鼻咽癌組織中USP22的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系

莫文法， 張錫流

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科(廣西桂林 541001)； 2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科(廣西南寧 530023)

鼻咽癌是鼻咽部上皮組織發(fā)生的惡性腫瘤,是我國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一，多見(jiàn)于我國(guó)廣東、廣西、福建等南方地區(qū)，有明顯的地域性，男性患者多于女性患者，發(fā)病率為耳鼻喉頭頸部惡性腫瘤之首。鼻咽癌有易浸潤(rùn)性、高轉(zhuǎn)移性和易復(fù)發(fā)的臨床特點(diǎn)，但鼻咽癌的病因及發(fā)生機(jī)制目前尚未完全明確。2005年Glinsky等[1]通過(guò)mRNA微集陣列(microarray)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并總結(jié)了包括泛素特異性肽酶22基因(ubiquitin specific peptidase 22，USP22)等11個(gè)基因在內(nèi)的一組癌死亡標(biāo)簽(death-from-cancer signature)。癌死亡標(biāo)簽在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，編碼促使腫瘤生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性和預(yù)后復(fù)發(fā)等密切相關(guān)，因此，也被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記基因[2]。USP22是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志家族中一個(gè)成員，屬于去泛素化酶蛋白酶超家族，具有去泛素化的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)USP22在人類(lèi)肺癌、腎癌、腸癌、胃癌、甲狀腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)[3-7]。國(guó)內(nèi)對(duì)USP22在鼻咽癌方面的報(bào)道罕見(jiàn)，故本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)USP22在鼻咽癌組織中的表達(dá), 并初步分析USP22蛋白的表達(dá)與患者臨床病理因素和預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集隨訪資料完整的2013年1月至2014年12月桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的60例鼻咽癌組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組。其中非角化性癌57例，角化性鱗狀細(xì)胞癌3例；男46例，女14例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例；年齡32～80歲，中位年齡50歲。另隨機(jī)收集同期20例鼻咽黏膜慢性炎組織標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男11例，女9例，年齡18～68歲，中位年齡37歲。所選標(biāo)本均為手術(shù)前未接受過(guò)任何相關(guān)放療或化療治療的標(biāo)本。

1.2 試劑 兔抗人USP22多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，貨號(hào)ab71732；即用型快捷免疫組化MaxVision試劑盒、DAB顯色試劑盒和抗原修復(fù)液等試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床隨訪 盡可能對(duì)2013—2014年期間在我院就診和治療的每例鼻咽癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪方式主要通過(guò)電話、患者再次到門(mén)診診查或再次住院治療資料的方式進(jìn)行。每次隨訪做好記錄，第1年半年隨訪1次，第2～3年每3個(gè)月隨訪1次，第3年以后每月隨訪1次，記錄患者的總生存期(OS)和無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)，以病理確診日期作為觀察起點(diǎn)，隨訪至2017年12月。最后選取資料完整的60例鼻咽癌患者的石蠟保存標(biāo)本作為研究對(duì)象。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)MaxVision法進(jìn)行染色,所有實(shí)驗(yàn)操作步驟均按說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。主要步驟：3～4 μm厚切片，恒溫箱60℃烤片2 h以上，二甲苯脫蠟，梯度酒精和自來(lái)水水化，高溫高壓修復(fù)(pH=9.0的EDTA抗原修復(fù)液)，3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS緩沖液沖洗，滴加USP22(1∶200稀釋)一抗，室溫下孵育60 min，PBS緩沖液沖洗，滴加二抗，室溫下孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3次，DAB顯色；蘇木素復(fù)染，脫水，封片等。用已知的陽(yáng)性的乳腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照, 用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.3 免疫組化結(jié)果判定 結(jié)果判定參照其他學(xué)者[7-9]免疫組化二級(jí)記分法判定：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例：≤5%為0分，6%～25% 1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度分類(lèi)：無(wú)色為0分,淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)切片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例和細(xì)胞著色強(qiáng)度，兩種評(píng)分的乘積進(jìn)行判定，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性(++)，大于4分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)將分級(jí)≥1分歸為陽(yáng)性。以上結(jié)果由至少2位病理科醫(yī)師在雙盲情況下觀察確定。

2 結(jié)果

2.1 USP22的表達(dá) USP22陽(yáng)性染色部位為細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色可見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，見(jiàn)圖1。USP22蛋白在鼻咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于在鼻咽部黏膜慢性炎組織的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

A：USP22在鼻咽黏膜慢性炎性組織中的表達(dá)(×200)；B：USP22在鼻咽癌組織中的陰性表達(dá)(×200)；C：USP22在鼻咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(×200)；D：USP22在鼻咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(×400)

圖1 兩種組織中USP22的表達(dá)(MaxVision)表1 兩組標(biāo)本組織中USP22蛋白的陽(yáng)性表達(dá) 例

2.2 USP22的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 USP22陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著的相關(guān)性(P<0.05), 而與患者性別、年齡、病理分型等臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 USP22蛋白和患者預(yù)后的關(guān)系 本研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中，USP22陽(yáng)性表達(dá)患者的3年OS、PFS均明顯低于USP22陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 USP22的表達(dá)與 NPC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 例

表3 鼻咽癌組織中USP22蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 例(%)

3 討論

3.1 USP22在鼻咽癌組織中的表達(dá) 鼻咽癌是鼻咽部上皮組織發(fā)生的常見(jiàn)的惡性腫瘤，但鼻咽癌的病因及發(fā)生機(jī)制目前尚未完全明確。USP22位于人類(lèi)17號(hào)染色體(17p11.2)上，由14個(gè)外顯子組成，其開(kāi)放讀框由1 578個(gè)堿基組成，可編碼525個(gè)氨基酸。USP22是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志家族中一個(gè)成員, 屬于去泛素化酶蛋白酶超家族，具有去泛素化的作用，通過(guò)對(duì)底物靶分子的去泛素化修飾作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物學(xué)功能[10]。目前研究認(rèn)為USP22是惡性腫瘤表型的1個(gè)關(guān)鍵啟動(dòng)子，其作用是調(diào)節(jié)核受體和致癌信號(hào)[11]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)USP22在人類(lèi)許多惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，如USP22在乳腺癌、食管癌、胃癌、直腸癌等多種腫瘤中高表達(dá)。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)USP22在鼻咽癌方面的報(bào)道罕見(jiàn)，故本研究我們采用免疫組織化學(xué)法對(duì)60例鼻咽癌患者和20例鼻咽黏膜慢性炎患者組織中的USP22的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，60例鼻咽癌組織中，有36例組織中USP22表達(dá)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率60%(36/60)；20例對(duì)照組(鼻咽黏膜慢性炎組織)中，僅有2例USP22表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為10%(2/20)，USP22在鼻咽癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于鼻咽黏膜慢性炎組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與近年來(lái)許多國(guó)內(nèi)外權(quán)威雜志報(bào)道USP22在其他惡性腫瘤中有過(guò)表達(dá)的情況一致[12]，USP22可能在鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中扮演著重要角色，USP22可能是鼻咽癌病理診斷與鑒別診斷的指標(biāo)之一。我們認(rèn)為對(duì)可疑為鼻咽癌的病檢活檢組織檢測(cè)USP22蛋白的表達(dá)情況可能有助于鼻咽癌的病理診斷與鑒別診斷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果USP22在鼻咽癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著的關(guān)系(P<0.05)，而與患者性別、年齡、病理分型等臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，USP22的表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這表明USP22可能參與鼻咽癌的淋巴轉(zhuǎn)移過(guò)程。這與張琳等[5]報(bào)道USP22在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移及Duke′s分期有關(guān)；鄭文鳳等[9]報(bào)道USP22在食管癌的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、性別無(wú)關(guān)；于金玲等[6]報(bào)道USP22在胃癌的表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者的年齡、性別、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性等報(bào)道有些不一致，可能提示USP22在人類(lèi)不同惡性腫瘤組織中的表達(dá)與其臨床病理因素的關(guān)系不盡相同，也可能是由于各種原因無(wú)法對(duì)每一例患者一直隨訪，篩選研究病例的結(jié)果，以及由于本次實(shí)驗(yàn)收集的樣本不夠豐富、女性患者偏少、各種鼻咽癌病理分型的比例不夠理想等原因也可能導(dǎo)致在醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)上還不能很好地反映出其表達(dá)規(guī)律，還值得需要我們更進(jìn)一步的探究。

3.2 USP22蛋白與臨床預(yù)后 由于本研究對(duì)象確診時(shí)間尚未足5年，故暫時(shí)只統(tǒng)計(jì)3年OS和PFS指標(biāo)，與USP22表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USP22蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者預(yù)后較差，USP22陰性表達(dá)的患者3年OS和PFS率明顯高于陽(yáng)性表達(dá)組，與于金玲等[6]報(bào)道在胃癌患者中USP22蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后差，5年生存率低；常靜[13]報(bào)道在宮頸癌患者中USP22蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者的3年生存時(shí)間顯著低于USP22蛋白陰性表達(dá)患者的情況基本一致。提示檢測(cè)鼻咽癌患者的USP22蛋白表達(dá)情況有助于臨床判斷患者的預(yù)后。

3.3 USP22基因與鼻咽癌治療 目前以泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物逐年增多，硼替佐米(bortezomib)是首個(gè)被批準(zhǔn)臨床上用于治療B細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的泛素蛋白酶體抑制劑，2012年另一種泛素蛋白酶體抑制劑卡非佐米(carfilzomib)也被FDA批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤的治療[14]，顯示出泛素蛋白酶體作為腫瘤有效治療靶點(diǎn)的重要性，USP22屬于去泛素化酶蛋白酶超家族，但目前還沒(méi)有針對(duì)USP22基因的分子靶向藥物。廖志偉等[15]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),抑制USP22基因表達(dá)后，可使人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2裸鼠移植瘤生長(zhǎng)受到抑制，裸鼠成瘤時(shí)間晚，瘤體生長(zhǎng)明顯減緩，在人體中有無(wú)相似的作用值得進(jìn)一步深入研究。以USP22為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物將成為研究熱點(diǎn)，USP22有望成為鼻咽癌治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，USP22作為癌死亡標(biāo)簽中的一員，影響著腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。目前已有越來(lái)越多的研究證實(shí)了USP22在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且與疾病的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，這為日后開(kāi)發(fā)以USP22為標(biāo)靶的抗腫瘤藥物提供了理論基礎(chǔ)。USP22的在鼻咽癌組織中有過(guò)表達(dá)，USP22基因可能參與鼻咽癌的發(fā)生過(guò)程，USP22有望成為鼻咽癌的診斷與鑒別診斷、預(yù)后判斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。