棗陽酸漿水中乳酸菌的可培養(yǎng)多樣性 及其分離方式評價

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(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽 441053; 2.棗陽市食品藥品監(jiān)督管理局,湖北襄陽 441299)

棗陽酸漿面是享譽湖北、聞名全國的小吃,其制作工藝入選湖北省非物質(zhì)文化遺產(chǎn),距今已有兩百多年歷史。棗陽酸漿面集酸、香、辣為一體,酸香可口、生津開胃,這與其原料酸漿水所起的作用密不可分。酸漿面的制作大致分為三步,制作酸漿水→制作臊子→制成面品。其中酸漿水的制作是使用燙芹菜或白菜與制面漿水進行發(fā)酵,每天用新鮮的面湯與老的酸漿水勾兌。在適宜的溫度條件下,芹菜、白菜等蔬菜與制面漿水經(jīng)過微生物的代謝作用,產(chǎn)生以乳酸為主的有機酸,形成了酸漿面的獨特酸味[1-2]。然而,由于受到溫度因素制約,酸漿面的制作一般只能在夏秋季節(jié)進行,不能實現(xiàn)全年制作。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是指發(fā)酵糖類的主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱,并不是某一個特定的系統(tǒng)分類單元[3]。LAB對發(fā)酵食品品質(zhì)具有多重作用:LAB產(chǎn)生的乳酸等有機酸能抑制有害菌的生長繁殖;LAB在食品發(fā)酵中通過酶的作用提高食品原料的營養(yǎng)價值,并合成酸、醇、酯類等多種芳香物質(zhì),對食品風(fēng)味形成起到作用[4-6];另外LAB能通過代謝合成一些對人體有益的代謝物,如共軛亞油酸、γ-氨基丁酸、胞外多糖等[7-8];LAB產(chǎn)生的細(xì)菌素如乳酸鏈球菌素,對一些有害菌的生長與代謝起到抑制作用,在食品保鮮中得到廣泛應(yīng)用[9]。我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品種類眾多,大多數(shù)含有種類豐富的LAB,其食用對人體具有一定的保健作用。目前對泡菜[10]、鲊廣椒[11]、米酒[12]、黃酒[13]、發(fā)酵香腸[14]等發(fā)酵食品中LAB的研究報道較多。湖北琚灣鎮(zhèn)酸漿面漿水中LAB相對微生物總量所占比例在90%以上[15]。但是目前對酸漿水中的微生物結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用的研究較少,考慮到LAB在酸漿水形成中的作用,對酸漿水中LAB的分離與鑒定及在酸漿水制作中的初步應(yīng)用研究就顯得尤為必要。

為此,本研究從湖北省棗陽地區(qū)采集正在發(fā)酵中的酸漿水樣品,采用變性梯度凝膠電泳(Denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)對酸漿水中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進行初步解析,以此為基礎(chǔ)使用多種培養(yǎng)方式對酸漿水中的LAB進行分離與鑒定,并對酸漿水中LAB分離的條件進行評價,以期能為酸漿水中LAB的分離提供方法指導(dǎo),并為酸漿面的產(chǎn)業(yè)化提供LAB菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸漿水樣品 采集自湖北省棗陽市(表1);甘油(分析純)、葡萄糖(分析純)、H2O2(分析純)、NaCl(分析純)、瓊脂糖(生化試劑) 上海國藥公司;MRS培養(yǎng)基、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星公司;Axygen PCR清潔試劑盒 康寧生命科學(xué)吳江有限公司;DL2000 Marker、PCR buffer、rTaq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T克隆載體 寶生物工程(大連)有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)top 10 實驗室保存;引物(表2) 由天一輝遠(yuǎn)(武漢)生物科技有限公司合成。

表1 酸漿水樣品采集信息Table 1 Sampling site of Suanjiangshui

表2 引物列表Table 2 Primers list

HR40-ⅡB2型生物安全柜 中國青島海爾;QYC-2102C全溫培養(yǎng)搖床 中國上海新苗;PTC-100 PCR儀 美國ABI公司;Fluor Chem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司;SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺 中國蘇州安泰;XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 中國浙江新豐;DG250厭氧工作站 英國Don Whitley公司;AG0025A 2.5 L厭氧罐、AN0025A 2.5 L厭氧袋 英國OXOID公司;變性梯度凝膠電泳儀 美國BioRad公司;BC-J160S CO2培養(yǎng)箱 中國上海博訊;土壤DNA提取試劑盒 美國OMIGA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸漿水樣品的DGGE分析 取5 mL酸漿水樣品轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中,1000 r/min離心10 min。收集酸漿水樣品中的含有菌體的懸濁物,然后使用土壤DNA提取試劑盒提取樣品總DNA。以總DNA為模板,以引物517R與341-GC-F(表2)進行PCR擴增,得到LAB的16S rRNA序列的V3區(qū)。將擴增產(chǎn)物使用PCR產(chǎn)物清潔試劑盒進行純化后,參照張振東等[19]的方法進行PCR-DGGE,變性梯度設(shè)置為30%～60%。電泳結(jié)束后,使用銀染法對聚丙烯酰胺膠進行染色,使用掃描儀掃描聚丙烯酰胺膠,并將特征條帶切下,裝入無菌的1.5 mL離心管中,加入100 μL無菌純水,4 ℃放置過夜后于8000 r/min離心5 min取上清液備用。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的測序 取1.2.1中含聚丙烯酰胺凝膠條帶的上清液為模板,使用引物341F與517R(表2)進行PCR擴增,使用PCR清潔試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化。然后使用pMD18-T試劑盒,將純化過的PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18-T上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的菌體涂布于含有氨芐青霉素鈉的LB平板上過夜培養(yǎng),挑取單菌落使用引物M13F(-47)與RV-M進行驗證,選取陽性克隆子送到南京金絲瑞生物科技公司測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行Blast比對,選取序列相似度≥99%的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 LAB的分離與計數(shù)

1.2.3.1 增菌法分離與計數(shù) 取采集到的酸漿水樣品,在超凈工作臺轉(zhuǎn)移1 mL樣品到含有15 mL無菌石蕊牛乳培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h,對LAB進行增殖培養(yǎng)[20]。取10-4、10-5、10-63個梯度的稀釋液涂布于含有1.5%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基,在DG250厭氧工作站 37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取具有透明圈的單菌落并劃線,反復(fù)純化3次。將純化后的菌株進行革蘭氏染色與過氧化氫酶實驗,初步確認(rèn)為LAB后,使用30%甘油保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3.2 非增菌法分離與計數(shù) 取酸漿水樣品,進行10×的梯度稀釋,取10-4、10-5、10-6梯度的稀釋液,涂布于含有碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基,每個稀釋度涂布5份。分別在下列五種條件下進行培養(yǎng):SJSA法含有5%的CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng);SJSB法厭氧工作站(10% H2,10% CO2,80% N2)培養(yǎng);SJSC法厭氧罐中培養(yǎng);SJSD法培養(yǎng)箱中好氧培養(yǎng);SJSE法厭氧工作站(15% CO2,85% N2)培養(yǎng)。37 ℃培養(yǎng)48 h后,對在5種條件下的各梯度的MRS平板上具有透明圈的菌落進行計數(shù),計算得到酸漿水中的LAB數(shù)量[21]。同時將所得單菌落按照1.2.3同樣的方法進行純化與保存。

1.2.4 LAB的鑒定 首先將純化后保存在冰箱中的LAB連續(xù)活化3次,在MRS液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)收集LAB菌體,然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取LAB基因組DNA[22],使用引物27F與1495R(表2)進行PCR擴增。獲得PCR產(chǎn)物后,按照1.2.2的方法建克隆測序。將測序結(jié)果在NCBI進行Blast,選取序列相似度≥99%的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)方差分析使用SPSS 18.0進行,圖使用Origin 8.5繪制,圖的處理使用Adobe Illustrator CS3完成,除了菌株的鑒定以外,樣品采集的重復(fù)數(shù)n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸漿面漿水中LAB群落結(jié)構(gòu)

對酸漿水樣品中的細(xì)菌群落進行了DGGE分析。由圖1可知,聚丙烯酰胺膠呈現(xiàn)出了豐富的條帶,表明酸漿面漿水中的細(xì)菌種類豐富。此外,樣品20#、31#、7#與12#聚集在一起,表明這4個樣品中的LAB群落結(jié)構(gòu)更為接近,然而它們在地域上并無聯(lián)系。為探明酸漿水中的細(xì)菌具體組成,從聚丙烯酰胺凝膠上選取特征性條帶進行了測序,并進行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果見圖2。

圖1 基于16S rRNA基因V3區(qū)的 酸漿水樣品細(xì)菌DGGE圖譜Fig.1 DGGE profiles of the Suanjiangshui samples based on V3 region of 16S rRNA gene

由圖2可知,DGGE凝膠中條帶R2與R9序列屬于德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii),條帶R3、R4、R6、R7、R8序列與發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)模式菌相似度最高,超過了99%,歸為發(fā)酵乳桿菌。條帶R1、R5序列與多個模式種序列相似度均超過99%,無法進行準(zhǔn)確的鑒定。R1是6個漿水樣品的共有條帶,表明它代表的LAB是酸漿面漿水樣品的共有菌群,而R5則在樣品32#中亮度最高,顯示它代表的LAB是該樣品的優(yōu)勢LAB,而在其他樣品中則含量較低,并非其他樣品的優(yōu)勢菌株。聚丙烯酰胺凝膠條帶經(jīng)過測序,并未獲得LAB之外的細(xì)菌序列,由此可知,酸漿水中的細(xì)菌主要由LAB組成,且以乳桿菌屬(Lactobacillus)的德式乳桿菌及發(fā)酵乳桿菌為主。

圖2 基于16S rRNA基因V3區(qū)的酸漿面漿水LAB系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic tree of LAB from Suanjiangshui based on V3 rigeon of 16S rRNA gene

周書楠等[15]使用高通量測序手段,對湖北省棗陽市酸漿面漿水中的細(xì)菌多樣性進行了解析,乳桿菌屬(Lactobacillus)LAB是酸漿水中的優(yōu)勢細(xì)菌微生物,其相對含量高達99.72%,同時基于樣品的核心操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)系統(tǒng)發(fā)育分析表明,

在種的水平上乳桿菌屬LAB進一步可分為德氏乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、嗜淀粉乳桿菌等LAB。此外,張曉輝等[23]研究發(fā)現(xiàn)陜西省西安與天水的漿水中LAB同樣以乳桿菌屬為主,相對含量占70%以上,另外還含有鏈球菌屬、克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬等共有菌屬。通過PCR-DGGE法對酸漿水中LAB的解析中,由于條帶R1序列與多個LAB模式種的相似度均較高,而通過與周等[15]的研究結(jié)果相比較,R1條帶很有可能代表了嗜淀粉乳桿菌。

2.2 酸漿水中LAB計數(shù)

使用MRS培養(yǎng)基通過平板計數(shù)法對采集到的六個漿水樣品中的LAB進行了計數(shù)。結(jié)果見圖3,樣品間酸漿水中LAB的數(shù)量差異較大,同時從市區(qū)采集到的12#、20#與32#樣品中LAB數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他來源的兩個樣品,其中樣品12#與20#的LAB含量最高,能達到1.7×108～2.5×108cfu/mL,而7#、31#和34#樣品分別來自棗陽市琚灣鎮(zhèn)、吳店鎮(zhèn)與七方鎮(zhèn),樣品中的LAB數(shù)量較低,其中樣品31#的LAB數(shù)量僅為5.2×106cfu/mL,

圖3 酸漿水中的LAB濃度Fig.3 The concentration of LAB of Suanjiangshui注:A:含有5%的CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng);B:厭氧工作站 (10% H2,10%CO2,80%N2)培養(yǎng);C:厭氧罐中培養(yǎng); D;培養(yǎng)箱中好氧培養(yǎng);E:厭氧工作站 (15% CO2,85% N2)培養(yǎng),表3同。

最高與最低之間相差高達2個數(shù)量級。另外,通過非增菌法的五種方式對酸漿水中LAB進行富集培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)在好氧培養(yǎng)條件對LAB的分離效果最差。

2.3 酸漿水中LAB的鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)特征,對具有透明圈、過氧化氫酶陰性的菌株進行純化(圖4),通過16S rRNA基因序列分析,共獲得90株LAB,基于菌株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析(圖5),這些均屬于乳桿菌屬,分為6個種,分別是:德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)與玉米乳桿菌(Lactobacilluszeae)。總體上來說,通過可培養(yǎng)法(增菌法與非增菌法)分離得到的90株菌中,屬于發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌的菌株數(shù)量最多,分別為40、22、14株,分別占總分離菌株的48.89%、24.44%、15.56%;德式乳桿菌、鼠李糖乳桿菌與玉米乳桿菌較少,分別為7、6、1株,僅占總分離菌株為7.78%、6.67%、1.11%。

表3 LAB分離結(jié)果Table 3 The results of isolation of LAB

圖4 部分LAB菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of part lactic acid bacteria注：A～B:增菌法分離得到;C～F：非增菌法分離得到。

圖5 不同方式分離的LAB系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of LAB isolated by different methods注:SJSA 5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng);SJSB厭氧工作站(10% H2,10% CO2,80% N2)培養(yǎng);SJSC厭氧罐培養(yǎng); SJSD培養(yǎng)箱中好氧培養(yǎng);SJSE厭氧工作站(15%CO2,85%N2)培養(yǎng);SJS增菌法,具體見實驗方法1.2.3。

研究表明,通過可培養(yǎng)法與DGGE得到結(jié)果并不一致。DGGE結(jié)果顯示,德式乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌是酸漿面漿水中的優(yōu)勢菌。然而通過可培養(yǎng)法(增菌法與非增菌法)僅得到了7株德式乳桿菌,占總分離菌株的7.78%,并未分離到嗜淀粉乳桿菌,因此二者結(jié)果并不一致,且未分離得到條帶R1代表的LAB。另外,通過可培養(yǎng)法分離到的鼠李糖乳桿菌與玉米乳桿菌并未在DGGE條帶中出現(xiàn),顯示可培養(yǎng)法由于培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件原因,可以對一些菌具有富集作用,從而能對食品環(huán)境中的非優(yōu)勢菌進行分離。

孟憲剛等[24]從陜西省的漿水中獲得的細(xì)菌有乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)等5個屬。與陜西來源的漿水相比,琚灣來源的酸漿水中LAB種類明顯較少,這可能與酸漿水的制作工藝有關(guān)。棗陽地區(qū)酸漿水的制作,會在每天早上加入開水,能殺死所富集的部分細(xì)菌,導(dǎo)致酸漿水中細(xì)菌種類的減少,而酸漿水中的發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌與干酪乳桿菌較為適應(yīng)酸漿水的環(huán)境,且耐較低的pH環(huán)境,能夠快速生長占據(jù)群落的優(yōu)勢。

目前已報道的用于厭氧或兼性厭氧的細(xì)菌分離條件有多種:在厭氧工作站中在3種混合氣體[25-26]或者2種混合氣體[27]的厭氧條件下培養(yǎng),在厭氧罐中使用厭氧產(chǎn)氣袋造成的厭氧條件下培養(yǎng)[28],也有在含有5%的CO2培養(yǎng)箱中對LAB進行培養(yǎng)[29-30]。本研究中的6種培養(yǎng)方式對發(fā)酵乳桿菌與植物乳桿菌均具有較好的分離效果;SJSB、SJSC、SJSD、SJSE培養(yǎng)方案與增菌法都能分離得到德式乳桿菌,SJSB與富集法的分離效果最好;SJSA、SJSB、SJSC、SJSE與增菌法均分離到了酸漿水中的干酪乳桿菌,而SJSB與SJSE的分離效果最好;SJSA、SJSB、SJSC與增菌法菌對鼠李糖乳桿菌的分離效果相近;對于玉米乳桿菌,僅通過SJSC法獲得了該菌。

3 結(jié)論

通過DGGE法對棗陽酸漿水中的微生物多樣性進行了研究,酸漿水中細(xì)菌主要有乳桿菌屬乳酸菌,有德式乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌與嗜淀粉乳桿菌等。通過6種不同培養(yǎng)方式,從酸漿面漿水中分離得到了90株LAB,經(jīng)過鑒定,它們分別屬于德氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌,干酪乳桿菌,植物乳桿菌、,鼠李糖乳桿菌、玉米乳桿菌及嗜淀粉乳桿菌,其中分離到的植物乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌所占比例最大。

綜合來看,增菌法、厭氧工作站(10% H2,10% CO2,80% N2)法、厭氧罐分離法具有較好的分離效果,而5%的CO2條件與好氧培養(yǎng)則效果較差。本研究中使用石蕊牛乳增菌法,共獲得12株LAB。16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析表明,該法對酸漿水中的發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、德式乳桿菌、鼠李糖乳桿菌均具有較好的富集效果。鑒于可培養(yǎng)方法對培養(yǎng)基的依賴性,后續(xù)可對培養(yǎng)基進行改進,以獲得酸漿水中被DGGE法檢測到卻在本實驗中未分離到的LAB,以豐富應(yīng)用于食品的LAB資源。