滇黃精腐皮鐮刀菌的分離鑒定

楊林毅 陳澤歷 賴清玉

摘要：采用組織分離法對滇黃精（Polygonatum kingianum）病害樣品進(jìn)行病原菌分離，進(jìn)一步通過柯赫氏法則進(jìn)行驗(yàn)證并通過形態(tài)學(xué)觀察和ITS 序列分析方法鑒定該病原菌。結(jié)果表明，病原菌菌株的菌絲為白色，背面淡黃色，菌絲體呈絮狀、貼基生長、生長茂盛；病原菌菌株的分生孢子有兩種形態(tài)，大型分生孢子呈鐮刀形或柱形，小型分生孢子呈卵形或腎形；從菌株的形態(tài)學(xué)、致病性測定和ITS序列分析初步鑒定該菌為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。

關(guān)鍵詞：滇黃精（Polygonatum kingianum）；腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）；分離鑒定

中圖分類號：R931 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）03-0065-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.03.018 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： A pathogen from Polygonatum kingianum was isolated by pathogen isolation method， and identification of the pathogen was carried out by Koch's rule， morphological observation and ITS sequence analysis. The results show that the single colony mycelium of the pathogenic strain is white， the back is light yellow， and the mycelium is flocculent and flourishes. The conidia of the pathogenic strain have two forms， the large conidia are sickle-shaped or columnar， and the small conidia are oval or kidney-shaped. The pathogen was identified as Fusarium solani from the morphological， pathogenicity and ITS sequence analysis of the strains.

Key words： Polygonatum kingianum； Fusarium solani； isolation and identification

滇黃精（Polygonatum kingianum）又稱節(jié)節(jié)高、仙人飯，植物界被子植物門單子葉植物綱百合目百合科黃精屬草本植物，《中華人民共和國藥典》[1]確定百合科（Liliaceae）多年生草本植物黃精（Polygouatum sibiricum）、多花黃精（P. cyrtouema）和滇黃精（P. kiugiauum.）為中藥黃精的基原品種。滇黃精作為中藥黃精的3個(gè)基源品種之一，以塊大、色黃、潤澤、斷而透明的品質(zhì)著稱，主要分布在以云南省為中心的西南地區(qū)[2]。其根狀莖味甘、性平，有補(bǔ)脾潤肺、益氣養(yǎng)陰的功能，主要用于治療體虛乏力、心悸氣短、肺燥干咳、糖尿病等[3，4]。滇黃精的主要病害有葉斑病、黑斑病、炭疽病、枯萎病、軟腐病、青綠霉病、灰霉病、根腐病等[5-8]。目前在滇黃精研究方面多見有關(guān)化學(xué)成分的研究，而在病害方面很少有研究報(bào)道。為深入了解滇黃精病害的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和特點(diǎn)，為病害的有效防治提供較全面的依據(jù)，也為大面積推廣滇黃精藥材的種植，本研究就云南省曲靖市滇黃精的真菌病害和病原菌進(jìn)行了分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病滇黃精植株采自云南省曲靖市，放于低溫保鮮盒，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原物分離。PDA培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[9]。

1.2 方法

1.2.1 真菌病原物分離 在實(shí)驗(yàn)室采用組織分離法[9]進(jìn)行病原菌的分離純化：將新鮮的發(fā)病莖稈和塊莖用自來水沖洗干凈，用無菌手術(shù)刀將發(fā)病莖稈切成0.5 cm長的小段、將葉片切成0.5 cm×0.5 cm小塊，在75%乙醇中浸泡40 s，隨后在1% NaClO溶液中表面殺菌4 min，再在75%乙醇中漂洗30 s（去除殘余NaClO），最后用無菌蒸餾水沖洗多次并用無菌濾紙吸干水分，移植于PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基中預(yù)先加入氨芐青霉素（AMP）（100 mg/mL）以防止細(xì)菌的污染。培養(yǎng)4～5 d后，將從組織塊邊緣長出的菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化。

1.2.2 病原物形態(tài)學(xué)觀察 將純化的病原物接種在PDA或馬丁氏培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)和顏色，然后挑取菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀察并照相記錄菌絲結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)特征[10]。

1.2.3 病原物的分子鑒定 分別刮取在PDA上培養(yǎng)7 d的病原菌菌絲，采用CTAB法提取DNA。

提取DNA之前要先保存菌種（平板保存1份，斜面2份），保存之前拍照。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因擴(kuò)增采用通用引物ITS1和ITS4。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為2×power Taq PCR masterMix 12.5 μL、ITS1（10 μmol/L）1μL、ITS4（10 μmol/L）1 μL、DNA模板（10 ng/μL）5.5 μL、ddH2O 5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性40 S，55 ℃退火40 S，72 ℃延伸1 min，29次循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min；4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后送鉑尚生物技術(shù)（昆明）有限公司測序，將得到的序列在GenBank中進(jìn)行對比，通過同源性分析對病原菌進(jìn)行分子水平鑒定。

1.2.4 致病性測定

1）菌餅的制備。將純化保存的菌株分別接種于PDA平板培養(yǎng)基中央，7 d后用滅菌的打孔器打取菌落邊緣生長旺盛的部分獲得菌餅待用。

2）菌餅離體接種。選取新鮮健康、大小基本一致的滇黃精塊莖分成2組。用無菌束針刺傷，對其造成微傷口，2組均用75%乙醇輕輕擦拭對塊莖進(jìn)行殺菌。將上述菌株制備的菌餅分別貼在塊莖接種部位，用潮濕且無菌脫脂棉包裹，同時(shí)打取不含菌的培養(yǎng)基作為對照。每隔2 d觀察塊莖的發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇黃精病害癥狀

染病初期，塊莖上出現(xiàn)不規(guī)則黑色病斑，中期隨著病斑的繼續(xù)發(fā)展，擴(kuò)大逐漸連成一片。后期較為嚴(yán)重，整片病斑可使塊莖失去水分和養(yǎng)分成為焦炭狀，導(dǎo)致整個(gè)塊莖腐爛，莖稈枯萎。如圖1所示。

2.2 病原物的培養(yǎng)性狀

分離、純化得到的一株病原菌菌株在PDA培養(yǎng)基上表現(xiàn)為菌落正面白色，背面白色略帶淡黃色，邊緣不規(guī)則。如圖2所示。

2.3 致病性測定

利用上述菌餅進(jìn)行致病性測定，結(jié)果顯示在28 ℃培養(yǎng)7 d后，接種菌塊的滇黃精染病，癥狀與采集的病樣相同，而空白沒有染病。再次利用組織分離法從接種發(fā)病的塊莖上分離該菌，于PDA培養(yǎng)基純化獲得真菌菌株，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果表明與接種之前的菌株性狀相同，如圖3所示。

2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d左右，病原菌菌株的單菌落菌絲為白色，背面淡黃色，菌絲體呈絮狀、貼基生長、生長茂盛。病原菌菌株的分生孢子有兩種形態(tài)，大型分生孢子呈鐮刀形或柱形，小型分生孢子呈卵形或腎形（圖4）。根據(jù)文獻(xiàn)[10-14]及病原菌孢子形態(tài)，將分離得到的病原菌初步鑒定為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。

2.5 菌株的分子鑒定

病原菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示序列大約為500 bp。對該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序得到的序列在NCBI Blast上進(jìn)行比對，病原菌ITS序列比對得到片段大小為344 bp，并在NCBI Blast下載與該序列同源性最為接近的5條序列（表1），進(jìn)一步結(jié)合MEGA7.0分子軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹顯示該序列與腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）同源性最高。相似度高達(dá)99%（圖5），因此將該病原菌鑒定為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

針對云南省曲靖滇黃精病害的發(fā)生現(xiàn)狀，采用組織分離法對病害病原菌進(jìn)行分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定及致病性測定，初步確定該病害為半知菌類從梗孢目（Moniliales）瘤座孢科（Tuberculariaceae）鐮刀菌屬（Fusarium）的腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。本研究首次在滇黃精塊莖上發(fā)現(xiàn)致病菌為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani），可為滇黃精病害防治提供較好的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

3.2 討論

近年來，隨著市場需求量的增加，人們對滇黃精研究的不斷深入，滇黃精的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，人工栽培滇黃精已成為市場供應(yīng)的主體。但是，人工栽植面積的不斷擴(kuò)大加重了病蟲的危害，嚴(yán)重影響滇黃精的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前為止，關(guān)于黃精病蟲害的研究報(bào)道有楊子龍等[15]2002年報(bào)道的根腐??；劉殿輝等[16]2004年報(bào)道的葉斑病、黑斑病、菌核病；宋東平等[17]2004年報(bào)道的灰霉?。贿@些報(bào)道只是簡單介紹了病害，都未對其致病病原菌做系統(tǒng)規(guī)范的報(bào)道。田啟建等[6]2008年對貴州省黃精病害種類的研究結(jié)果表明，黃精苗期基本沒有病害發(fā)生，其他生長期發(fā)生的病害有葉斑病、黑斑病、炭疽病、枯萎病、軟腐病、青綠霉病、灰霉病等。葉斑病、黑斑病、炭疽病主要為害葉片造成斑點(diǎn)甚至枯死，黑斑病、炭疽病還為害果實(shí)，軟腐病主要為害莖部。選育并種植抗病品種、加強(qiáng)水培管理、加強(qiáng)田間通風(fēng)透光，及時(shí)清除枯枝病葉以及合理輪作等農(nóng)業(yè)防治措施有助于減輕病害[15]。

鐮刀菌屬的生命力很強(qiáng)，在水、土壤、空氣中均有分布。在空氣中以分生孢子的形態(tài)存活，在土壤中長期存活的特性是其導(dǎo)致植物根腐病發(fā)病的主要原因之一。植物發(fā)病部位產(chǎn)生的分生孢子成為侵染源的一部分，借助雨水、空氣進(jìn)一步傳播，危害植物。因此，作物的栽培管理制度對因鐮刀菌導(dǎo)致的病害發(fā)生有著很大的影響。土質(zhì)黏重、排水不良、多年連作容易導(dǎo)致病害的發(fā)生和流行。

滇黃精上的病害受各種因素的影響，所以發(fā)病情況也不一樣。本試驗(yàn)采用組織分離法與單菌絲頂端挑取法對玉溪地區(qū)滇黃精真菌病害的病原菌進(jìn)行了分離、純化和鑒定，明確了生物學(xué)防治的對象，為病害防治提供了一定的理論依據(jù)。

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