GC-MS法測(cè)定鹽酸金霉素眼膏中16種多環(huán)芳烴含量

肖欽欽 劉緒平 段和祥 陳希 張銀花

(江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 330029)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的碳?xì)浠衔锏目偡Q，是重要的環(huán)境和食品污染物，具有很強(qiáng)的致畸、致癌和致突變性。PAHs可以通過呼吸或者直接的皮膚接觸使人體致癌。1979年美國(guó)環(huán)?？偸?EPA)列出的129種優(yōu)先監(jiān)控的污染物中有16種為PAHs，1982年EPA《城市和工業(yè)廢水的有機(jī)化學(xué)分析方法多環(huán)芳烴的測(cè)定》(METHOD 610)中引入16種PAHs的清單[1]。我國(guó)第一批68種優(yōu)先控制的污染物中也將7種多環(huán)芳烴列入其中[2]。歐洲議會(huì)和歐盟理事會(huì)發(fā)布的第2005/69/EC號(hào)指令及REACH法規(guī)附件X Ⅶ50均對(duì)用于輪胎生產(chǎn)的填充油中的苯并[a]芘及8種PAHs的總含量進(jìn)行了限量規(guī)定[3-4]。德國(guó)2011年11月29日修訂后的ZEK 01.4-08《GS認(rèn)證過程中PAHs的測(cè)試和驗(yàn)證》也對(duì)18種PAHs制定了具體限量指標(biāo)[5]。由于苯并[a]芘是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境化學(xué)致癌物，而且致癌性很強(qiáng)，故常以苯并[a]芘作為多環(huán)芳烴的代表，它占全部致癌性多環(huán)芳烴的1%～20%。

鹽酸金霉素眼膏處方中99.5%為輔料凡士林和液狀石蠟，它們均是從石油中得到的多種烴的半固體或液態(tài)混合物，易含有多環(huán)芳烴等雜質(zhì)。眼膏劑涂于眼睛患處，直接與人體皮膚黏膜長(zhǎng)時(shí)間接觸，多環(huán)芳烴類物質(zhì)超標(biāo)，將嚴(yán)重危害人類身體健康。本研究采用GC-MS法分析鹽酸金霉素眼膏中是否有污染PAHs的風(fēng)險(xiǎn)，通過對(duì)輔料中16種PAHs含量的測(cè)定及對(duì)制劑生產(chǎn)工藝的模擬，探討導(dǎo)致制劑中PAHs異常的原因，為該類劑型的安全性評(píng)估提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890B-7000C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Aglient公司)，Sartorius BS200S電子天平(Sartorius公司)，N-EVAP24氮吹儀(Organomation公司)，10mL具塞刻度試管。

1.2 試藥

鹽酸金霉素眼膏為2018年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品，共210批，涉及5個(gè)生產(chǎn)企業(yè)。輔料凡士林和液狀石蠟為其中4個(gè)制劑企業(yè)提供，各1批。

16種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)混合溶液：萘(nahpthalene,1001μg/mL)，苊烯(acenaphthylene, 1998μg/mL)，苊(acenaphthene, 995.9μg/mL)，芴(fluorene, 200.1μg/mL)，菲(phenanthrene, 100.2μg/mL)，蒽(anthracene,100.2μg/mL)，熒蒽(fluoranthene, 200.1μg/mL), 芘(pyrene, 99.84μg/mL)，苯并[a]蒽(benzo[a]anthracene,100.4μg/mL)，?(chrysene, 100.6μg/mL)，苯并[b]熒蒽(benzo[b]fluoranthene, 200.1μg/mL)，苯并[k]熒蒽(benzo[k]fluoranthene, 100.4μg/mL)，苯并[a]芘(benzo[a]pyrene, 100.7μg/mL)，茚并[1,2,3-cd]芘(indeno[1,2,3-cd]pyrene, 99.96μg/mL)，二苯并[a,h]蒽(dibenz [a,h]anthracene, 199.9μg/mL)，苯并[g,h,i]苝(benzo[g,h,i]perylene, 200μg/mL)，溶劑為甲醇:二氯甲烷=1:1；正己烷、乙腈均為色譜純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：移取16種PAHs標(biāo)準(zhǔn)混合溶液0.5mL置于100mL量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封，低溫避光保存。

供試品溶液：取鹽酸金霉素眼膏混勻，精密稱取混合均勻的試樣1.0g，置于10mL具塞刻度試管中，加正己烷6mL，振蕩搖勻使溶解，2000r/min離心5min后取上清液3mL至另一10mL具塞刻度試管中，加正己烷飽和的乙腈3mL，振蕩提取1min，收集乙腈層。再用正己烷飽和的乙腈按上述步驟提取2次，合并乙腈層，渦旋混勻，再氮吹至少于1mL，再加乙腈定容至1mL，即得(必要時(shí)可適當(dāng)稀釋)。

2.2 分析條件

2.2.1 氣相色譜條件

色譜柱DB-5MS毛細(xì)管柱(30m×0.25mm,0.25μm)；載氣：高純氦氣(純度大于99.999%)，柱流速：1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣體積：1.0μL，不分流進(jìn)樣；程序升溫：初始溫度：90℃，以20℃/min升溫至220℃，再以5℃/min升溫至320℃，保持2min，共計(jì)28.5min。

2.2.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：電子轟擊離子源(EI)；電離能量70eV；碰撞氣：高純氬氣(99.999%)；離子源溫度230℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度280℃；溶劑延遲時(shí)間3min；數(shù)據(jù)采集模式：選擇離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)。監(jiān)測(cè)離子信息詳見表1。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

表1 16種多環(huán)芳烴的保留時(shí)間與特征離子信息Tab.1 The informations of retention time and characteristic ions for the determination of PAHs

2.3.1 線性試驗(yàn)

分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、10.0、2.0和5.0mL，依次至100、100、100、100、100、100、100、10和10mL量瓶中，再加乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻，配成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液①～⑨。分別精密量取上述系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液①～⑨與混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液⑩各l.0μL，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析。以定量離子的峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明16種PAHs在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.993，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

2.3.2 檢出限和定量限

取上述混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液逐步稀釋后精密吸取各溶液1μL，注入GC-MS儀，記錄質(zhì)譜圖。各組分以在定量離子圖譜中信噪比滿足1:3為檢測(cè)限(LOD)，以在定量離子圖譜中信噪比滿足1:10為定量限(LOQ)，測(cè)得16種PAHs的檢出限和定量限如表2所示。

2.3.3 空白實(shí)驗(yàn)

用正己烷替代樣品，按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備試劑空白。精密量取試劑空白和標(biāo)準(zhǔn)混合溶液1μL注入GC-MS儀，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，記錄質(zhì)譜圖。標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的GC-MS圖譜見圖1，從GC-MS質(zhì)譜圖中各物質(zhì)的保留時(shí)間及定量、定性離子豐度比結(jié)果可以看出試劑空白溶液中含有少量菲和熒蒽(響應(yīng)為1725和490)，從線性回歸方程可以看出，兩種物質(zhì)的標(biāo)曲截距值(1944和1154)均大于試劑空白中上述成分的響應(yīng)值，即可以忽略試劑空白中上述兩種成分帶來(lái)的干擾。

表2 16種PAHs線性回歸方程、LOD和LOQTab.2 Linear regression equations, LODs and LOQs of PAHs

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液GC-MS圖譜Fig.1 Representative MRM chromatograms from the maxed reference standards solution of 16 PAHs

2.3.4 準(zhǔn)確度和重復(fù)性

取混合均勻的空白試樣1.0g兩份，分別置于10mL具塞刻度試管中，加正己烷6mL，振蕩搖勻使溶解，2000r/min離心5min后分別取上清液3mL至另兩支10mL具塞刻度試管中，分別加混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液⑤和⑦各1mL后，再加正己烷飽和的乙腈2mL，振蕩提取1min，收集乙腈層。再用正己烷飽和的乙腈按上述步驟提取2次，合并乙腈層，渦旋混勻后再氮吹至少于1mL，再補(bǔ)加乙腈至1mL，作為回收待測(cè)溶液“(1)”和“(2)”，各平行制備6份。

測(cè)得16種PAHs的平均回收率為72%～118%，回收率的RSD為0.5%～2.5%，表明本方法準(zhǔn)確度和重復(fù)性結(jié)果良好。

2.4 樣品測(cè)定

采用本研究建立的16種PAHs的GC-MS檢測(cè)方法，對(duì)210批鹽酸金霉素眼膏、4批凡士林和4批液狀石蠟進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果詳見表3～4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸金霉素眼膏中均未檢出苊烯、芴、苯并[k]熒蒽和二苯并[a,h]蒽這4種成分，而萘、菲、芘、苯并[g,h,i]苝4種成分檢出率較高，最高檢出率達(dá)85%。在檢出成分中，苊、蒽、熒蒽、苯并[a]蒽、?、苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘這7種成分檢出含量最高值均小于0.5mg/kg，總PAHs含量均小于10mg/kg。檢出率最高的成分為苯并[g,h,i]苝，其檢出含量最高值為5.7mg/kg，含量大于0.5mg/kg的樣本共40批次，涉及生產(chǎn)企業(yè)及批次分別為廠家A 36批次、廠家G 2批次、廠家D和F各1批次。

凡士林和液狀石蠟均檢出菲，液狀石蠟均未檢出苯并[g,h,i]苝，而凡士林均檢出，其中廠家A所提供的凡士林檢出苯并[g,h,i]苝含量最高，超出其他廠家3倍。

2.5 生產(chǎn)工藝模擬試驗(yàn)

鹽酸金霉素眼膏生產(chǎn)中，凡士林需在約160～170℃加熱120min進(jìn)行滅菌，由于多環(huán)芳烴類物質(zhì)在高溫條件下可能經(jīng)熱聚反應(yīng)產(chǎn)生，從而導(dǎo)致產(chǎn)品中苯并[g,h,i]苝含量異常偏高。針對(duì)這一可能性，本研究設(shè)計(jì)了凡士林滅菌模擬試驗(yàn)，即將制劑生產(chǎn)企業(yè)提供的凡士林置于160℃烘箱中分別加熱0、2和4h，檢測(cè)凡士林在加熱過程中是否會(huì)導(dǎo)致苯并[g,h,i]苝含量明顯升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2所示，凡士林經(jīng)160℃加熱2h后苯并[g,h,i]苝含量相對(duì)有所升高(最大上升26%)，但相對(duì)制劑中的苯并[g,h,i]苝含量，該變化并不明顯，說(shuō)明生產(chǎn)工藝并不是導(dǎo)致產(chǎn)品中苯并[g,h,i]苝含量異常偏高的主要原因。

3 討論

在德國(guó)2015年7月1日實(shí)施的GS產(chǎn)品認(rèn)證PAHs管控要求中，對(duì)第2類其他類產(chǎn)品中PAHs的限度規(guī)定，與皮膚長(zhǎng)時(shí)間接觸(超過30s)的材料其苯并[g,h,i]苝限值應(yīng)小于0.5mg/kg[6]。本研究發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)鹽酸金霉素眼膏中苯并[g,h,i]苝含量超過0.5mg/kg的樣品較多，超限率達(dá)18%，平均含量為3.8mg/kg，存在較大質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)部分企業(yè)生產(chǎn)的鹽酸金霉素眼膏中檢出苯并[g,h,i]苝含量異常偏高的情況，分析其原因可能主要為輔料質(zhì)量較差所致。鑒于從輔料凡士林中均檢出苯并[g,h,i]苝，其中來(lái)源于廠家A的黃凡士林檢出的苯并[g,h,i]苝含量遠(yuǎn)較其它廠家高；而在液狀石蠟中苯并[g,h,i]苝均未檢出，提示直接影響鹽酸金霉素眼膏質(zhì)量及安全性的關(guān)鍵因素是輔料凡士林的優(yōu)劣。此外，模擬試驗(yàn)證明，不恰當(dāng)?shù)纳a(chǎn)工藝可能導(dǎo)致制劑中苯并[g,h,i]苝含量增加，但不是異常偏高的主要原因。

表3 鹽酸金霉素眼膏多環(huán)芳烴含量測(cè)定結(jié)果Tab. 3 Results of the determination of PAHs in chlortetracycline hydrochloride eye ointment

表4 輔料多環(huán)芳烴含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of the determination of PAHs in excipients

圖2 凡士林中苯并[g,h,i]苝含量隨高溫加熱時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.2 Trends of the content of benzo[g,h,i]perylene in vaseline with the time of heating

鑒于多環(huán)芳烴類物質(zhì)存在致畸、致癌、致突變等3大主要危害，雖然目前國(guó)內(nèi)還未對(duì)藥品中多環(huán)芳烴的污染限量有相關(guān)的規(guī)定，對(duì)廣泛使用凡士林為輔料的眼膏劑、軟膏劑中的PAHs進(jìn)行限值規(guī)定，并進(jìn)行安全評(píng)估有重要的意義。