兩種錯(cuò)義突變p.Glu502Lys和p.Gly542Ser所致遺傳性Ⅻ缺陷癥家系的分析

翁妙珊 林芬 章金燦 吳教仁 李鄧松 謝裕強(qiáng) 楊立業(yè)★

在傳統(tǒng)的凝血瀑布理論中，凝血因子Ⅻ（coagulation factorⅫ，F(xiàn)Ⅻ）是內(nèi)源性凝血途徑的啟動(dòng)因子，屬于凝血接觸相蛋白，主要由肝臟合成?；罨腇Ⅻ（FⅫa）除啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑外，也參與纖溶途徑的激活、補(bǔ)體的活化和炎癥反應(yīng)[1]。遺傳性FⅫ缺陷癥（OMIM：234000）是由位于染色體5q33-qter的FⅫ基因突變所致的一種較罕見的常染色體隱性遺傳病，部分家系可表現(xiàn)為顯性遺傳[2]。該病在人群中的發(fā)病率并不明確，患者在臨床上通常無出血傾向，常因術(shù)前凝血常規(guī)檢查顯示活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）延長而被發(fā)現(xiàn)。隨著基因檢測方法的飛速發(fā)展，近年來有關(guān)FⅫ缺陷癥基因突變研究的病例報(bào)道有所增加[3-4]。本文通過對1個(gè)近親結(jié)婚的遺傳性FⅫ缺陷癥家系進(jìn)行凝血指標(biāo)檢測和基因突變分析，并對突變位點(diǎn)的致病機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象

先證者，男，30歲，廣東省潮州市鳳塘鎮(zhèn)人，2017年4月以“肛瘺”為主訴入住我院治療。檢查凝血常規(guī)時(shí)發(fā)現(xiàn)APTT明顯延長達(dá)174.8 s，遂行APTT糾正試驗(yàn)，確定為凝血因子缺乏，進(jìn)一步篩查凝血因子活性，發(fā)現(xiàn)凝血因子Ⅻ活性（FⅫactivity，F(xiàn)Ⅻ：C）僅為0.8%，肝腎功能及其他凝血指標(biāo)均無明顯異常，考慮患者為FⅫ缺陷癥。入院后行肛瘺瘺管切除術(shù)，術(shù)中和術(shù)后未見明顯異常出血，術(shù)后給予抗感染、制酸、止血、消腫、高錳酸鉀溶液坐浴、補(bǔ)液治療，患者痊愈出院?；颊咦栽V既往并無自發(fā)出血史和血栓史，父母為近親結(jié)婚，其他家系成員均無出血史和血栓史。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在獲得先證者與家系成員的知情同意下，采集先證者與家系成員（共6人）外周血標(biāo)本各2管，0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝，1管用于檢測凝血指標(biāo)，并于2 h內(nèi)完成；另1管-80℃凍存，準(zhǔn)備用于抽提DNA，進(jìn)一步做基因檢測。

1.2.2 凝血指標(biāo)檢測

采用美國ACL TOP700全自動(dòng)血凝儀對先證者及其家系成員進(jìn)行血漿凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、APTT、凝血因子Ⅷ活性（FⅧactivity，F(xiàn)Ⅷ：C）、凝血因子Ⅸ活性（FⅨ activity，F(xiàn)Ⅸ：C）、凝血因子Ⅺ活性（FⅪ activity，F(xiàn)Ⅺ：C）和FⅫ：C的檢測，配套試劑為美國IL公司產(chǎn)品。

1.2.3 基因分析方法

采用深圳亞能生物技術(shù)有限公司的試劑盒，提取基因組DNA，對先證者FⅫ基因所有的外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列參考文獻(xiàn)[2]，引物由上海英濰捷基公司合成。PCR產(chǎn)物純化后用ABI 3700測序儀（Applied Biosystems公司，美國）進(jìn)行測序，測序的結(jié)果通過網(wǎng)站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 進(jìn)行序列比較，尋找基因突變。家系成員在明確先證者基因突變位點(diǎn)后，PCR擴(kuò)增相應(yīng)區(qū)域并測序分析。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標(biāo)檢測結(jié)果

先證者及其妹妹APTT均明顯延長，分別為174.8 s和109.5 s，F(xiàn)Ⅻ：C均極度降低，分別為0.8%和1.9%；先證者兒子APTT在正常范圍，但FⅫ：C約為正常值的一半，為29.5%。先證者和家系成員其他各項(xiàng)凝血指標(biāo)均無明顯異常，凝血指標(biāo)檢測結(jié)果見表1。

2.2 FⅫ基因檢測結(jié)果

基因測序發(fā)現(xiàn)先證者及其妹妹FⅫ基因均存在13號(hào)外顯子c.1561G＞A雜合突變，導(dǎo)致p.Glu502Lys錯(cuò)義突變，同時(shí)在14號(hào)外顯子均存在c.1681 G＞A雜合突變，導(dǎo)致p.Gly542Ser錯(cuò)義突變。家系分析表明先證者父親及兒子為c.1561G＞A雜合突變，母親為c.1681 G＞A雜合突變。先證者及家系成員FⅫ基因第1外顯子啟動(dòng)子區(qū)46C/T多態(tài)性位點(diǎn)基因型均為CT型?；驒z測結(jié)果見表2和圖1。

表1 FⅫ缺陷癥家系凝血指標(biāo)檢測結(jié)果Table 1 The coagulation indices of the hereditary coagulation factorⅫdeficiency family

表2 FⅫ缺陷癥家系基因型檢測結(jié)果Table 2 The genotype results of the hereditary coagulation factorⅫdeficiency family

圖1 FⅫ基因突變測序結(jié)果Figure 1 The sequencing results of factorⅫgene mutation

2.3 家系圖譜分析

家系分析表明，先證者及其妹妹均攜帶p.Glu502Lys和p.Gly542Ser2種雜合錯(cuò)義突變，該突變遺傳自近親結(jié)婚的父母，其中p.Glu502Lys遺傳自父親，p.Gly542Ser遺傳自母親，先證者兒子攜帶的p.Glu502Lys則遺傳自先證者。家系圖譜見圖2。

3 討論

圖2 本例遺傳性FⅫ缺陷癥家系圖Figure 2 The family tree of hereditary coagulation factorⅫdeficiency

FⅫ基因定位于人類染色體5q33-qter區(qū)，由14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子組成[5]。外顯子1編碼信號(hào)肽，外顯子2編碼一個(gè)目前還未見有同源結(jié)構(gòu)的區(qū)域，外顯子3和4編碼與Ⅱ型纖維連接蛋白同源結(jié)構(gòu)類似的區(qū)域，外顯子5和7各自編碼一個(gè)表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域（epidermal growth factor likedomains，EGF），外顯子6編碼與纖維連接蛋白的指狀結(jié)構(gòu)同源區(qū)。FⅫ基因的催化結(jié)構(gòu)域由外顯子11～14 編碼[6]。成熟FⅫ是由 596個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈糖蛋白，絲氨酸蛋白酶活性中心由His393、Asp442和 Ser544 組成[2]。

本研究中我們通過對1個(gè)近親婚配的遺傳性FⅫ缺陷癥家系進(jìn)行基因分析，發(fā)現(xiàn)先證者及其妹妹均存在c.1561G＞A（p.Glu502Lys）和c.1681 G＞A（p.Gly542Ser）2種雜合錯(cuò)義突變。家系成員中，先證者父親及兒子攜帶p.Glu502Lys雜合突變，母親攜帶p.Gly542Ser雜合突變。編碼1561位于FⅫ基因13號(hào)外顯子催化結(jié)構(gòu)域，堿基G＞A導(dǎo)致p.Glu502Lys錯(cuò)義突變，即502位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，推測該突變使負(fù)電的酸性谷氨酸變成正電的堿性賴氨酸，影響了多肽鏈的穩(wěn)定性，造成突變的蛋白質(zhì)提前降解及分泌障礙，從而引起血漿中FⅫ活性的下降。邢志芳等[7]于2011年首次報(bào)道FⅫ基因p.Glu502Lys，文中2個(gè)先證者均存在p.Glu502Lys，其中1個(gè)為復(fù)合雜合子，另1個(gè)為純合子，并通過體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了突變蛋白合成和分泌障礙導(dǎo)致FⅫ活性明顯降低。此外，Jin等[8]報(bào)道其研究的FⅫ缺陷癥家系中也存在FⅫ基因p.Glu502Lys。編碼1681位于FⅫ基因14號(hào)外顯子催化區(qū)，堿基G＞A導(dǎo)致p.Gly542Ser錯(cuò)義突變，即542位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，因Gly542與FⅫ基因活性位點(diǎn)Ser544僅有2個(gè)氨基酸的距離，p.Gly542Ser錯(cuò)義突變很可能會(huì)影響544位活性位點(diǎn)的激活，并影響其正常的生物學(xué)功能。另外，甘氨酸為非極性疏水性氨基酸，同時(shí)具有酸堿性官能團(tuán)，而絲氨酸為極性親水性氨基酸，不帶電荷，電荷的改變也可能影響催化結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，使其更容易被降解，引起血漿中FⅫ活性減低。已有不少學(xué)者報(bào)道過FⅫ基因p.Gly542Ser[1，9-10]，其中張揚(yáng)等[10]推測該錯(cuò)義突變的部位處于Cys540-Cys571之間，可能影響了二硫鍵的斷裂，從而影響FⅫ的活性。由于目前FⅫ的結(jié)構(gòu)仍未完全闡明，因此對于各結(jié)構(gòu)域的功能只是個(gè)推測，發(fā)生在FⅫ蛋白催化功能區(qū)的突變，在不能被充分激活的情況下可能會(huì)影響其發(fā)揮應(yīng)有的生物學(xué)功能[3]。本研究中發(fā)現(xiàn)的2種雜合錯(cuò)義突變均發(fā)生在催化結(jié)構(gòu)域，考慮復(fù)合雜合突變是導(dǎo)致先證者及其妹妹FⅫ活性極度降低的原因。

在FⅫ基因的第一外顯子啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)常見的多態(tài)性位點(diǎn)“46CT多態(tài)性”，具體包括46C/C、46C/T、46T/T3種基因型。46 T是會(huì)引起FⅫ翻譯效率降低而導(dǎo)致血漿中FⅫ水平減低的多態(tài)性位點(diǎn)[11]。巧合的是，本例家系的先證者及其家系成員46C/T多態(tài)性位點(diǎn)基因型均為同一基因型，都是C/T型。

遺傳性FⅫ缺陷癥患者不表現(xiàn)自發(fā)性出血或嚴(yán)重的損傷后出血等其他凝血因子缺乏所具有的臨床癥狀[12]，即使是大型的開顱手術(shù)也無明顯出血癥狀[2]，先證者及其妹妹APTT均明顯延長，F(xiàn)Ⅻ：C均極度降低，但2人均無出血和血栓形成的臨床表現(xiàn)，先證者術(shù)中、術(shù)后也未見明顯異常出血。FⅫ缺陷癥與血栓性疾病間的關(guān)系多來源于散發(fā)的病例報(bào)道，兩者之間的關(guān)系尚存在爭議[13-14]。然而，最新的研究指出FⅫ只參與血栓形成而不參與止血過程，對于血栓形成是必需的[15]。近些年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，F(xiàn)Ⅻ缺乏有可能跟FⅪ缺乏一樣，是預(yù)防血栓形成的保護(hù)性因素，并且不增加出血風(fēng)險(xiǎn)，甚至也可以作為治療血栓安全有效的靶點(diǎn)[16-17]。因此，從分子水平研究FⅫ缺陷癥的發(fā)病機(jī)制可能將更有助于了解FⅫ與血栓形成間的相關(guān)性。