國產(chǎn)注射用硫酸頭孢匹羅質(zhì)量評價

李偉 曹曉云 郭福慶 楊倩 劉海玲

(天津市藥品檢驗研究院，天津 300070)

硫酸頭孢匹羅是Hoechst(德國)和Roussel(法國)公司研制的第四代頭孢菌素，1992年在瑞典上市，1999年德國安萬特公司獲進口許可，同年石藥集團中諾藥業(yè)獲批準(zhǔn)文號，國內(nèi)首仿[1]。其抗菌作用強，抗菌譜廣，對革蘭陽性菌(如葡萄球菌屬、糞腸球菌)、革蘭陰性菌(如布蘭球菌屬、假單胞菌)及厭氧菌敏感，對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，可治療敏感細(xì)菌引起的呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、腹腔感染、盆腔感染和敗血癥等[2-3]。本品為注射用無菌粉針劑，有0.25、0.5、1.0和2.0g共4個規(guī)格。原料企業(yè)42家，批準(zhǔn)文號43個；制劑企業(yè)58家，批準(zhǔn)文號112個。注射用硫酸頭孢匹羅在中國藥典2015年版、歐洲藥典EP9.0、美國藥典USP40、英國藥典BP2017及JP17均未收載；進口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)為JX19980078。國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)均執(zhí)行國家局頒布的注冊標(biāo)準(zhǔn)。JP17收載硫酸頭孢匹羅原料。

為加強對國家基本藥物質(zhì)量的監(jiān)督管理，客觀的評價藥品的質(zhì)量現(xiàn)狀，分析產(chǎn)品的主要質(zhì)量問題，進而明確提高產(chǎn)品質(zhì)量的方向[4]。本文在完成法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合探索性研究對檢驗結(jié)果進一步分析，進而對國產(chǎn)注射用硫酸頭孢匹羅的質(zhì)量現(xiàn)狀進行評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 series高效液相色譜儀；島津20A高效液相色譜儀；Shimadzu離子阱飛行時間質(zhì)譜儀LCMS-ITTOF，LCMS solution V3.80工作站；Shinadzu DTG-60熱重分析儀；Novasina LabMaster水分活度儀；Bruker D2phaser X-射線粉末衍射儀；Malvern APA2000粒度儀；Bruker Matrix-F型近紅外光譜儀；Dionex ICS-5000離子色譜儀；Varian AA240-FS 原子吸收分光光度計。

1.2 試藥

硫酸頭孢匹羅對照品(82.8%)由中國食品藥品檢定研究院提供；來自國內(nèi)4家生產(chǎn)企業(yè)的12批注射用硫酸頭孢匹羅均為2017年國家評價性抽驗樣品；磷酸、磷酸二氫氨、三乙胺為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

2 實驗方法

2.1 法定檢驗

法定檢驗注射用硫酸頭孢匹羅的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均未在各國藥典收載，我國也尚無統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為各生產(chǎn)企業(yè)獲批的國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊標(biāo)準(zhǔn)。本次檢驗涉及的4個執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(YBH38002005、YBH35282005、YBH07712006和YBH03142012)均設(shè)置有性狀、HPLC法鑒別、酸堿度、溶液的澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、干燥失重、細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌、不溶性微粒、裝量差異、可見異物和含量測定項目，部分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)有化學(xué)鑒別、結(jié)晶性、頭孢匹羅聚合物檢查等項目。

2.2 探索性研究

根據(jù)法定檢驗結(jié)果以及檢驗中發(fā)現(xiàn)的問題，結(jié)合制劑處方工藝及專項調(diào)研中對該品種的了解，圍繞原料及制劑的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面，本次探索性研究重點關(guān)注該品種的安全性、工藝合理性、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可控性等方面的內(nèi)容。

2.2.1 有關(guān)物質(zhì)Ⅰ研究[5-7]

色譜條件：色譜柱：Agilent XDB C18(250mm×4.6mm, 5μm)；以0.03mol/L磷酸二氫銨溶液[用磷酸調(diào)節(jié)pH值至(3.3±0.1)]-乙腈(90:10)為流動相A，以0.03mol/L磷酸二氫銨溶液[用磷酸調(diào)節(jié)pH值至(3.3±0.1)]-乙腈(60:40)為流動相B，按表1梯度洗脫程序進行線性梯度洗脫；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：270nm；進樣量：20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.2 有關(guān)物質(zhì)Ⅱ研究[8-10]

色譜條件：色譜柱：球狀親水硅膠(分子量適用范圍為500～15000)為填充劑[TSK-GELG2000SWXL，(7.8mm±300mm, 5μm)；或效能相當(dāng)?shù)纳V柱]；流動相：磷酸鹽緩沖液[0.005mol/L磷酸氫二鈉-0.005mol/L磷酸二氫鈉溶液(50:50，V/V)]-乙腈(90:10)；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm；進樣量：20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.3 碳酸鈉含量測定[10]

實驗條件：波長：330.3nm；狹縫：0.2nm；燈電流：5.0mA。取對照品溶液及空白溶液在330.3nm的波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度平均值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取供試品溶液同法測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得供試品溶液中鈉離子的相應(yīng)濃度，并計算供試品中碳酸鈉的含量。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Linear gradient elution program

2.2.4 制劑中的水分研究[11]

采用熱重法和水活度測定法，考察樣品中游離水和結(jié)晶水。利用熱重分析儀及水活度儀對本品制劑和原料中水分的分布情況進一步研究。

熱重法：取樣品適量置于熱重分析儀內(nèi)微熱天平上的器皿內(nèi)，起始溫度為30℃，以10℃/min的速度加溫至300℃。

水分活度測定法：取樣品適量置于儀器中的樣品皿中，設(shè)定溫度為25℃，平衡時間為25min。

2.2.5 引濕性對樣品穩(wěn)定性影響的研究[12]

根據(jù)中國藥典2015年版四部通則9103藥物引濕性試驗指導(dǎo)原則[13]，對每個制劑生產(chǎn)企業(yè)的各一批樣品以及企業(yè)B提供的原料進行引濕性試驗，并測定引濕前后各樣品的水活度，然后對引濕前后樣品的有關(guān)物質(zhì)進行測定，判斷水分對藥品穩(wěn)定性的影響。

2.2.6 晶型與粒度分布研究[11]

3 結(jié)果與分析

3.1 法定檢驗結(jié)果與分析

按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗，4家企業(yè)的12批次樣品均符合規(guī)定，合格率100%。對現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)的質(zhì)控項目如酸堿度、溶液的澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、頭孢匹羅聚合物和含量測定等結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

3.1.1 酸堿度

對12批樣品酸堿度測定值進行統(tǒng)計分析，平均值為6.14，分布范圍為5.60～6.77，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品酸堿度的平均值略有差異，A企業(yè)的樣品pH均值最低，為5.93；而C企業(yè)的樣品pH均值最高，為6.68。A企業(yè)來自不同抽樣地點的批號相同的3批產(chǎn)品，其pH值分別為6.61、5.76和5.60。來自企業(yè)倉庫的樣品pH值明顯高于其他抽樣地點的兩批樣品。本產(chǎn)品是由硫酸頭孢匹羅與一定量的無水碳酸鈉混合制成的，碳酸鈉的含量直接影響制劑的pH值大小。結(jié)合該3批樣品的碳酸鈉含量存在較大差異，且有關(guān)物質(zhì)未見明顯不同的結(jié)果，初步分析可能與硫酸頭孢匹羅與碳酸鈉混合工藝的工藝控制有關(guān)，造成批內(nèi)差異較大。

3.1.2 溶液的澄清度與顏色

法定標(biāo)準(zhǔn)要求0.1g/mL的供試品水溶液應(yīng)澄清無色；如顯渾濁，與1號濁度標(biāo)準(zhǔn)液比較，均不得更濃；如顯色，與黃色(Y)或黃綠色(YG)9號標(biāo)準(zhǔn)比色液比較，均不得更深(表2)；經(jīng)檢驗，結(jié)果均符合規(guī)定(表2)。檢驗過程中發(fā)現(xiàn)，企業(yè)B和C的樣品顏色均約相當(dāng)于黃色4號，雖然符合規(guī)定，但是顏色偏黃綠色。為保證標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一和嚴(yán)謹(jǐn)，結(jié)合各企業(yè)的檢驗結(jié)果，建議標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定修訂為“不得過黃色或黃綠色7號標(biāo)準(zhǔn)比色液”。

表2 溶液的澄清度與顏色標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定與檢驗結(jié)果Tab.2 Standard and test results of clarity and color of solution

3.1.3 有關(guān)物質(zhì)

圖1 最大雜質(zhì)和總雜質(zhì)相關(guān)性趨勢圖Fig.1 Trend diagram of correlation between the maximum impurity and total impurities

各企業(yè)均采用HPLC等度洗脫方式、自身對照法對單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)量進行控制，企業(yè)A采用對照品外標(biāo)法控制特定雜質(zhì)2、3-環(huán)戊烯并吡啶的含量，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，企業(yè)A的總雜質(zhì)含量相對其他3家企業(yè)較低。為了研究最大雜質(zhì)與總雜質(zhì)的相關(guān)性，對企業(yè)A的6批產(chǎn)品中的最大單個雜質(zhì)使用自身對照法計算，通過對12批樣品的最大雜質(zhì)含量與總雜質(zhì)含量進行相關(guān)性統(tǒng)計分析可知，最大雜質(zhì)含量和總雜含質(zhì)量呈顯著正相關(guān)(圖1)。由于企業(yè)A在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中控制了2,3-環(huán)戊烯并吡啶的含量，其色譜圖中的最大雜質(zhì)就是2,3-環(huán)戊烯并吡啶，其最大雜質(zhì)和總雜質(zhì)的量都比其他3家生產(chǎn)企業(yè)低。通過了解硫酸頭孢匹羅的合成工藝可知，兩種合成路線中，2,3-環(huán)戊烯并吡啶都是必須要使用的原料之一。在探索性研究中還發(fā)現(xiàn)，樣品在高溫高濕的情況下極易分解釋放出2,3-環(huán)戊烯并吡啶，提示在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中控制其含量，是十分必要的。其他3家企業(yè)的法定標(biāo)準(zhǔn)采用不同的色譜系統(tǒng)分析有關(guān)物質(zhì)，其最大雜質(zhì)是否為2,3-環(huán)戊烯并吡啶，將在后續(xù)的探索性試驗中進行重點研究。

看你的創(chuàng)作軌跡，萬行長詩《鬣狗公主娜比》與50萬字的長篇小說《德克薩斯》，兩者幾乎是并行交叉完成。你曾說，寫歷史長篇是一件非常痛苦的事情，但你很享受不斷改變自己的過程，因為這除了考驗人的意志力，更時刻檢驗作者對歷史文化藝術(shù)的獨特視角與卓越見解。一部作品的完成，就是一個全新的超越，會倍有成就感。

3.2 探索性研究結(jié)果與分析

針對國產(chǎn)注射用硫酸頭孢匹羅的生產(chǎn)和質(zhì)量現(xiàn)狀，對有關(guān)物質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、制劑中的水分、引濕性對穩(wěn)定性的影響、碳酸鈉含量、晶形與粒度分布等進行研究，進一步評價各生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量。

3.2.1 有關(guān)物質(zhì)Ⅰ分析

按照“2.2.1”項下建立的梯度洗脫方法能洗脫出強保留的雜質(zhì)，與法定標(biāo)準(zhǔn)采用的等度洗脫方法比較，檢出的雜質(zhì)總量多，而且能同時控制特定雜質(zhì)2,3-環(huán)戊烯并吡啶的含量(圖2)。經(jīng)檢驗，4個生產(chǎn)企業(yè)的12批樣品的雜質(zhì)個數(shù)和雜質(zhì)總量均有明顯增加。通過LC-MS對各企業(yè)產(chǎn)品的分析，發(fā)現(xiàn)最大雜質(zhì)均為2,3-環(huán)戊烯并吡啶。進一步提示質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中控制2,3-環(huán)戊烯并吡啶的含量是非常必要的(表3和圖3)。

3.2.2 有關(guān)物質(zhì)Ⅱ分析

頭孢匹羅為β-內(nèi)酰胺類抗生素，速發(fā)型過敏反映在臨床上最為常見，而高分子雜質(zhì)是引起此類過敏反映的過敏原，控制此類高分子雜質(zhì)的含量是提高β-內(nèi)酰胺類抗生素藥品質(zhì)量的重要手段。目前現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)大部分沒有收載聚合物檢測項，只有少數(shù)企業(yè)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用葡聚糖凝膠G10柱測定聚合物，但分析時間長，靈敏度低，且頭孢匹羅對照品在流動相B中不締合，一般采用與頭孢匹羅分子量相近的頭孢噻肟或頭孢他啶作為替代，但是與頭孢匹羅的響應(yīng)值不一樣，未考慮響應(yīng)因子，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。該研究采用球狀蛋白色譜用親水硅膠(TSK)系統(tǒng)測定的雜質(zhì)，通過LC-MS分析，主峰前的色譜峰并不都是高分子雜質(zhì)(聚合物)，且每一個色譜峰也不是純峰，而是多個化合物(雜質(zhì))的混合物。而在該系統(tǒng)中檢出的雜質(zhì)，在RP-HPLC系統(tǒng)中只能部分檢出，RP-HPLC系統(tǒng)不能反映該品種的全部雜質(zhì)。而TSK系統(tǒng)(圖4)既能檢查本品的高分子雜質(zhì)，又可作為RP-HPLC檢查有關(guān)物質(zhì)的一個補充，可全面控制本品的雜質(zhì)，提高本品的質(zhì)量。

圖2 有關(guān)物質(zhì)色譜圖Fig.2 Chromatograms of related substances

表3 兩種方法測定有關(guān)物質(zhì)的結(jié)果Tab.3 Results of the related substances by two methods

圖3 兩種方法測定有關(guān)物質(zhì)總雜質(zhì)的比較趨勢圖Fig.3 Trend diagram of total impurities in related substances by two methods

3.2.3 碳酸鈉含量測定結(jié)果

根據(jù)各企業(yè)的制劑處方，注射用硫酸頭孢匹羅中碳酸鈉的理論含量為15.5%，而碳酸鈉具有引濕性，可引起硫酸頭孢匹羅降解，影響制劑的穩(wěn)定性；另外碳酸鈉的粒度較大，易造成與硫酸頭孢匹羅混合不均勻，影響藥品的均一性。因此碳酸鈉的含量與本品的酸堿度、引濕性及穩(wěn)定性有密切的關(guān)系，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中均未進行控制。按照“2.2.3”項建立的方法對各批次樣品進行測定，4家企業(yè)碳酸鈉含量的平均值分別為15.68%、15.17%、16.20%和15.53%，RSD分別為2.1%、2.2%、3.6%和2.6%。進一步證明各企業(yè)制劑中碳酸鈉含量批內(nèi)與批間差異較大，與硫酸頭孢匹羅與碳酸鈉混合工藝的工藝控制有關(guān)。通過對碳酸鈉含量和pH值之間的關(guān)系進行分析(表4)，可知碳酸鈉的含量直接影響本品的pH值，二者存在正相關(guān)性。

圖4 有關(guān)物質(zhì)Ⅱ色譜圖Fig.4 Chromatograms of related substances Ⅱ

表4 碳酸鈉含量與酸堿度的關(guān)系Tab.4 Relationship between content of sodium carbonate and pH value

3.2.4 制劑中水分的分析

結(jié)合熱重分析法，對樣品及其原料進行分析，從各企業(yè)的樣品和原料的熱重圖譜中可見，沒有明顯的吸放熱過程，說明硫酸頭孢匹羅原料中沒有結(jié)晶水存在。而從各企業(yè)制劑的熱重圖譜中可見，在30～120℃范圍內(nèi)樣品中的水緩慢失去，60℃時失重比率分布范圍為0.180%～0.493%，120℃時失重比率分布范圍為2.050%～2.300%，也充分說明120℃時樣品中所含的水分能充分揮發(fā)出來(圖5)。結(jié)合水活度測定結(jié)果，各企業(yè)樣品中游離水含量很少，說明各企業(yè)對水分控制效果比較理想，

分別對所有樣品采用60℃減壓3h和120℃干燥至恒重的方法測定其干燥失重值，120℃干燥至恒重所得干燥失重值略高于60℃減壓3h所得干燥失重值，檢驗數(shù)據(jù)顯示，120℃干燥方法能更充分地把樣品中的水分揮發(fā)出來，最大限度的體現(xiàn)樣品中含有水分的真實情況。

3.2.5 引濕性對樣品穩(wěn)定性影響的分析

原料藥的引濕性低于制劑，從而使得原料的有關(guān)物質(zhì)在引濕前后幾乎沒有明顯增加。由于制劑中含有一定量的碳酸鈉，導(dǎo)致制劑的引濕性明顯高于原料，引濕后制劑中的特定雜質(zhì)2,3-環(huán)戊烯并吡啶和總雜質(zhì)都明顯增加甚至超出限度(圖6)，說明注射用硫酸頭孢匹羅在潮濕的環(huán)境下不穩(wěn)定，易解離出2,3-環(huán)戊烯并吡啶和其他雜質(zhì)。

3.2.6 晶型與粒度分布結(jié)果分析

X-射線粉末衍射結(jié)果顯示，同一廠家不同批次的X-射線粉末衍射特征峰基本一致。企業(yè)A的特征峰與其他3家企業(yè)有明顯區(qū)別(圖7)，說明注射用硫酸頭孢匹羅存在不同的結(jié)晶狀態(tài)，可能有亞晶型存在或者混晶型情況。結(jié)合法定檢驗結(jié)果，企業(yè)A制劑的2,3-環(huán)戊烯并吡啶、總雜質(zhì)和聚合物含量明顯低于其他3家企業(yè)，表明該廠家的晶型具有一定優(yōu)勢。

不同企業(yè)由于所用原料和生產(chǎn)工藝不同，造成產(chǎn)品粒度分布不一致。企業(yè)A的不同批次樣品的粒度分布差別較大；來自不同抽樣地點的批號為170156的3批樣品粒度分布也不一致(圖8)，結(jié)合此3批樣品的pH值和碳酸鈉含量存在顯著差異的情況，提示該企業(yè)制劑生產(chǎn)過程中應(yīng)加強對原料和生產(chǎn)工藝的控制。

4 結(jié)論

通過對法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗及探索性研究試驗結(jié)果的比較分析，本品合格率為100%?；诂F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均為局頒標(biāo)準(zhǔn)，項目設(shè)置較全面，基本可以實現(xiàn)對本品的質(zhì)量控制。但存在質(zhì)控項目缺失、方法設(shè)置不合理、限度不統(tǒng)一等問題，建議進一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，修訂有關(guān)物質(zhì)Ⅰ和有關(guān)物質(zhì)Ⅱ檢查項并增加碳酸鈉檢查項。

圖5 熱重分析圖譜Fig.5 Pictures of thermogravimetric analysis

圖6 引濕前后的有關(guān)物質(zhì)色譜圖Fig.6 Chromatograms of related substances before and after hygroscopy

圖7 X-射線粉末衍射圖譜Fig.7 Pictures of X-ray powder diffraction

圖8 企業(yè)A制劑的粒度分布圖Fig.8 Particle size distribution map of preparation from manufacturer A

由于碳酸鈉的含量與本品的酸堿度、引濕性及穩(wěn)定性有密切的關(guān)系，且碳酸鈉和硫酸頭孢匹羅粒徑分布范圍不同，容易混合不均勻，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。提示生產(chǎn)企業(yè)進一步改進生產(chǎn)工藝，以保證產(chǎn)品的穩(wěn)定、安全和可靠。