王程,耿澤男,紀(jì)朋艷,李慶華,羅軍,李妍,隋春紅
吉林醫(yī)藥學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132013
基因工程制備的重組胰島素是糖尿病藥物治療領(lǐng)域的一個(gè)里程碑,應(yīng)用于臨床已逾30載,具有純度高、不良反應(yīng)少、用量少等優(yōu)點(diǎn)[1]。胰島素必須以單體分子形式與受體結(jié)合才能發(fā)揮生物活性,然而在重組胰島素的臨床應(yīng)用過(guò)程中,較高的血藥濃度會(huì)促進(jìn)胰島素分子發(fā)生自身締合而形成多聚體,需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間解聚才發(fā)揮作用[2]。因此通過(guò)分子改造,設(shè)計(jì)出在血液中以單體形式存在的速效胰島素成為研究的重要方向之一[3]。目前用于臨床控制餐后血糖波動(dòng)的速效胰島素主要有賴脯胰島素 (Lispro)、門冬胰島素 (Aspart)和賴谷胰島素 (Glulisine),其結(jié)構(gòu)改造均發(fā)生在胰島素B鏈羧基末端,通過(guò)在聚體形成面引入相同電荷、調(diào)整分子間疏水性、改變與金屬離子的結(jié)合力等方式使胰島素單體難以聚合[4]。2016年,美國(guó)和澳大利亞的研究人員從海洋圓錐芋螺Conus geographus的毒液中提取出一種單體形式存在的圓錐芋螺胰島素G1 (Cone snail insulin G1,cI G1) ,并發(fā)現(xiàn)其可與人胰島素受體結(jié)合,且發(fā)揮作用的速度比人胰島素 (Humaninsulin,hI) 更快,有望開發(fā)成一種超級(jí)速效胰島素[5]。本研究參照人胰島素原 (Humanproinsulin,hPI) 和圓錐芋螺胰島素G1原 (Cone snail proinsulin G1,cPI G1) 的基因,設(shè)計(jì)適于大腸桿菌 (Escherichia coli,E.coli) 表達(dá)的重組cPI G1的核苷酸序列,構(gòu)建pET22b(+)-cPI G1原核表達(dá)質(zhì)粒,以E.coliBL21(DE3)作為宿主進(jìn)行表達(dá),經(jīng)酶切純化獲得重組cI G1;隨后以重組hI甘舒霖50R為對(duì)照,對(duì)等劑量重組cI G1作用的正常小鼠和鏈脲佐菌素 (Streptozotocin,STZ) 致糖尿病模型小鼠進(jìn)行空腹血糖檢測(cè) (Fasting blood glucose test,F(xiàn)BGT)和葡萄糖耐量測(cè)試 (Oral glucose tolerance test,OGTT) ,評(píng)估重組cI G1的降糖作用。
1.1.1 質(zhì)粒、菌株和動(dòng)物
質(zhì)粒pGH-cPI G1由上海捷瑞生物科技公司合成,pET22b(+) 質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)Novagen公司。E.coliBL21(DE3) 菌株購(gòu)于北京天根生物科技公司。近交系C57BL雄性小鼠,體質(zhì)量16–20 g,SPF級(jí),購(gòu)于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)使用許可證:SCXK (吉)-2011-0004。
1.1.2 主要試劑和儀器
限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、核酸染料、T4 DNA連接酶購(gòu)于大連寶生物公司;質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)于美國(guó)OMEGA公司;β-巰基乙醇、胰蛋白酶凍干粉 (EC3.4.21.4)、鏈脲佐菌素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、三羥甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Tricine-SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、鎳-次氮基三乙酸 (Ni-NTA)瓊脂糖凝膠6FF、Sephadex G-25凝膠、透析袋(3 500 Da) 購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;重組人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品 (批號(hào)140633-201104,28.3 IU/mg)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;甘舒霖50R混合重組人胰島素注射液 (3 mL:300 IU,國(guó)藥準(zhǔn)字S20083008) 購(gòu)于通化東寶藥業(yè)股份有限公司;0.9%氯化鈉 (NaCl) 注射液 (100 mL:0.9 g,國(guó)藥準(zhǔn)字H22025619) 購(gòu)于吉林康乃爾藥業(yè)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?90型血糖儀為江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司產(chǎn)品;LC-20AT高效液相色譜 (HPLC) 儀為日本島津公司產(chǎn)品。
1.2.1 質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和構(gòu)建
比對(duì)hI和cI G1氨基酸序列,替換cI G1序列中非編碼和可能成為胰蛋白酶水解位點(diǎn)的氨基酸,參照hPI和cPI基因與E.coli優(yōu)勢(shì)密碼子進(jìn)行設(shè)計(jì)重組cPI G1核苷酸序列并合成pGH-cPI G1質(zhì)粒。利用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pGH-cPI G1質(zhì)粒和pET22b(+) 質(zhì)粒。純化回收雙酶切的cPI G1目的片段和 pET-22b(+) 載體片段,連接酶連接后轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板,挑選陽(yáng)性菌落進(jìn)行液體培養(yǎng),單、雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組菌,并送上海捷瑞生物科技有限公司進(jìn)一步測(cè)序鑒定。
1.2.2 蛋白表達(dá)和親和層析
將測(cè)序鑒定和理論序列相符的陽(yáng)性重組菌按1% (V/V) 接種量在LB液態(tài)培養(yǎng)基中37 ℃搖菌培養(yǎng),當(dāng)光密度值 (OD600) 達(dá)到0.4–0.6時(shí)加入IPTG (終濃度為1 mmol/L) 誘導(dǎo)4 h,離心收集菌體,超純水清洗3次,重懸于5倍菌體積的裂解緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,pH 8.0),冰水浴超聲破碎,高速離心收集上清液。按Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF使用說(shuō)明進(jìn)行親和層析 (柱尺寸:Φ1.28 cm×7 cm;床體積:5 mL;流速:0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm),純化蛋白凍干保存。采用 16.5%Tricine-SDS-PAGE鑒定目的蛋白[6]。蛋白產(chǎn)率(mg/g)=純化獲得的重組cPI G1質(zhì)量 (mg)/所用濕菌質(zhì)量 (g)。
1.2.3 蛋白酶解和分子篩層析
用蛋白質(zhì)折疊緩沖液 (50 mmol/L 甘氨酸,1 mmol/L EDTA, pH 10.5,高純度氮?dú)獬龤? 溶解重組cPI G1,按1.5倍二硫鍵摩爾濃度加入β-巰基乙醇誘導(dǎo)二硫鍵形成[7],4 ℃密封孵育12 h,1 mol/L Tris-HCl調(diào)定pH 8.5,與胰蛋白酶按20∶1(W/W) 均勻混合,37 ℃酶切18 h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行Sephadex G-25分子篩層析 (柱尺寸:Φ1.0 cm×90 cm;床體積:65 mL;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm),純化蛋白凍干保存。采用16.5%Tricine-SDS-PAGE鑒定目的蛋白。蛋白回收率(%) =酶解后獲得重組cI G1物質(zhì)的量 (mol)/酶解前重組cPI G1物質(zhì)的量 (mol) ×100%。
1.2.4 生物效價(jià)測(cè)定
參考《中國(guó)藥典》(2015版) HPLC測(cè)定胰島素生物活性的方法[8],采用C18色譜柱,以0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液 (硫酸鈉28.4 g/L,磷酸2.7% (V/V),乙醇胺調(diào)pH值至2.3,定容至1000 mL)-乙腈(74∶26) 為流動(dòng)相,流速1.0 mL/min,柱溫40 ℃,波長(zhǎng)214 nm。以0.01 mol/L鹽酸溶液配制1 mg/mL的重組人胰島素對(duì)照品、甘舒霖50R和重組cI G1,精密量取各個(gè)樣品20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算效價(jià)。
1.2.5 動(dòng)物模型建立
小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,12 h禁食不禁水,按200 mg/kg腹腔注射現(xiàn)配造模劑 (40 mg/mL STZ,0.1 mol/L檸檬酸鈉,pH 4.4),60 h后給小鼠進(jìn)食,72 h后稱量小鼠體重并尾端采血檢測(cè)空腹血糖值,以體重明顯減輕且血糖值≥16.7 mmol/L確定為小鼠糖尿病模型[9]。
1.2.6 動(dòng)物分組、給藥和指標(biāo)測(cè)定
正常小鼠和糖尿病小鼠各隨機(jī)分為3組,每組16只,為正常對(duì)照組 (NC組)、正常重組cI G1組 (NG組)、正常重組hI組(NH組)、模型對(duì)照組(MC組)、模型重組cI G1組 (MG組)、模型重組hI組 (MH組)。NC組和MC組注射0.9% NaCl,劑量為5 mL/kg;NG組和MG組注射20 μg/mL重組cI G1,劑量為100 μg/kg (按1 IU = 0.0347 mg hI計(jì)算[10]);NH組和MH組注射0.5 IU/mL甘舒霖50R,劑量為2.5 IU/kg[11]。給藥方式均為背部皮下注射,劑量按小鼠體重計(jì)算。在禁食8 h后,各組隨機(jī)選取8只小鼠空腹給藥進(jìn)行FBGT,另外8只小鼠以200 mg/mL葡萄糖灌胃,劑量為1 mg/kg,然后迅速給藥進(jìn)行OGTT[12]。
1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s) 表示。
對(duì)比cI G1 (PDB:A chain 5JYQ_A,B chain 5JYQ_B) 和hI (GenBank:A chain AAA72170.1,B chain AAA72171.1) 的氨基酸序列,并進(jìn)行必要的氨基酸替換 (圖1A):①A4、B12位點(diǎn)的γ-羧基谷氨酸 (γ-carboxyglutamic acid,Gla,γ) 替換為谷氨酸 (Glutamic acid,Glu,E);②B5位點(diǎn)的羥脯氨酸 (Hydroxyproline,Hyp,X) 替換為脯氨酸 (Proline,Pro,P);③A9、B8位點(diǎn)的精氨酸(Arginine,Arg,R) 替換為亮氨酸 (Leucine,Leu,L);④A18、A19、B6位點(diǎn)的賴氨酸 (Lysine,Lys,K) 分別替換為E、天冬酰胺 (Asparagine,Asn,N) 和谷氨酰胺 (Glutamine,Gln,Q),使重組cI G1中均為編碼氨基酸且不影響胰蛋白酶水解。參照hPI(GenBank:AY899304.1)和cPI(UniProtKB/Swiss-Prot:A0A0B5AC95.1) 基因,按照大腸桿菌偏愛密碼子表,設(shè)計(jì)重組cPI G1核苷酸序列(圖1B),GC含量為46.9%,其結(jié)構(gòu)中包括:①兩端限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRⅠ和Hind Ⅲ;②具有促進(jìn)可溶性表達(dá)并可延長(zhǎng)目的蛋白10倍半衰期的前導(dǎo)肽pelBleader;③重組cI G1 A鏈和B鏈及其之間的連接肽C-peptide;④可與二價(jià)鎳離子螯合用于親和層析的標(biāo)簽肽6×His Tag;⑤4個(gè)可被胰蛋白酶識(shí)別的酶切位點(diǎn)。用EcoRⅠ和Hind Ⅲ單、雙酶切鑒定構(gòu)建的pET22b(+)-cPI G1質(zhì)粒 (圖2),其中雙酶切后可見一條250 bp左右的條帶,和理論值大小一致,進(jìn)一步測(cè)序鑒定其核苷酸序列和理論值一致,表明已成功構(gòu)建表達(dá)cPI G 1的原核表達(dá)載體,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖1 pET22b(+)-cPI G1質(zhì)粒的設(shè)計(jì)Fig.1 Design of the plasmid pET22b(+)-cPI G1.(A) Sequence comparison of hI, cPI G1 and recombinant cPI G1.γ:Gla; X: Hyp; *: C-terminal amidation; —s—s—: disulfide links.(B) Characterization of recombinant cPI G1 sequence.▼: the cleavage site of trypsin.
重組菌通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá) (圖3),與未誘導(dǎo)的重組菌對(duì)比,IPTG誘導(dǎo)的重組菌在14 kDa左右有明顯的特異性條帶,與理論分子量一致(pelBleader約3.4 kDa,重組cPI G1約8.7 kDa,6×His Tag約1.5 kDa,共13.6 kDa),表明融合蛋白已經(jīng)得到可溶性表達(dá)。經(jīng)Ni-NTA親和層析獲得純化重組cPI G1蛋白,蛋白產(chǎn)率為 (3.9±0.7) mg/g。
圖2 質(zhì)粒pET22b(+)-cPI G1的酶切鑒定Fig.2 Identification of the plasmid pET22b(+)-cPI G1 by double restriction enzyme.M: DNA marker; 1:pET22b(+)-cPI G1 plasmid; 2: pET22b(+)-cPI G1 plasmid digested with EcoRⅠ; 3: pET22b(+)-cPI G1 plasmid digested with Hind Ⅲ; 4: pET22b(+)-cPI G1 plasmid digested with EcoRⅠand Hind Ⅲ.
圖3 重組cPI G1的表達(dá)及純化Fig.3 Expression and purification of recombinant cPI G1.M: ultra-low molecular weight protein marker; 1:supernatant from bacterial before induced by IPTG; 2:supernatant from bacteria induced by IPTG; 3: purified recombinant cPI G1.
純化的重組cPI G1蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解后用Sephadex G-25分子篩層析純化 (圖4),重組cI G1在5 kDa左右有明顯的特異性條帶,與理論分子量一致 (重組cI G1約5.2 kDa),表明重組cI G1水解成功并已經(jīng)正確折疊,蛋白回收率為51.9%±4.5%。
圖4 重組cPI G1的胰蛋白酶水解及重組cI G1的純化Fig.4 Hydrolysis of recombinant cPI G1 by trypsin and purification of recombinant cI G1.M: ultra-low molecular weight protein marker; 1: purified recombinant cPI G1; 2: purified recombinant cI G1.
HPLC測(cè)定相同蛋白濃度的重組人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品、甘舒霖50R和重組cI G1,結(jié)果顯示3種樣品的出峰時(shí)間基本一致 (圖5),根據(jù)峰面積計(jì)算得出重組人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)為28.3 IU/mg,甘舒霖50R的效價(jià)為28.5 IU/mg,重組cI G1的效價(jià)為25.9 IU/mg。
圖5 重組人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品、甘舒霖50R和重組cI G1的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatogram of recombinant human insulin standard, Gansulin 50R and recombinant cI G1.
腹腔注射STZ的小鼠72 h后體重平均減輕4.5 g,血糖值均高于16.7 mmol/L,表明小鼠糖尿病模型建模成功。FBGT結(jié)果顯示,NC組和MC組小鼠血糖值在180 min內(nèi)一直保持恒定,分別為 (5.76±0.32) mmol/L和 (21.1±0.51) mmol/L;NG組和MG組小鼠在注射重組cI G1后,血糖值均在20 min時(shí)達(dá)到最低,分別為 (1.73±0.46) mmol/L和 (6.94±0.52) mmol/L,然后隨時(shí)間逐步回升,在150 min后恢復(fù)到初始水平;NH組和MH組小鼠在注射甘舒霖50R后30 min血糖值達(dá)到最低,分別為 (2.03±0.47) mmol/L和 (8.07±0.49) mmol/L,隨后血糖值一直控制在較低水平 (圖6A)。OGTT結(jié)果顯示,各組小鼠在糖負(fù)荷后20 min時(shí)達(dá)到血糖高峰 (圖6B);糖負(fù)荷后NG組和MG組小鼠血糖值均在10 min至60 min時(shí)間段明顯降低,在20 min時(shí)降低幅度最大,分別達(dá) (4.18±0.16) mmol/L和 (2.94±0.13) mmol/L;NH組和MH組小鼠均在20 min至180 min時(shí)間段降低,在30 min時(shí)降低幅度最大,分別達(dá) (6.57±0.21) mmol/L和(3.48±0.15) mmol/L (圖6B)。
圖6 重組cI G1和重組hI對(duì)正常和糖尿病小鼠血糖的影響Fig.6 Effect of recombinant cI G1 and recombinant hI on blood glucose in normal and diabetic mice.(A) FBGT.(B)OGTT.
Ⅰ型糖尿病和Ⅱ糖尿病胰島素缺乏的患者均需要胰島素治療,速效類胰島素是糖尿病治療藥物研究開發(fā)的重要方向之一[13]。本研究以單體形式存在的圓錐芋螺胰島素cI G1基因設(shè)計(jì)合成了適合原核表達(dá)的重組cPI G1核苷酸序列,與pET22b(+) 質(zhì)粒連接后實(shí)現(xiàn)了重組cPI G1基因在大腸桿菌BL21(DE3) 中的成功表達(dá),并通過(guò)親和層析成功得到了重組cPI G1蛋白。降糖活性研究發(fā)現(xiàn),重組cI G1具有與甘舒霖50R相似的降血糖功效,且發(fā)揮作用更速效,這可能由于重組cI G1不僅與受體的結(jié)合效率高[5],而且短時(shí)間內(nèi)單體形式存在的重組cI G1會(huì)比含有多聚體成分的甘舒霖50R具有更大的血藥濃度。但重組cI G1作用持久性較差,其原因可能是重組cI G1與受體結(jié)合后迅速被胞吞[14],血漿中胰島素降解酶也僅切割單體胰島素[15],這使體內(nèi)重組cI G1水平迅速降低而不能持久發(fā)揮作用,而甘舒霖50R中多聚體胰島素的解聚過(guò)程可延長(zhǎng)作用時(shí)間。制備的重組cI G1的效價(jià)較甘舒霖50R略低,從降糖活性的總體效果來(lái)看重組cI G1也不如甘舒霖50R,其可能有如下方面原因:1) 為符合重組cI G1表達(dá)的要求,在設(shè)計(jì)過(guò)程中替換了部分非編碼和影響酶切的氨基酸,分子結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度的改變可能影響其生物學(xué)活性。2) 原核表達(dá)方法簡(jiǎn)單、表達(dá)量高,但表達(dá)環(huán)境不利于蛋白二硫鍵的形成,且缺乏翻譯后加工修飾體系[16],盡管采用低濃度的β-巰基乙醇促進(jìn)重組cI G1空間構(gòu)象的形成,仍達(dá)不到真核表達(dá)系統(tǒng)的效果。此外,與正常小鼠相比,重組cI G1和甘舒霖50R均對(duì)糖尿病模型小鼠血糖的調(diào)節(jié)更有力,這可能是由于正常小鼠對(duì)自身血糖的調(diào)節(jié)能力比糖尿病模型小鼠更強(qiáng)的原因。綜上所述,采用生物工程方法可制備具有明確降血糖活性的重組cI G1。然而重組cI G1在制備和儲(chǔ)存時(shí)的穩(wěn)定性、應(yīng)用時(shí)的免疫原性以及產(chǎn)生胰島素抵抗效應(yīng)等方面問(wèn)題,還需要更加深入的研究。