后的0.85%的生理鹽水洗滌沉淀2～3次，并稀釋沉淀到原體積，混合均勻，測定活菌數(shù)，并計(jì)算離心損失率和存活率，得出活菌收得率的最佳離心條件[12]。

離心損失率（%）=（初始活菌數(shù)-沉淀中活菌數(shù)）/初始活菌數(shù)×100%

離心收得率（%）=（沉淀中活菌數(shù)/初始活菌數(shù)）×100%

1.4.6 凍干保護(hù)劑的優(yōu)化

冷凍干燥過程中對(duì)凍干保護(hù)劑的種類以及添加量進(jìn)行優(yōu)化，向菌泥中分別添加無菌的脫脂奶粉(4%、8%、12%、16%)、海藻糖(2%、4%、6%、8%)、甘油（2%、4%、6%、8%）、L-谷氨酸鈉（0.5%、1%、1.5%、2%）、β-環(huán)糊精（4%、8%、12%、16%）、蔗糖（3%、6%、9%、12%），菌泥與無菌保護(hù)劑以1∶3的比例進(jìn)行混合，將混合均勻的樣品進(jìn)行凍干前預(yù)凍處理，將樣品放置于-80℃下預(yù)凍3 h，使樣品中的水分以固態(tài)的形式存在，并將預(yù)凍后的樣品放置于真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源的優(yōu)化結(jié)果

在不含碳源的MRS培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、乳糖：葡萄糖=1∶1、葡萄糖∶麥芽糖=1∶1，其他因素不變的條件下，在37℃下培養(yǎng)24 h，結(jié)果如圖1所示。

如圖1所示，兩株菌在含有不同的碳源的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h小時(shí)后，菌液的吸光值存在差異，瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長的最好，其次是葡萄糖，而在以乳糖、混合糖（乳糖∶葡萄糖=1∶1、麥芽糖∶葡萄糖=1∶1）為碳源的培養(yǎng)基中則生長相對(duì)于緩慢，因此選擇麥芽糖為增菌培養(yǎng)基的碳源。

2.2 氮源的優(yōu)化結(jié)果

在不含有機(jī)氮源的MRS培養(yǎng)基中分別加入1%的大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨，其他因素不變的條件下，在37℃下培養(yǎng)24 h，結(jié)果如圖2所示。

圖2 氮源對(duì)瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌生長的影響

如圖2所示，在不同種類的蛋白胨培養(yǎng)條件下時(shí)兩株菌吸光值（OD600）存在差異，大豆蛋白胨為有機(jī)氮源時(shí)，吸光值（OD600）明顯高于蛋白胨、胰蛋白胨及酪蛋白胨，大豆蛋白胨因含有豐富的氨基酸和生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，因此添加大豆蛋白胨有利于菌體生長，所以增菌培養(yǎng)基的有機(jī)氮源為大豆蛋白胨。

2.3 離心條件對(duì)菌體存活率的影響

離心速度以及離心時(shí)間對(duì)于菌體的存活率有很大的影響，實(shí)驗(yàn)主要對(duì)離心速度以及離心時(shí)間進(jìn)行了比較，通過離心前和離心后的菌種的存活率的大小進(jìn)行比較，得出最適的離心時(shí)間以及離心速度[14]。

圖3 離心條件對(duì)兩株菌離心效果的影響

由圖3可知，隨著離心速度的增加兩株菌的離心收得率降低，同時(shí)在相同的轉(zhuǎn)速不同的時(shí)間下菌株的存活率也相差很大，在離心轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，時(shí)間為15 min時(shí)菌株的離心收得率最高，而在10 000 r/min，離心時(shí)間為15 min時(shí)菌株的離心收得率最小，菌株在這種長時(shí)間以及高轉(zhuǎn)速的環(huán)境中容易發(fā)生細(xì)胞的破碎，進(jìn)而影響了它的存活率，因此選擇離心轉(zhuǎn)為6 000 r/min，離心時(shí)間15 min對(duì)菌液進(jìn)行離心。

2.4 凍干保護(hù)劑的篩選

冷凍干燥過程中菌泥中分別添加無菌的凍干保護(hù)劑的種類及添加量分別為，脫脂奶粉(4%、8%、12%、16%)、海藻糖(2%、4%、6%、8%)、甘油（2%、4%、6%、8%）、L-谷氨酸鈉（0.5%、1%、1.5%、2%）、β-環(huán)糊精（4%、8%、12%、16%）、蔗糖（3%、6%、9%、12%）進(jìn)行冷凍干燥，將凍干后的菌粉進(jìn)行同體積復(fù)水，稀釋涂板計(jì)數(shù)，求得凍干后的活菌數(shù)以及菌的凍干存活率，如圖4所示。

圖4 不同凍干保護(hù)劑對(duì)瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響

由圖4可知，以脫脂奶粉、海藻糖、甘油作為保護(hù)劑時(shí)兩株菌的凍干存活率最高，說明在凍干過程中，細(xì)胞損傷較小，保護(hù)效果較好。因此選取脫脂奶粉(4%、8%、12%、16%)、海藻糖(2%、4%、6%、8%)、甘油（2%、4%、6%、8%）作為兩株混合菌的凍干保護(hù)劑[15-17]。

2.4.1 凍干保護(hù)劑的交互作用研究

通過Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，確定因素水平及編碼見表1，并按照表所給方案完成17組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼表

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

將表2數(shù)據(jù)利用Design Expert.8.0.5軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

活菌數(shù)=+7.62+0.13A+0.014B+0.11C+0.095AB+0.068AC-0.14BC-0.20A2-0.27B2-0.21C2

為檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)兩株菌凍干后活菌數(shù)的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的方差分析結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

P＞0.10，說明模型或考察因素影響不顯著；P＜0.05說明模型影響顯著；P＜0.01說明模型影響極顯著。從表3可以看出，根據(jù)回歸方差分析顯著性的檢驗(yàn)，回歸模型顯著性檢驗(yàn)P＜0.01，說明該模型的預(yù)測性良好；并且失擬項(xiàng)P值為0.1192（P＞0.10），說明實(shí)驗(yàn)的誤差較小，回歸方程與實(shí)際情況吻合程度較高，因此，可用此回歸方程來代替實(shí)驗(yàn)中真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測。一次項(xiàng)中A的偏回歸系數(shù)顯著（P＜0.05），說明脫脂奶粉對(duì)兩株菌凍干存活率有顯著影響。從分析中可以看出一次項(xiàng)A、C差異均達(dá)到極顯著水平。在所確定的試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度順序?yàn)椋篈＞C＞B，即脫脂奶粉＞甘油＞海藻糖。3個(gè)因素中，海藻糖和甘油之間有極顯著的交互作用。交互項(xiàng)AC的偏回歸系數(shù)不顯著（P＞0.10），說明脫脂奶粉與甘油的交互作用對(duì)兩株菌凍干存活率沒有顯著影響。二次項(xiàng)A2、B2、C2偏回歸系數(shù)均顯著，說明其對(duì)兩株菌凍干存活率的影響均極顯著（P＜0.01）。

表3 以兩株混合菌的活菌數(shù)為響應(yīng)值的回歸模型方差分析

表4 方程相關(guān)系數(shù)

由表4可知決定系數(shù)R2＝0.9718，校正決定系數(shù)R2Adj＝0.9356，說明該模型擬合度較好；信噪比較大說明模型有較高的可信度；變異系數(shù)CV=0.45%＜5%，說明方程的重現(xiàn)性較好。這表明該模型自變量與指標(biāo)值之間的線性關(guān)系顯著，模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)的擬合性較好。因此，能夠用此模型預(yù)測響應(yīng)值隨自變量的變化規(guī)律。

2.4.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)軟件分析結(jié)果得出二次多項(xiàng)回歸方程，做出三維立體響應(yīng)面圖，預(yù)測上述三個(gè)因素對(duì)兩株菌冷凍干燥時(shí)菌得凍干存活率的影響。

圖5 海藻糖和脫脂奶粉對(duì)兩株菌凍干存活率的影響

如圖5可知，隨著脫脂奶粉添加量的增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，而隨著海藻糖添加量的增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)，其中海藻糖添加量相對(duì)于茶多酚的添加量對(duì)活菌的影響不顯著。由等高線圖可以看出，等高線接近于橢圓，表明它們的交互作用顯著，這與表3的結(jié)果一致。

由圖6可知，在研究范圍內(nèi)，活菌數(shù)隨著甘油和脫脂奶粉添加量的增加而增加，一定程度后開始減少。其中在凍干保護(hù)中甘油的添加量相對(duì)于脫脂奶粉的添加量的影響不顯著，前者增大或減少的趨勢(shì)不如后者明顯。由等高線圖可以看出，等高線接近于圓，表明它們的交互作用不顯著，這與表3的結(jié)果一致。

圖6 脫脂奶粉和甘油對(duì)兩株菌凍干存活率的影響

圖7 海藻糖和甘油對(duì)兩株菌凍干后活菌數(shù)的影響

由圖7可知，在研究范圍內(nèi)，隨著海藻糖和甘油添加量的增加活菌數(shù)前期增加，后期減小。其中在海藻糖的添加量相對(duì)于甘油的添加量對(duì)活菌數(shù)的影響不顯著，前者增大或者減少的趨勢(shì)不如后者明顯。由等高線圖可以看出，等高線接近于橢圓，交互作用顯著，這與表3的結(jié)果一致。

采用中心組合實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，得出了二次多元回歸方程，對(duì)于方程求解得出的凍干保護(hù)劑的最佳組合為：脫脂奶粉添加量為14%、海藻糖添加量為6%、甘油添加量為4%。因最佳工藝條件不在表中，故需進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在對(duì)兩株菌進(jìn)行冷凍干燥過程中，脫脂奶粉添加量為14%、海藻糖添加量為6%、甘油添加量為4%的凍干保護(hù)劑作用下兩株菌的活菌數(shù)最高[18-19]，活菌數(shù)約為5.9×109cfu/mL，因此確定凍干保護(hù)劑的最佳組合為脫脂奶粉添加量為14%、海藻糖添加量為6%、甘油添加量為4%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)碳源、氮源的進(jìn)行優(yōu)化，提高混合菌株的存活率；對(duì)培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行真空冷凍干燥，并對(duì)凍干過程中離心條件以及凍干保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩株菌在MRS培養(yǎng)基的碳源為麥芽糖，有機(jī)氮源為大豆蛋白胨，其他條件不變的情況下混合菌的存活率提高，通過真空冷凍干燥技術(shù)制備的凍干菌粉的活菌存活率高，可應(yīng)用與食品、飼料等行業(yè)[20]，同時(shí)也為工業(yè)化益生菌凍干菌粉制備提供理論依據(jù)。