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    抗人脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單抗制備及應(yīng)用

    2019-03-27 11:50:04許雯陸兆新曹林
    生物工程學(xué)報 2019年3期
    關(guān)鍵詞:層析單克隆試劑

    許雯,陸兆新,曹林

    南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095

    動脈粥樣硬化導(dǎo)致的心血管疾病是我國居民首要疾病死亡原因,居民患病率逐年持續(xù)上升[1]。在社區(qū)人群中篩查和防治心血管疾病、提高基層醫(yī)療機構(gòu)對心血管疾病的診療水平是居民健康管理的重要工作,也是改善我國心血管疾病現(xiàn)狀的重要途徑[2]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lipoproteinassociated phospholipase A2, Lp-PLA2) 是血管炎癥特異性標(biāo)志物,可以直接反映動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展進(jìn)程[3-4],且可有效提高傳統(tǒng)動脈粥樣硬化預(yù)測模型的預(yù)測效力[5-7]。將Lp-PLA2應(yīng)用于社區(qū)人群篩查檢測,可幫助表面健康人群早期發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化潛在危險、早期防治,降低心血管疾病發(fā)病率;還可幫助動脈粥樣硬化患者判斷病情進(jìn)展、評估用藥效果等。

    Lp-PLA2主要由成熟的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞合成并分泌,分子量為45 kDa[8-9]。當(dāng)血管中存在粥樣斑塊時,體內(nèi)的Lp-PLA2水平上升,且在不穩(wěn)定斑塊中強表達(dá)[3]。目前Lp-PLA2的常見檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法、膠乳增強免疫比濁法[10],一方面這些檢測試劑依賴進(jìn)口抗體原料以及貴重檢測儀器,對檢測環(huán)境要求高,主要集中在三級醫(yī)院檢驗科,這使得Lp-PLA2的檢測無法在社區(qū)開展;另一方面,部分檢測試劑通過測定人體內(nèi)Lp-PLA2的酶活力作為判斷動脈粥樣硬化的依據(jù),但臨床研究表明亞洲人群更適合使用免疫質(zhì)量法檢測作為判斷依據(jù)[11-13]。

    因此,本研究擬通過真核細(xì)胞表達(dá)重組Lp-PLA2蛋白免疫小鼠,制備篩選高親和力、高特異性抗人Lp-PLA2單克隆抗體,并在此基礎(chǔ)上結(jié)合具有便攜式、檢測快、結(jié)果準(zhǔn)的即時檢驗(POCT) 技術(shù)[14],初步建立Lp-PLA2量子點熒光免疫層析定量檢測方法,為臨床實現(xiàn)可社區(qū)化應(yīng)用的Lp-PLA2免疫學(xué)檢測提供新的途徑。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料

    Lp-PLA2血清樣本由南京鼓樓醫(yī)院提供,其中確診為動脈粥樣硬化樣本32例;BALB/c小鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心;CHO-K1細(xì)胞為本實驗室保存;SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞系、CdSe/CdS/ZnS水溶性量子點、ClonExpress?ⅡOne Step試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;對比試劑購自美國diaDexus公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、抗體亞型測定試劑盒購自Sigma公司;潮霉素B、LipofectamineTM2000購自Thermo Fisher公司;其他各類試劑和培養(yǎng)液均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

    1.2 Lp-PLA2重組蛋白制備

    1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

    從NCBI上獲得Lp-PLA2的全長基因序列(NCBI Reference Sequence: NP_001161829.1),進(jìn)行密碼子優(yōu)化后交蘇州金唯智生物科技有限公司合成,克隆構(gòu)建于pUC19載體。以合成的pUC19-Lp-PLA2為模板,擴增Lp-PLA2目的基因片段。設(shè)計引物 (UCOE-F: 5′-GTCGACCTGCAGGCATGCAA GCTGG-3′; UCOE-R: 5′-GGAGTTGGTCACCAGG GCCAGGGAC-3′) 線性化UCOE載體,使用ClonExpress?ⅡOne Step試劑盒構(gòu)建質(zhì)粒UCOELp-PLA2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,隨機挑選克隆交測序公司進(jìn)行測序鑒定。測序結(jié)果正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒大提,去除內(nèi)毒素。

    1.2.2 Lp-PLA2重組蛋白表達(dá)與純化

    將凍存的CHO-K1細(xì)胞用CDM4CHO培養(yǎng)液(含6 mmol/L Gln) 進(jìn)行復(fù)蘇與傳代,培養(yǎng)至細(xì)胞長滿80%以上。以LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑,參照轉(zhuǎn)染說明書用UCOE-Lp-PLA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞,設(shè)置UCOE空載質(zhì)粒及無質(zhì)粒的對照組,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別用含0.4 mg/mL潮霉素B的培養(yǎng)液進(jìn)行加壓篩選,隔天監(jiān)測細(xì)胞狀態(tài)及活力,每4 d換液一次,培養(yǎng)2周后收集存活細(xì)胞。采用有限稀釋法輔以倍比稀釋法進(jìn)行單克隆篩選,挑選表達(dá)量大于20 μg/mL的克隆,調(diào)整初始細(xì)胞密度為3×105/mL擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞活力下降到70%時,收集細(xì)胞上清,0.45 μm超濾膜過濾后用Ni2+親和層析柱純化蛋白,目的蛋白用SDS-PAGE鑒定并用diaDexus公司Lp-PLA2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測重組蛋白反應(yīng)性。

    1.3 抗人Lp-PLA2單克隆抗體的制備

    將濃度為1 mg/mL的重組Lp-PLA2蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化,選取6–8周齡的雌性BALB/c小鼠從跗關(guān)節(jié)處注射40 μg抗原進(jìn)行免疫。間隔1周,將濃度為1 mg/mL的重組Lp-PLA2蛋白與等量的弗氏不完全佐劑混合乳化,對小鼠進(jìn)行再次免疫,間隔1周加強免疫。3次免疫后尾靜脈采血,間接ELISA法檢測血清效價,選取效價最高的小鼠用于融合實驗。以PEG 1500作為融合劑,取對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0,以1∶3的比例與免疫小鼠脾臟組織中的淋巴細(xì)胞在含有20% FBS血清的HAT-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。一周后觀察細(xì)胞融合狀態(tài)并換液,換液3 d后取細(xì)胞培養(yǎng)上清。以臨床確診為動脈粥樣硬化患者的血清為抗原,用間接ELISA法篩選陽性細(xì)胞株,選擇陽性值與細(xì)胞數(shù)比值較高的細(xì)胞進(jìn)行多次亞克隆,最終得到多株能夠穩(wěn)定分泌抗Lp-PLA2的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用小鼠腹水誘生法大量制備單克隆抗體并先后進(jìn)行飽和硫酸銨沉淀純化法、Protein A親和柱純化法純化抗體。

    1.4 單克隆抗體特性鑒定

    1.4.1 腹水單克隆抗體效價測定

    腹水單克隆抗體的效價通過間接ELISA測定。以重組Lp-PLA2蛋白作為包被抗原,將純化的5種單克隆抗體分別按1∶1 000進(jìn)行倍比稀釋上樣,共稀釋12個梯度 (1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1 024 000、1∶2 048 000),以SP2/0培養(yǎng)上清為陰性對照,OD450值高于陰性對照2.1倍以上判定為陽性孔,陽性結(jié)果中的最大稀釋度即為該腹水單克隆抗體的效價。

    1.4.2 單克隆抗體亞型鑒定

    采用抗體亞型測定試劑盒鑒定純化后單克隆抗體亞型。

    1.4.3 單克隆抗體親和力測定

    采用Bobrovnik等[15]的方法測定抗體親和力解離常數(shù) (Kd),以重組Lp-PLA2蛋白為包被抗原,抗原稀釋至2.048×10–7、1.024×10–7、5.12×10–8、2.56×10–8、1.28×10–8、6.4×10–9、3.2×10–9、1.6×10–9、8×10–10、4×10–10、2×10–10、1×10–10mol/L,間接ELISA法檢測不同抗原包被濃度下抗體檢測的OD450值,按照公式 (1) 建立Ai/(A0–Ai) 與l/li的線性方程,斜率即為Kd值。

    Kd為親和力解離常數(shù);li為抗原濃度;A0為無抗原時抗體檢測OD值;Ai為抗原濃度為li時的抗體檢測OD值。

    1.4.4 單克隆抗體特異性驗證

    分別以Western blotting和間接ELISA法驗證獲得的5株單克隆抗體的特異性。取重組Lp-PLA2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后以純化后的5株單克隆抗體作為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗,進(jìn)行Western blotting檢測。

    選取濃度為23、125 ng/mL的Lp-PLA2陰性血清樣本和濃度為230、452、667 ng/mL的Lp-PLA2陽性血清樣本作為包被抗原,間接ELISA法檢測單抗特異性。

    1.5 抗體配對篩選

    免疫層析法檢測Lp-PLA2通過雙抗體夾心法實現(xiàn),需要篩選一對可與抗原特異性結(jié)合且不受空間結(jié)構(gòu)影響的抗體。取親和力高的單抗采用雙抗夾心ELISA法進(jìn)行配對實驗[16]。以陽性血清樣本作為抗原,純化后單抗作為捕獲抗體包被至96孔板,再分別用HRP標(biāo)記各抗體作為檢測抗體,進(jìn)行配對初步篩選,保留一孔為陰性對照,對照孔樣品為等量陽性血清樣本,檢測各反應(yīng)孔OD450值。

    1.6 免疫層析檢測方法建立

    1.6.1 免疫層析檢測試劑制備

    樣品墊制備:將樣品墊浸泡在包被緩沖液(0.02 mol/L HEPES,5% 海藻糖,1%酪蛋白,pH 8.0) 中5 min,室溫晾干后37 ℃烘干16 h。

    標(biāo)記物墊制備:稀釋量子點原液至固含量為1%,加入終濃度分別為5 mg/mL和7.5 mg/mL的EDC、NHS水溶液,室溫孵育30 min。向體系中加入標(biāo)記抗體PLA5至終濃度為0.05 mg/mL,室溫孵育1 h。添加含有5% BSA的封閉液室溫孵育1 h。制備好的量子點-抗體標(biāo)記復(fù)合物離心后置換儲存液 (0.05 mol/L Tris-HCl,2% 蔗糖,0.2%BSA,pH 8.0)。以3.0 μL/cm的噴量在標(biāo)記物墊上噴涂量子點-抗體標(biāo)記復(fù)合物,45 ℃烘干16 h。

    包被膜的制備:用蛋白固定液 (0.01 mol/L PBS,pH 7.4) 稀釋Lp-PLA2重組抗原至0.75 mg/mL作為檢測試紙條的質(zhì)控線 (C線),稀釋包被抗體PLA1至1.0 mg/mL作為檢測試紙條的檢測線 (T線),以0.8 μL/cm噴量在硝酸纖維素膜上分別包被兩種蛋白C線與T線之間間隔5 mm。37 ℃烘干16 h。

    試劑卡組貼:按照試劑卡的結(jié)構(gòu),包被膜位于PVC背襯板上,在整個結(jié)構(gòu)的最底層,標(biāo)記物墊與吸水棉漿紙分別組貼在包被膜兩側(cè),樣品墊組貼于標(biāo)記物的另一側(cè),組貼好試劑卡密封保存。

    1.6.2 免疫層析檢測試劑評價

    校準(zhǔn)曲線建立:稀釋重組Lp-PLA2蛋白至2 000、1 000、500、250、125、60、40、20、10 ng/mL作為校準(zhǔn)品。用制備的試紙條檢測校準(zhǔn)品各2次,計算T線與C線熒光強度的比值 (T/C值)。熒光強度檢測的激發(fā)波長為365 nm,發(fā)射波長為610 nm。以T/C值為縱坐標(biāo),校準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo),繪制校準(zhǔn)曲線并計算線性范圍。

    重復(fù)性評價:按照1.6.1中工藝制備3個批次的Lp-PLA2檢測試劑,并分別檢測Lp-PLA2濃度為175.0 ng/mL和350.5 ng/mL的臨床血清樣本,每個樣本重復(fù)檢測20次,計算批間變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV)。

    臨床應(yīng)用比對:應(yīng)用自制試劑與diaDexus公司Lp-PLA2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒同時測試100例臨床血清樣本,其中陰性樣本68例,陽性樣本32例,以自制檢測系統(tǒng)為橫坐標(biāo),diaDexus公司試劑盒檢測系統(tǒng)為縱坐標(biāo),SPSS統(tǒng)計軟件作相關(guān)性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Lp-PLA2目的基因擴增及質(zhì)粒鑒定

    目的基因經(jīng)PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示在對應(yīng)大小處有目的條帶,且無雜帶,Lp-PLA2核酸片段大小約1 300 bp,鑒定結(jié)果如圖1所示。挑取單克隆進(jìn)行測序鑒定,測序結(jié)果經(jīng)比對后發(fā)現(xiàn)序列完全正確,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖1 目的基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR products of target gene.

    2.2 重組Lp-PLA2蛋白純化結(jié)果

    重組質(zhì)粒UCOE-Lp-PLA2轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞,并用潮霉素B作為篩選條件篩選可以穩(wěn)定分泌表達(dá)Lp-PLA2蛋白的細(xì)胞株。目的蛋白大小為45 kDa (圖2),SDS-PAGE顯示細(xì)胞上清中雜蛋白較少,并且在目的蛋白分子量對應(yīng)處有明顯條帶,純化后目的蛋白純度達(dá)到90%以上,最終目的蛋白的產(chǎn)量為42.3 μg/mL。

    2.3 重組蛋白反應(yīng)性評價

    圖2 重組Lp-PLA2凝膠電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant Lp-PLA2.M: marker; 1: cell supernatant; 2: recombinant Lp-PLA2 protein.

    重組Lp-PLA2蛋白用于小鼠的免疫以及檢測試劑校準(zhǔn)品、質(zhì)控線的制備。取純化后的重組Lp-PLA2蛋白,用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后,倍比稀釋至10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1 250 ng/mL、625 ng/mL、312.5 ng/mL、156.25 ng/mL,用diaDexus公司的Lp-PLA2試劑檢測蛋白稀釋液。結(jié)果見圖3,剔除因蛋白濃度過高而產(chǎn)生hook效應(yīng)的濃度點10 000 ng/mL和20 000 ng/mL后,檢測濃度和理論濃度間一致性好,R2=0.995 1,相關(guān)系數(shù)R=0.998>0.99,該重組抗原應(yīng)用于后續(xù)實驗。

    2.4 單克隆抗體制備

    經(jīng)細(xì)胞融合及篩選實驗后,共獲得5株能穩(wěn)定分泌抗人Lp-PLA2單克隆抗體且表達(dá)量在20 μg/mL的細(xì)胞株,分別命名為PLA1–PLA5。如圖4所示,純化后抗體經(jīng)還原SDS-PAGE分析,在50 kDa和25 kDa處有明顯的重鏈條帶和輕鏈條帶,且未見明顯雜帶,表明抗體經(jīng)純化后結(jié)構(gòu)完整并達(dá)到較高的純度,可用于后續(xù)實驗。

    圖3 重組Lp-PLA2反應(yīng)性檢測結(jié)果Fig.3 Reactivity test results of recombinant Lp-PLA2.

    圖4 SDS-PAGE檢測抗體純化結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified mAbs.

    2.5 單克隆抗體特性鑒定

    2.5.1 腹水單克隆抗體效價測定

    腹水單克隆抗體通過間接ELISA測定其效價。PLA1–PLA5雜交瘤細(xì)胞制備腹水單克隆抗體后,間接ELISA測定腹水單克隆效價分別為1∶106、1∶106、1∶106、1∶105、1∶106。

    2.5.2 單克隆抗體亞型鑒定

    經(jīng)試劑盒鑒定,5株單克隆抗體均為IgG1型。

    2.5.3 單克隆抗體親和力測定

    以重組Lp-PLA2蛋白作為抗原,通過間接ELISA方法測定抗體親和力解離常數(shù)。結(jié)果表明PLA1、PLA2、PLA3、PLA4、PLA5的親和力解離常數(shù)分別為 1.8×10–9、3.4×10–8、2.0×10–8、2.7×10–6、3.1×10–8,PLA1、PLA2、PLA3、PLA5抗體親和力明顯高于PLA4,可用于后續(xù)抗體配對篩選。

    2.5.4 單克隆抗體特異性驗證

    通過Western blotting驗證單克隆抗體特異性,如圖5A所示,5株單克隆抗體均能與分子量為45 kDa的蛋白條帶反應(yīng),與重組Lp-PLA2蛋白分子量相符,且反應(yīng)條帶單一,表明5株單克隆抗體均能特異性識別重組Lp-PLA2蛋白。

    通過ELISA方法檢測抗體與天然抗原反應(yīng)特異性,如圖5B所示,5株單克隆抗體均與陽性血清反應(yīng),且與血清中Lp-PLA2濃度線性相關(guān),即說明5株單克隆抗體均能特異性識別人血中的Lp-PLA2。

    2.6 抗體配對篩選

    選擇PLA1、PLA2、PLA3及PLA5進(jìn)行抗體配對篩選實驗,當(dāng)檢測OD450值越高時,表明配對的效果越好。如表1所示,16種配對中PLA1、PLA2、PLA3間無法與抗原形成夾心配對,PLA5單克隆抗體與其他3株單抗均能形成良好配對,且PLA5作為檢測抗體時測試性能更佳。綜合配對及抗體鑒定結(jié)果,選擇配對良好且親和力最高的PLA1與PLA5為配對單克隆抗體進(jìn)行后續(xù)免疫層析檢測方法建立的實驗。

    圖5 抗體特異性鑒定Fig.5 Identification of mAbs’ specificity.

    表1 抗體配對篩選結(jié)果Table 1 Results of antibody pairing screening

    2.7 免疫層析檢測方法建立

    2.7.1 校準(zhǔn)曲線建立

    通過計算層析試紙條檢測線 (T) 與質(zhì)控線 (C)檢測信號值的比值 (T/C) 與抗原濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖6所示,Lp-PLA2濃度在20–1 000 ng/mL之間時,T/C值與蛋白濃度線性相關(guān),蛋白濃度越高,T/C值越高,線性擬合方程為y=0.013 2x+0.073 5,R2=0.998 3。因此本試劑的線性范圍為20–1 000 ng/mL。Lp-PLA2濃度在1 000–2 000 ng/mL時,未出現(xiàn)hook效應(yīng),因此本試劑檢測上限為2 000 ng/mL。

    2.7.2 重復(fù)性評價

    用3個批次的Lp-PLA2免疫層析檢測試劑檢測濃度為175.0 ng/mL和350.5 ng/mL的臨床樣本各20次,計算每個樣本檢測結(jié)果的均值及CV。結(jié)果如表2所示,濃度為175.0 ng/mL的樣本檢測批間CV為5.88%;濃度為350.5 ng/mL的樣本檢測批間CV為4.29%,試劑批次間的變異系數(shù)均小于6%,精密性良好。

    2.7.3 臨床應(yīng)用比對

    圖6 Lp-PLA2量子點免疫層析試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of quantum dots-based Lp-PLA2 test strips.

    表2 Lp-PLA2量子點免疫層析試劑重復(fù)性Table 2 Precision of quantum dots-based Lp-PLA2 test strips

    圖7 兩種試劑盒相關(guān)性比對Fig.7 Comparison between quantum dots-based test kit and diaDexus ELISA test kit.

    采用本實驗初步建立的Lp-PLA2定量檢測試劑與diaDexus公司Lp-PLA2檢測試劑進(jìn)行臨床比對,結(jié)果如圖7所示。比對實驗中采用兩種試劑平行測試100例臨床血清樣本,檢測結(jié)果經(jīng)線性回歸分析 (R2=0.981,P<0.001),相關(guān)系數(shù)R=0.99,兩種檢測系統(tǒng)結(jié)果具有良好的相關(guān)性,兩種試劑檢測結(jié)果間無差異。

    3 討論

    動脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中等疾病的主要病理基礎(chǔ)[17],通常經(jīng)過斑塊形成、斑塊破裂、形成血栓等病理過程而最終導(dǎo)致急性心血管事件,提早預(yù)防可以有效降低心血管疾病發(fā)病率。Lp-PLA2是血管炎癥獨立預(yù)測因子,與心血管疾病發(fā)生風(fēng)險呈顯著正相關(guān),可用于心血管疾病的預(yù)測、治療和預(yù)后評估,在社區(qū)人群中進(jìn)行Lp-PLA2篩查檢測可以幫助居民進(jìn)行心血管健康管理。近年來,我國動脈粥樣硬化患病群體年齡不斷下降,未來成人疾病負(fù)擔(dān)將會不斷加重,通過提早預(yù)防來降低動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生率勢在必行。

    Lp-PLA2免疫學(xué)檢測方法以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ),高特異性、高親和力的單克隆抗體是決定檢測準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵性因素。Zhang等[18-19]在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)Lp-PLA2重組蛋白,其中昆蟲細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物具備蛋白活性且表達(dá)量最高,為6 μg/mL,純化后目的蛋白得率僅為2.7%,表達(dá)量較低且不易純化,在單抗制備、診斷試劑開發(fā)等多方面的應(yīng)用受到限制。李蘇亮等[20]選擇融合表達(dá)載體pBV220構(gòu)建pBV220-Lp-PLA2重組質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白,并免疫小鼠制備單克隆抗體;Huang等[21]構(gòu)建pCold TF-Lp-PLA2表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)得到帶有TF標(biāo)簽的重組Lp-PLA2蛋白,并以此作為免疫原制備得到抗Lp-PLA2兔多抗,兩種方法均采用了大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組Lp-PLA2蛋白,但是相比較于哺乳動物表達(dá),原核系統(tǒng)缺少對重組蛋白的表達(dá)后修飾,作為免疫原會對抗體特性造成影響,Huang等[21]選擇TF標(biāo)簽增加目的蛋白可溶性,幫助重組蛋白正確翻譯折疊并提高表達(dá)水平,但是多克隆抗體的批次間制備差異不可控,因此并不適用于后續(xù)檢測方法的建立。沈鶴霄等[22]提出了在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中同時表達(dá)重組Lp-PLA2并將混合蛋白作為免疫原采用常規(guī)方法免疫小鼠制備單克隆抗體,這種方法抗原制備方法復(fù)雜,各系統(tǒng)制備所得重組Lp-PLA2的差異難以控制,以此作為免疫原制備得到的單克隆抗體特性受干擾因素較多,不適合應(yīng)用于對準(zhǔn)確度要求高的檢測試劑中。朱建安[23]通過多肽固相合成法直接合成Lp-PLA2抗原表位肽并與載體蛋白KLH連接作為免疫原制備得到對應(yīng)單克隆抗體,雖然此方法制備的抗體特異性更高,但是其與天然蛋白的親和力也因此受限,以此作為免疫檢測的關(guān)鍵材料會使得試劑檢測靈敏度受到相應(yīng)的局限。因此,本文選用CHO-K1真核表達(dá)系統(tǒng)[24-27]進(jìn)行重組Lp-PLA2蛋白的表達(dá),一方面哺乳動物細(xì)胞翻譯后的加工修飾體系更完善,表達(dá)的外源蛋白更接近天然構(gòu)象[28],可以免疫得到特異性、親和力更高的抗體,另一方面CHO-K1細(xì)胞通過胞外分泌的形式表達(dá)目的蛋白,雜蛋白少且易于純化,最終重組Lp-PLA2蛋白產(chǎn)量為42.3 μg/mL,經(jīng)SDS-PAGE與市售Lp-PLA2檢測試劑盒驗證,蛋白純度與反應(yīng)性均較優(yōu)。利用該重組蛋白免疫小鼠,篩選得到配對單克隆抗體PLA1和PLA5,兩株抗體親和力均達(dá)到1×10–8且能夠特異識別人血液中的Lp-PLA2。在采用雙抗夾心ELISA法進(jìn)行抗體配對評價實驗時發(fā)現(xiàn),雖然PLA5與PLA1兩株抗體能夠兩兩配對,但是在PLA5用于檢測抗體時,OD450更高,這一現(xiàn)象同樣存在于PLA5與PLA2和PLA3配對反應(yīng)時,我們推測PLA1、PLA2、PLA3的抗原結(jié)合表位易受到標(biāo)記物的影響。因此在利用這一配對抗體進(jìn)行免疫層析方法建立時,選用PLA5抗體與示蹤物質(zhì)偶聯(lián),以獲得更高的檢測靈敏度。

    Lp-PLA2現(xiàn)有檢測技術(shù)中部分以測定酶活性為主,特異性差且檢測結(jié)果易受干擾。選用免疫質(zhì)量法檢測Lp-PLA2的方法學(xué)以ELISA和膠乳增強免疫比濁法為主,其中ELISA方法檢測準(zhǔn)確度高,但需經(jīng)過洗板、孵育等多個步驟,單次測定時間在2 h以上;膠乳增強免疫比濁法檢測快速準(zhǔn)確,但是檢測儀器對檢測環(huán)境及操作要求高,因此這兩種方法均不適合Lp-PLA2檢測在社區(qū)醫(yī)療機構(gòu)推廣應(yīng)用。本研究建立的Lp-PLA2熒光免疫層析檢測方法,選用新型熒光材料量子點作為示蹤物質(zhì),避免了以膠體金為示蹤物質(zhì)的第一代免疫層析方法帶來的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的問題,并且提高了和抗體的生物相容性[29-30],性能評估結(jié)果表明檢測線性范圍為20–1 000 ng/mL,批次間變異系數(shù)小于6%,重復(fù)性良好,與市售的ELISA檢測試劑進(jìn)行臨床比對,共檢測了100例血清樣本 (32例陽性樣本,68例陰性樣本),兩種方法的檢測結(jié)果無顯著差異,本方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

    本研究旨在通過抗體原料的開發(fā),建立檢測準(zhǔn)確、操作簡便、儀器便攜、適用于社區(qū)醫(yī)療機構(gòu)的Lp-PLA2定量免疫層析檢測方法,為動脈粥樣硬化疾病防治提供切實可行的途徑。進(jìn)一步研究將對更大規(guī)模的臨床樣本 (如不同社區(qū)體檢人群的血清) 進(jìn)行檢測,并與其他檢測方法進(jìn)行比對,驗證本方法的可靠性,以期盡早獲得可以在社區(qū)醫(yī)療機構(gòu)推廣應(yīng)用的檢測試劑。

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