新型免疫增強(qiáng)劑CpG ODN的研究進(jìn)展

徐 寧，杜 銳，李健明，時(shí) 坤，宮慶龍，孫志博，郜艷雪，欒美慧，冷 雪*，周 宇

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130118；2.惠州海關(guān)，廣東惠州 516006)

由于近年來(lái)CpG ODN在某些感染性疾病、過(guò)敏性疾病和腫瘤等的防治中顯現(xiàn)出的良好效果，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始致力于對(duì)其的研究。近幾年國(guó)外對(duì)于CpG ODN在感染性疾病及腫瘤中的佐劑作用的研究已進(jìn)入Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗(yàn)階段，并已證實(shí)其作為新型免疫佐劑與常規(guī)佐劑相比具有高效、低毒的優(yōu)勢(shì)。筆者主要通過(guò)查閱近年來(lái)與CpG ODN的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制、作為免疫增強(qiáng)劑的作用以及安全性研究相關(guān)的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為CpG ODN作為新型佐劑的研究和應(yīng)用提供參考。

1 CpG ODN的分類和結(jié)構(gòu)

CpG ODN是一類含有胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸鏈，呈單鏈DNA形式，含有1個(gè)或多個(gè)非甲基化的CpG基序，由于具有良好的促進(jìn)免疫應(yīng)答的效果而常在臨床研究中被用作免疫增強(qiáng)劑?；贑pG ODN結(jié)構(gòu)上的不同及其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)性質(zhì)的差異，在人體中已經(jīng)鑒定出3類不同的CpG ODN，盡管每類CpG ODN都包含至少一個(gè)由中央未甲基化CG二核苷酸加上結(jié)合區(qū)域組成的基序，但它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和免疫學(xué)活性方面卻不盡相同。B型ODN通常在硫代磷酸酯骨架內(nèi)包含有1～5個(gè)CpG基序，這種骨架增強(qiáng)了其對(duì)核酸酶消化的抵抗力，并且顯著延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期(30～60 min，而磷酸二酯為5～10 min)，B型ODN具有誘導(dǎo)pDC分化的能力，在產(chǎn)生TNF-α的同時(shí)也刺激B細(xì)胞增殖和分泌IgM，是B細(xì)胞的強(qiáng)活化劑，但是在誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生和激活NK細(xì)胞方面的能力較弱[1-2]。與B型CpG ODN不同的是，A型CpG ODN可誘導(dǎo)高水平的IFN-α產(chǎn)生，并且引起明顯的NK細(xì)胞活化。A型CpG ODN具有兩側(cè)被硫代磷酸酯末端核苷酸修飾的磷酸二酯核，因其兩側(cè)攜帶的單個(gè)CpG基序呈回文結(jié)構(gòu)，所以能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。B型CpG ODN與A型CpG ODN的活性不同很大程度上是因?yàn)槎叩腃pG /TLR9復(fù)合物在pDC核內(nèi)體的保留時(shí)間不同，B型ODN可通過(guò)早期核內(nèi)體快速轉(zhuǎn)運(yùn)至晚期核內(nèi)體，但A型ODN卻可在早期核內(nèi)體中保留較長(zhǎng)時(shí)間[3-4]。A型ODN與MyD88/IRF-7復(fù)合物在早期核內(nèi)體中相互作用，觸發(fā)能夠誘導(dǎo)干擾素(IFN)產(chǎn)生的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4]。由于 poly-G尾部之間的相互作用，A 型ODN在溶液中更傾向于形成復(fù)雜的多聚體，但是A型ODN這一特性卻成為其應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的障礙，近年來(lái)為了解決這個(gè)問(wèn)題，通常把A型ODN包裝成穩(wěn)定的病毒樣顆粒(VLP)，以便它在臨床研究中能充分發(fā)揮其佐劑作用[5-6]。C型ODN在完全由硫代磷酸核苷酸組成方面與B型ODN類似，在含有可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或二聚體的回文CpG基序方面與A型ODN類似，這類ODN在刺激B細(xì)胞分泌IL-6的同時(shí)也刺激pDC產(chǎn)生IFN，由于在早期和晚期核內(nèi)體中均有活性，所以C型ODN可以表達(dá)B型和A型ODN所共有的特性[7-8]。C型ODN具有中等免疫效應(yīng)以及獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，在體內(nèi)具備良好的穩(wěn)定性。由于含有雙重回文序列，所以C型 CpG ODN在其富含GC的3′末端可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，又由于存在5′回文序列而可以進(jìn)行串聯(lián)，這些高度有序的結(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)任何類型的CpG ODN產(chǎn)生I型IFN[9]。每種ODN具體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、功能等如表1所示。

2 CpG ODN的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是免疫調(diào)節(jié)中一種非常重要的蛋白質(zhì)分子，作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)型抗原識(shí)別受體，既可以參與固有免疫，又可以識(shí)別適應(yīng)性免疫和固有免疫之間的關(guān)系，為開(kāi)發(fā)新型疫苗佐劑或免疫增強(qiáng)劑奠定基礎(chǔ)[10]。

表1 CpG ODN的分類及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

TLR9是TLRs家族成員之一，主要識(shí)別細(xì)菌DNA的CpG基序。CpG寡脫氧核苷酸(CpG ODN)是人工合成的含有非甲基化的CpG的ODN，能以TLR9依賴的方式刺激機(jī)體固有免疫應(yīng)答，通常用于TLR9的研究[11]。病毒和細(xì)菌基因組中的CpG-DNA是TLR9的天然激動(dòng)劑，所以一旦細(xì)胞感染或攝取細(xì)菌，TLR9就會(huì)啟動(dòng)Th1型優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答[12-13]。TLR9分子在不同物種之間存在差異，人體與小鼠中TLR9的結(jié)構(gòu)相差24%[14]；在細(xì)胞類型表達(dá)方面，物種之間也存在差異：例如，TLR9受體存在于嚙齒動(dòng)物中，但不存在于原始巨噬細(xì)胞和髓樣樹(shù)突細(xì)胞(mDC)中。在人體中，TLR9主要由漿細(xì)胞樣CD(pDC)和B細(xì)胞表達(dá)，暴露于TLR9激動(dòng)劑中的B淋巴細(xì)胞更容易被Ag激活以反映它們作為免疫增強(qiáng)劑的效用，而TLR9刺激pDC產(chǎn)生I型干擾素，從而更有效地將Ag呈遞給T細(xì)胞[15-17]。

CpG ODN不僅能夠刺激表達(dá)TLR9分子的細(xì)胞，引發(fā)免疫調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終產(chǎn)生Th1和促炎細(xì)胞因子和趨化因子，還能改善樹(shù)突細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能，誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖，刺激NK細(xì)胞的免疫保護(hù)活性，誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)更傾向于Th1型[18]，CpG ODN對(duì)不同宿主免疫環(huán)境具有不同的作用是它們作為高效免疫增強(qiáng)劑的價(jià)值基礎(chǔ)。

3 CpG ODN作為免疫增強(qiáng)劑的作用

3.1CpGODN在預(yù)防和治療感染中的作用CpG ODN主要是通過(guò)誘導(dǎo)體液免疫以預(yù)防感染的，即通過(guò)抗體中和作用或調(diào)理作用阻止病原體感染宿主細(xì)胞。CpG ODN通過(guò)激活TLR9信號(hào)，可以與B細(xì)胞抗原受體信號(hào)協(xié)同促進(jìn)初始B細(xì)胞、已誘發(fā)B細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞的激活，并進(jìn)一步分化為分泌抗體分子的漿細(xì)胞[19]。一般來(lái)說(shuō)，由于初始B細(xì)胞不具備表達(dá)TLR9的能力，所以其對(duì)于CpG ODN的激活作用并無(wú)響應(yīng)，因此必須事先用抗原刺激初始B細(xì)胞以確保其被CpG ODN激活后可分化成漿細(xì)胞[20-22]。此外，IL-6是一種能夠促進(jìn)抗原特異性B細(xì)胞增殖及活化的細(xì)胞因子，由CpG ODN刺激的抗原特異性B細(xì)胞可分泌IL-6[23]。

3.2CpGODN在預(yù)防和治療過(guò)敏中的作用在房塵螨和豚草誘發(fā)的變態(tài)反應(yīng)中，pDCs捕獲過(guò)敏原后會(huì)分泌IL-4和IL-5等Th2型細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子是通過(guò)誘導(dǎo)漿細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)敏原特異性IgE而得到的[24-25]。過(guò)敏原特異性 IgE首先與肥大細(xì)胞上的IgE受體結(jié)合，然后當(dāng)受體上的IgE與過(guò)敏原結(jié)合時(shí)，顆粒就會(huì)從肥大細(xì)胞中釋放出來(lái)，從而引發(fā)流鼻涕和打噴嚏等過(guò)敏癥狀，持續(xù)暴露于過(guò)敏原會(huì)導(dǎo)致以肺嗜酸性粒細(xì)胞增多和氣道阻塞為特征的肺部炎癥[26]。過(guò)敏免疫療法是一種通過(guò)過(guò)敏原疫苗誘導(dǎo)Th1免疫并抑制Th2免疫的治療性技術(shù)。

CpG ODN既可以刺激pDC和B細(xì)胞，又可以誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞的分化，由Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ在降低Th2偏向反應(yīng)的同時(shí)也會(huì)抑制IgE的分泌[27]。

3.3CpGODN在癌癥免疫治療中的作用CpG ODN由于具有激活獲得性免疫應(yīng)答和先天性免疫應(yīng)答的能力，所以可在腫瘤治療方面發(fā)揮巨大潛力且作為高效的腫瘤治療劑而存在，CpG ODN不僅能夠促進(jìn)Thl、促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及APC的成熟和活化，還能增強(qiáng)多肽類腫瘤疫苗的免疫原性。它誘導(dǎo)的細(xì)胞因子微環(huán)境能促進(jìn)輔助性T細(xì)胞應(yīng)答，這些特性使其可在臨床研究中用作抗腫瘤的免疫增強(qiáng)劑[28]。Zhang等[29]研究表明，無(wú)論是在體外試驗(yàn)還是在動(dòng)物試驗(yàn)中，CpG ODN均可通過(guò)多種途徑進(jìn)入不同組織并且產(chǎn)生積聚效應(yīng)，從而在腫瘤組織中達(dá)到最高濃度，在MCF-7 荷瘤動(dòng)物模型中，低劑量的CpG ODN即可抑制腫瘤生長(zhǎng)達(dá) 40%，而作為免疫調(diào)節(jié)劑與抗腫瘤抗體藥物赫賽汀聯(lián)用，可抑制超過(guò)96%的腫瘤生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，CpG ODN或許可作為一種獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于肺癌抗腫瘤治療[30]。一般來(lái)說(shuō)，CpG ODN獨(dú)立用于癌癥治療雖然是相對(duì)安全的，但其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度并不足以消除腫瘤，所以目前有許多評(píng)估CpG ODN與其他免疫增強(qiáng)劑組合的免疫效果的研究正在進(jìn)行。王凱玲等[31]為研究CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)對(duì)肺癌A549細(xì)胞化療的影響，將肺癌A549細(xì)胞分為空白對(duì)照組、DDP組、CpG-ODN組、DDP + CpG-ODN組、CpG-ODN + DDP 組，采用CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CpG-ODN與DDP聯(lián)用具有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，從而提高順鉑化療敏感性的能力。

4 安全性

CpG ODN在發(fā)揮高效免疫作用的同時(shí)，也會(huì)引發(fā)一些安全問(wèn)題，比如CpG ODN會(huì)增強(qiáng)疫苗接種部位自身免疫蛋白的免疫原性從而引發(fā)自身免疫??；或者刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生使宿主對(duì)其他有害物質(zhì)的易感性增強(qiáng)。

研究表明，大多數(shù)細(xì)菌DNA可以在正常小鼠體內(nèi)引發(fā)抗雙鏈DNA自身抗體的產(chǎn)生，并加速狼瘡易發(fā)動(dòng)物的自身免疫性疾病的發(fā)展，這些研究使CpG DNA促進(jìn)自身免疫性疾病發(fā)展的特性得到了證實(shí)[32]。CpG DNA還能刺激IL-6的產(chǎn)生并阻斷活化淋巴細(xì)胞的凋亡，通過(guò)促進(jìn)自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞的持久性，使自身免疫性疾病的發(fā)生提前[33]。

目前存在很多評(píng)估CpG ODN在人體中的安全性和活性的臨床研究?，F(xiàn)有的結(jié)果表明，這些藥劑是相對(duì)安全的，在某些情況下可以提高聯(lián)合接種疫苗的免疫原性。臨床研究想要達(dá)到的預(yù)期結(jié)果主要包括：鑒定在與特定疫苗共同施用時(shí)哪類ODN具有最佳活性，監(jiān)測(cè)CpG ODN的長(zhǎng)期安全性。期望進(jìn)一步提高基于CpG的疫苗用于誘導(dǎo)針對(duì)感染性病原體的保護(hù)性免疫的效應(yīng)。

5 展望

綜上所述，CpG ODN能夠靶向活化TLR9，具有強(qiáng)大的免疫刺激作用和促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答的特點(diǎn)，在作為免疫增強(qiáng)劑方面顯示出來(lái)較好的應(yīng)用前景。CpG ODN在人用乙型肝炎疫苗中已經(jīng)通過(guò)了Ⅲ期臨床研究。在動(dòng)物疫苗如豬瘟疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗和犬細(xì)小病毒等疫苗中均具有較好的免疫增強(qiáng)作用。目前，CpG ODN的研究仍存在一些不足，如安全劑量和最佳給藥途徑等尚未明確，相信隨著CpG ODN研究的不斷深入，CpG ODN很可能作為一種在臨床上廣泛使用的免疫增強(qiáng)劑在人類和動(dòng)物疾病的防控中發(fā)揮重要作用。