美沙拉嗪聯(lián)合酪酸梭菌對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠治療作用及機(jī)制研究

王星星，賀 沁，趙 婕，李 蕊，劉 昕，張明亮*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，山西汾陽(yáng)032200；2.晉城市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山西晉城048026；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南鄭州450052；4.天津金域檢驗(yàn)有限公司實(shí)驗(yàn)診斷室，天津300000)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis UC)是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥，是目前我國(guó)臨床上較為多見的炎癥性腸病。UC是結(jié)腸癌的癌前病變，近年來其發(fā)病率逐漸增高，已被WHO列為難治疾病之一。上世紀(jì)30年代以來，臨床上治療UC主要使用柳氮磺吡啶(SASP)，雖然在一定程度上能控制和緩解UC的癥狀，但是它的治療效果并不理想，并且長(zhǎng)期使用SASP易發(fā)生許多不良反應(yīng)，停止使用后病情容易復(fù)發(fā)[1]。目前潰瘍性結(jié)腸炎的病因尚未明確，但是逐漸明確該病與腸道菌群失調(diào)和腸內(nèi)抗原應(yīng)激有很大關(guān)系[2]。近年來治療該病主要使用新型替代性5-氨基水楊酸(5-ASA)制劑和益生菌類微生態(tài)藥物。有大量研究表明，美沙拉嗪和酪酸梭菌對(duì)UC有治療作用，但其治病機(jī)制并不十分明確。有研究顯示，細(xì)胞因子在UC的發(fā)病機(jī)制中有重要作用[3]。本研究通過美沙拉嗪和酪酸梭菌治療TNBS/乙醇誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎，結(jié)腸損傷的修復(fù)作用及血清中抗炎因子IL-4和促炎因子IL-6水平的影響，從而進(jìn)一步了解這兩種藥物對(duì)UC的療效，探討其在UC治療中的免疫機(jī)理，為臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

5%三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma進(jìn)口原裝，購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司;美沙拉嗪，市售法國(guó)愛的發(fā)制藥出品，規(guī)格0.5 g/粒，10粒/盒；酪酸梭菌MIYAIRI588菌粉購(gòu)自中國(guó)有益菌微生物菌庫(kù)。大鼠白介素IL-4和IL-6的ELISA試劑盒，購(gòu)自上海瑞齊生物科技有限公司，4℃高速離心機(jī)、分光光度檢測(cè)儀器、體重計(jì)、天平，生物顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 TNBS/乙醇法制備大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型 采用TNBS復(fù)合50%乙醇法造模，參照文獻(xiàn)[4]制作TNBS潰瘍性結(jié)腸炎的動(dòng)物模型。清潔級(jí)SD雄性大鼠50只，體重(210±20)g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)抽取10只大鼠作為正常對(duì)照組(A組)，其余大鼠進(jìn)行造模，造模前均禁食24 h，用10%水合氯醛(0.30 mL/100 g，最好現(xiàn)用現(xiàn)配)腹腔注射麻醉后，用聚丙烯管插入肛門上段8 cm后一次性緩慢注入TNBS/乙醇混合試劑，誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎。觀察到大鼠毛色暗淡、精神萎靡、食量減少且出現(xiàn)粘液膿血便或便潛血試驗(yàn)陽(yáng)性，3 d后，取正常對(duì)照組和模型對(duì)照組各兩只大鼠進(jìn)行解剖，并分別抽取腹主動(dòng)脈血分離血清標(biāo)記保存待測(cè)。確認(rèn)造模成功后將造模大鼠隨機(jī)分成模型對(duì)照組(B組)，美沙拉嗪組(C組)，酪酸梭菌組(D組)和美沙拉嗪與酪酸梭菌聯(lián)合治療組(E組)四組。

1.2.2 分組灌胃治療 確認(rèn)造模成功后開始分組灌胃治療，A組和B組給予0.9%的生理鹽水(1 mL/100 g)灌胃。C組給予美沙拉嗪(0.416 g/kg/次/日1 mL/100 g)灌胃，D組給予酪酸梭菌(濃度為2.3×1011cfu/L劑量為10 mL/kg)灌胃。E組給予美沙拉嗪(0.416 g/kg/次/日1 mL/100 g)和酪酸梭菌(濃度為2.3×1011cfu/L劑量為10 mL/kg)灌胃。以上各組1次/d，灌胃前需稱量體重，連續(xù)灌胃治療14 d。

1.2.3 標(biāo)本采集 治療14 d后，大鼠禁食不禁水24 h，稱量體重后，全部用10%水合氯醛麻醉。分別解剖抽取腹主動(dòng)脈血5 mL，然后3000 r/min的低溫離心機(jī)高速離心10 min，分離出血清，-20℃保存?zhèn)溆?；并采集結(jié)腸段腸組織8 cm放入生理鹽水清洗，清洗后沿著腸系膜縱行切開，放于平板上，進(jìn)行結(jié)腸病灶病理組織顯微鏡檢查并評(píng)分(CMDI)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：結(jié)腸無病變，0分；輕度充血水腫，但表面光滑，無糜爛潰瘍，1分；充血水腫，粘膜表面粗糙，有糜爛或潰瘍，2分；高度充血水腫，粘膜表面有潰瘍壞死，潰瘍最大直徑<1 cm，腸壁增厚或有壞死炎癥，3分；在3分基礎(chǔ)上潰瘍最大直徑>1 cm，或全腸壁壞死，4分。取病變明顯處橫行切塊放入4%多聚甲醛中固定，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯I、II透明，石蠟包埋；組織切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木精伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后，光鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 大鼠血清IL-4、IL-6含量測(cè)定 將血清從-20℃冰箱中取出放入4℃冰箱中溶解24 h，然后實(shí)驗(yàn)前1 h放至室溫待全部溶解，輕輕搖晃混勻，以免出現(xiàn)沉淀。嚴(yán)格按照大鼠IL-4和IL-6酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，操作完成后使用自動(dòng)化酶標(biāo)儀分光光度計(jì)測(cè)定450 nm處的吸光度值(OD值)分別計(jì)算血清IL-4和IL-6的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況及CMDI評(píng)分

造模后的大鼠毛色暗淡，體型消瘦，活動(dòng)狀態(tài)不佳，精神萎靡不振，食量顯著減少，出現(xiàn)貼邊集中的情況，觀察糞便可見稀便、粘液膿血便，而正常對(duì)照組無改變。給藥后大鼠情況逐步好轉(zhuǎn)，藥物治療兩周后，可見皮膚毛色恢復(fù)光澤，體重增加，反應(yīng)靈敏，活潑好動(dòng)，每日進(jìn)食量增加，糞便變成條狀或顆粒狀。各組大鼠CMDI評(píng)分比較見表1(P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

表1 各組大鼠CMDI評(píng)分

注：★表示與正常對(duì)照組相比：模型組(P=0.013)，美沙拉嗪組(P=0.023)，酪酸梭菌組(P=0.026)，聯(lián)合治療組(P=0.017)；☆表示與模型組相比：美沙拉嗪組(P=0.014)，酪酸梭菌組(P=0.019)，聯(lián)合治療組(P=0.012)。

2.2 結(jié)腸組織病理學(xué)改變

對(duì)照組大鼠肉眼觀結(jié)腸組織完整，無異常改變，顯微鏡下可見完整的組織結(jié)構(gòu)且無水腫充血現(xiàn)象。模型組大鼠肉眼觀結(jié)腸組織變硬肥大，出現(xiàn)點(diǎn)狀出血及多處潰瘍，且潰瘍較大，有的甚至達(dá)粘膜肌層，鏡下可見粘膜層缺損，腺體不規(guī)則，杯狀細(xì)胞減少且排列紊亂，全層增生肥厚，有大量中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)。各組大鼠經(jīng)治療后粘膜改變程度不一，美沙拉嗪組和酪酸梭菌組大鼠結(jié)腸雖仍存有潰瘍痕跡，但已明顯減輕，粘膜無充血水腫，僅有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可見纖維組織增生修復(fù)，且聯(lián)合治療組粘膜層修復(fù)較好(圖1)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸顯微照片

2.3 各組大鼠血清IL-4、IL-6含量的水平比較

如表2所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、美沙拉嗪組和酪酸梭菌組IL-4含量均顯著降低，IL-6含量均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，美沙拉嗪組、酪酸梭菌組和聯(lián)合治療組IL-4、IL-6含量均有顯著差異(P<0.01)。聯(lián)合治療組IL-4、IL-6含量均與美沙拉嗪組和酪酸梭菌組有顯著差異(P<0.01)。

表2 各組大鼠血清中血清IL-4、IL-6含量比較

注：★表示與正常對(duì)照組比較：模型對(duì)照組(P=0.00)，美沙拉嗪組(P=0.001)，酪酸梭菌組(P=0.00)，聯(lián)合治療組(P=0.00)；☆表示與模型組比較：美沙拉嗪組(P=0.002)，酪酸梭菌組(P=0.001)，聯(lián)合治療組(P=0.00)；▲表示與美沙拉嗪組相比：聯(lián)合治療組(P=0.00)；△表示與酪酸梭菌組相比：聯(lián)合治療組(P=0.00)。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎在西方地區(qū)發(fā)病率一直較高，隨著人民生活水平的提高，生活方式的西方化，醫(yī)療水平的提高，對(duì)UC的認(rèn)識(shí)逐漸增多，我國(guó)UC的發(fā)病率也逐漸增高。有專家指出UC將成為我國(guó)的主要腸道疾病。在臨床治療UC的過程中由于缺乏特異高效安全的藥物，用藥后病情易反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，且多數(shù)藥物有不良反應(yīng)，給患者帶來了很大的痛苦，生活質(zhì)量受到很大影響。因此尋找高效特異的治療UC的藥物迫在眉睫。

大量臨床資料及報(bào)道表明，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)關(guān)系密切。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為正常情況下機(jī)體內(nèi)存在的促炎因子和抗炎因子保持著動(dòng)態(tài)平衡，但是一旦這種平衡被打破，如促炎因子相對(duì)活躍，抗炎因子相對(duì)受抑制，便對(duì)UC的發(fā)病產(chǎn)生重要影響。同時(shí)許多研究資料顯示，UC的產(chǎn)生除與遺傳因素有關(guān)外，與腸內(nèi)菌群失調(diào)，特別是酪酸梭菌生成不足導(dǎo)致腸道內(nèi)免疫機(jī)能失調(diào)關(guān)系密切[5]。本次研究使用的美沙拉嗪是目前臨床上治療UC的一種新型藥物，其有效成分是5-氨基水楊酸(5-ASA)，在結(jié)腸的病變部位有較高的藥物濃度，主要作用是抑制前列腺素和白三烯等炎癥介質(zhì)的合成，對(duì)腸壁炎癥有顯著的消炎作用，對(duì)發(fā)炎的腸壁結(jié)締組織效果尤為明顯。許多研究表明，美沙拉嗪能夠顯著減少由于使用SASP所致的胃腸道反應(yīng)，過敏反應(yīng)，肝腎損害等全身不良反應(yīng)[6]。酪酸梭菌菌粉屬于益生菌類藥物，能耐受胃酸進(jìn)入腸道，在腸內(nèi)釋放有益于腸粘膜再生和修復(fù)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)酪酸(丁酸)，修復(fù)受損傷的腸粘膜。并能促進(jìn)雙歧桿菌等腸道有益菌生長(zhǎng)，抑制痢疾志賀氏菌等腸道有害菌生長(zhǎng)，加速腸道菌群及免疫機(jī)能的恢復(fù)。

IL-4作為一種抗炎因子，是T細(xì)胞產(chǎn)生的一種淋巴因子，對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞均有免疫調(diào)節(jié)作用，研究證實(shí)IL-4可抑制單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β，能減弱活化的單核巨噬細(xì)胞分泌氧自由基的能力[7]，從而作為抑炎因子減慢潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。IL-6是公認(rèn)的促炎因子，是由TNF-α等炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生的，能夠趨化中性粒細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，引起炎細(xì)胞大量浸潤(rùn)，促進(jìn)腸粘膜炎性損傷[8]。研究表明UC患者血清中IL-6的水平顯著升高，其含量與UC病變范圍和病情嚴(yán)重程度成正比[9]。本研究顯示大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型組血清IL-4水平降低、IL-6水平升高，而通過使用美沙拉嗪、酪酸梭菌以及二者聯(lián)合治療后，血清IL-4水平升高、IL-6水平降低，與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而聯(lián)合使用美沙拉嗪和酪酸梭菌血清IL-4水平顯著升高、IL-6水平顯著降低，且與美沙拉嗪組和酪酸梭菌組有顯著差異(P<0.01)。

本實(shí)驗(yàn)用美沙拉嗪、酪酸梭菌治療潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠，聯(lián)合使用美沙拉嗪和酪酸梭菌比單獨(dú)治療大鼠血清IL-4、IL-6的水平改變更明顯，療效更佳，由此表明美沙拉嗪和酪酸梭菌是通過抑制促炎因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)而達(dá)到治療UC的目的，二者聯(lián)合使用具有更好的治療效果。