負壓吸引聯(lián)合胰島素局部應(yīng)用對糖尿病足皮膚愈合過程β-catenin和cyclinD1表達的影響

李立， 毛遠桂， 劉德伍

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷中心(江西南昌 330006)

糖尿病足是糖尿病的最常見的并發(fā)癥，在糖尿病足潰瘍患者中，許多因素可導(dǎo)致局部傷口肉芽組織生長緩慢，如局部和全身性的血糖升高，傷口血管生成效率低下和纖維組織沉積等[1-2]。目前封閉式的負壓吸引療法(negative-pressure wound therapy，NPWT)可以顯著促進傷口的愈合，減少傷口分泌物及炎癥，并具有預(yù)防感染的效果[3]。同時，相關(guān)研究[4]表明，采用NPWT治療的患者能促進表皮干細胞的增殖，有利于局部血管的增生，為促進肉芽生成及創(chuàng)面的愈合提供良好的支持。同時，在既往的臨床和動物實驗表明[5-6]，使用胰島素進行局部治療會改善糖尿病患者的傷口愈合，且胰島素可以減少炎癥反應(yīng)并增加膠原沉積，從而誘導(dǎo)加速傷口皮膚的愈合[7]。另外，采用局部注射到傷口中的胰島素可加速傷口再上皮化，表明了局部使用胰島素具有潛在的促進表皮干細胞增殖的效果[8]，顯示了聯(lián)合使用NPWT和局部胰島素能更好地促進創(chuàng)面肉芽增生，但其具體的機制仍未明確。表皮干細胞在糖尿病創(chuàng)面的愈合中具有重要作用，在高糖狀態(tài)下，表皮干細胞的生長和增殖受到抑制，由于皮膚是一種具有多種潛能細胞來源的組織，具有免疫特異性和自我復(fù)制的潛力[9]。表皮干細胞作為創(chuàng)面組織再生的主要干細胞來源，既往研究[10]表明，過表達Wnt信號通路的關(guān)鍵β-catenin蛋白可以顯著提高表皮干細胞的增殖和分化，以促進創(chuàng)面修復(fù)。而細胞周期蛋白D1(cyclinD1)是調(diào)節(jié)細胞G1到S期的關(guān)鍵分子，cyclinD1的表達水平也在創(chuàng)面的修復(fù)過程中對細胞的增殖具有重要的促進作用[11]。但對于聯(lián)合使用NPWT和局部胰島素治療糖尿病足患者，是否能調(diào)控β-catenin和cyclinD1的表達以促進創(chuàng)面愈合，該機制仍值得進一步研究。因此，本研究旨在探討NPWT聯(lián)合胰島素局部應(yīng)用治療糖尿病足的效果及其對皮下組織β-catenin和cyclinD1表達水平的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年12月于我院因糖尿病足采用NPWT治療的患者共30例。納入標準：(1)確診2型糖尿病患者合并足部創(chuàng)面潰瘍2周以上；(2)糖尿病足Wagner分級為1～3級；(3)采用負壓吸引治療的患者；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)未明確糖尿病診斷的足部潰瘍；(2)合并下肢動靜脈栓塞的患者；(3)合并腫瘤或者局部出現(xiàn)癌變；(4)由于放射治療導(dǎo)致的局部外傷引起的潰瘍；(5)嚴重貧血或營養(yǎng)不良的患者。采用隨機數(shù)字法分為聯(lián)合組和對照組，每組15例。聯(lián)合組采用NPWT聯(lián)合胰島素治療，對照組僅采用NPWT治療。兩組患者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、高血壓患者比例、糖尿病足病程時間、入院時血糖和糖化血紅蛋白對比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

項目例數(shù)年齡(歲)性別(例)男女體質(zhì)指數(shù)(kg/m2)高血壓[例(%)]糖尿病足病程(周)入院時血糖(mmol/L)糖化血紅蛋白(%)聯(lián)合組1556.8±7.310522.5±1.65(33.3)4.6±1.48.8±2.06.8±0.4對照組1558.1±8.69623.2±1.87(46.7)4.9±2.19.1±1.76.9±0.62/t值0.4460.8951.1261.7860.4600.4430.537P值0.6590.3440.2700.1810.6490.6610.595

1.2 處理方法 所有患者在入院后完善血常規(guī)及生化檢查，監(jiān)測血糖情況，同時加強血糖調(diào)控，使血糖處于正常范圍，預(yù)防壓瘡等基礎(chǔ)護理。對創(chuàng)面的分泌物取標本進行細菌培養(yǎng)，并予使用敏感抗生素。

NPWT和胰島素局部應(yīng)用治療：先對患者足部創(chuàng)面進行充分清創(chuàng)，切除周圍壞死組織，以及創(chuàng)面基底部組織，以充分去除無血運組織。聯(lián)合組患者采用精蛋白生物合成人胰島素注射液3 U混合到5 mL生理鹽水中，進行創(chuàng)面基底部、周圍及皮下多點注射。對照組僅采用生理鹽水進行局部注射；封閉式負壓引流裝置具體的應(yīng)用方法為，對其敷料修剪成符合創(chuàng)面形狀的大小，并對其邊緣和皮膚進行縫合固定，采用半透膜進行局部封閉，并連接好負壓吸引器，負壓壓力維持在-50～-60 kPa。聯(lián)合組患者每天繼續(xù)采用胰島素1 U∶10 mL混合生理鹽水100 mL，對負壓吸引管進局部沖洗，對照組僅采用等量生理鹽水沖洗。NPWT治療時間為2周，2周后拆除負壓引流裝置，對傷口采用局部創(chuàng)面換藥處理，直到創(chuàng)面愈合為止。

1.3 評價指標 比較兩組患者治療前和治療4、6、8周的創(chuàng)面面積，記錄兩組的創(chuàng)面愈合時間，并于治療前及治療后2、4周取創(chuàng)面組織行免疫組化檢查，所取組織大小約為4 mm×2 mm×2 mm，所有標本用10%多聚甲醛固定48 h，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋和切片制成4 μm厚石蠟切片，進行免疫組化染色：將載玻片脫蠟并重新水化，用3%過氧化氫的甲醇溶液在37℃封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min。隨后，用蒸餾水洗滌切片，通過用抗原修復(fù)溶液(GeneTex，Inc，Irvine，CA，USA)煮沸進行抗原修復(fù)1～4 min。通過將載玻片與山羊血清孵育以阻斷非特異性結(jié)合，加入原始兔抗β-catenin(1∶100；產(chǎn)品號：#8480：CST，美國)和cyclinD1抗體(1∶100；產(chǎn)品號：#2978：CST，美國)，4℃過夜孵育。然后將切片用含有0.1%吐溫的Tris緩沖鹽水洗滌并在室溫下與生物素標記的二抗一起溫育30 min，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉抗生物素蛋白在37℃孵育30 min，觀察免疫反應(yīng)性使用色原3,3′-二氨基聯(lián)苯胺并用蒸餾水終止，然后將切片用蘇木精復(fù)染，用鹽酸乙醇分化，用梯度酒精和二甲苯脫水，在光學(xué)顯微鏡每個樣本選擇5個視野進行統(tǒng)計。β-catenin和cyclinD1的表達使用公式：復(fù)合表達分數(shù)(composite expression score,CES)=強度×頻率。染色強度(0為無染色，1為弱染色，2為中等染色，3為強染色)和區(qū)域的百分比(0為<5%; 1為5%～25%; 2為26%～50%; 3為51%～75%; 4為76%～100%)，所有樣本評分均由2名病理科醫(yī)生評定取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者不同時間足部創(chuàng)面面積及創(chuàng)面愈合時間比較 在治療前、治療2、4周時比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在治療8周后，聯(lián)合組創(chuàng)面面積顯著小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.685,P=0.001)，且聯(lián)合組的平均創(chuàng)面愈合時間顯著短于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.607,P=0.001)，見表2。

項目例數(shù)創(chuàng)面面積(cm2)治療前2周4周8周創(chuàng)面愈合時間(d)聯(lián)合組154.72±1.634.54±1.573.66±1.361.35±0.7554.5±9.7對照組155.02±1.384.77±1.424.31±1.472.45±0.8868.3±11.2t值0.5440.4211.2573.6853.607P值0.5910.6770.2190.0010.001

2.2 兩組患者不同時間的創(chuàng)面皮膚β-catenin和cyclinD1表達情況 兩組患者在治療前創(chuàng)面皮膚β-catenin和cyclinD1表達CES評分對比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，而聯(lián)合組患者在治療4周后的創(chuàng)面皮膚β-catenin表達CES評分顯著高于對照組(t=2.453,P=0.021)，且聯(lián)合組患者在治療2、4周后的創(chuàng)面皮膚cyclinD1表達CES評分顯著高于對照組(P<0.05)，見表3和圖1～3。

項目例數(shù)β-catenincyclinD1治療前2周4周治療前2周4周聯(lián)合組152.4±0.53.2±0.74.7±1.12.3±0.72.9±0.54.2±1.0對照組152.3±0.62.9±0.53.8±0.92.1±0.62.4±0.43.0±0.6t值0.4961.3512.4530.8403.0243.985P值0.6240.1880.0210.4080.0050.001

圖1 兩組患者治療前后皮膚組織的β-catenin表達情況(免疫組化，×200)

圖2 兩組患者治療前后皮膚組織的cyclinD1表達情況(免疫組化，×200)

3 討論

糖尿病患者的慢性傷口特別是足部潰瘍的治療仍然是臨床的難題，由于在糖尿病患者中容易發(fā)生皮膚傷口，并形成感染，其創(chuàng)面的血管由于血糖代謝導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，影響局部血運，導(dǎo)致了潰瘍創(chuàng)面的難以愈合[12]。糖尿病患者的足部創(chuàng)面愈合過程比非糖尿病患者需要更長的時間，且大部分患者傷口難以自行愈合。糖尿病足創(chuàng)面的延遲愈合過程涉及復(fù)雜的機制[13]。既往研究[14]表明，愈合過程中皮膚傷口的再上皮化取決于上皮細胞的正常增殖。其中

男性，52歲，2型糖尿病，左足部潰瘍4周，A：治療前顯示為足背部潰瘍創(chuàng)面；B：采用負壓吸引聯(lián)合胰島素局部應(yīng)用治療；C：治療56 d后，創(chuàng)面基本愈合

圖3治療前后某典型病例

表皮干細胞是參與愈合過程的最重要細胞，表皮干細胞在傷口邊緣的主要功能是促進皮膚傷口再上皮化。研究[15]發(fā)現(xiàn)， Ⅳ型膠原的糖化抑制了表皮干細胞的黏附和增殖。雖然在糖尿病患者表皮干細胞的增殖和分化機制尚未完全清楚，但多項研究[16-17]顯示了 β-catenin和cyclinD1在糖尿病患者皮膚愈合中具有重要的作用。劉坡等[18]研究顯示，采用NPWT治療糖尿病足其能促進皮膚愈合的同時，也增加了愈合皮膚中的β-catenin表達，表明了在負壓環(huán)境下可促進表皮干細胞的增殖。局部應(yīng)用胰島素也顯示了能提高糖尿病足皮膚愈合的能力[10]。而cyclinD1是調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵蛋白，既往動物實驗也顯示了其在糖尿病兔創(chuàng)面模型中顯著低表達[19]。因此，本研究旨在探討采用NPWT聯(lián)合胰島素局部應(yīng)用治療糖尿病足的效果及其對皮下組織β-catenin和cyclinD1表達水平的影響。

本研究結(jié)果顯示了NPWT聯(lián)合局部應(yīng)用胰島素治療糖尿病足其效果顯著優(yōu)于單用NPWT治療的患者，表明NPWT聯(lián)合局部應(yīng)用胰島素可以顯著提高糖尿病患者的創(chuàng)面皮膚的愈合速度。進一步探討其機制，采用免疫組化的方法評估兩組患者不同時間點的組織的β-catenin和cyclinD1表達情況，聯(lián)合組患者在治療4周后的創(chuàng)面皮膚β-catenin表達CES評分顯著高于對照組，且聯(lián)合組患者在治療2、4周后的創(chuàng)面皮膚cyclinD1表達CES評分顯著高于對照組，表明了NPWT聯(lián)合局部應(yīng)用胰島素進一步促進了皮膚組織的β-catenin和cyclinD1表達。β-catenin蛋白是一種具有多種功能的蛋白質(zhì)，其能與上皮細胞中的鈣黏著蛋白結(jié)合并在細胞黏附中起關(guān)鍵作用[20]。β-catenin也參與細胞生長，增殖和分化的調(diào)控，并且在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有關(guān)鍵作用[21]。β-catenin的表達水平在表皮干細胞的分化命運總起關(guān)鍵作用。Wnt和β-catenin的表達可能增加皮膚上皮細胞的增殖，分化和遷移，因此可能改善皮膚傷口愈合[22]。

采用NPWT可以顯著改善皮膚組織局部的微環(huán)境，減少分泌物和感染等炎癥因子，從而為皮膚愈合提供良好的條件。聯(lián)合局部應(yīng)用胰島素則可以通過激活細胞中的胰島素受體，進一步引起下游的PI3K/Akt信號蛋白的活化，進而激活轉(zhuǎn)錄因子β-catenin蛋白[23]，β-catenin蛋白易位至細胞核并轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游細胞周期cyclinD1 mRNA，從而增加了細胞內(nèi)的cyclinD1蛋白的表達，增加細胞增殖速度，促進上皮細胞增殖并分化。這可能是NPWT聯(lián)合局部應(yīng)用胰島素能顯著促進皮膚愈合速度的潛在機制。而免疫組化的結(jié)果初步驗證了聯(lián)合NPWT和局部應(yīng)用胰島素可以促進皮膚組織β-catenin和cyclinD1表達，從而提高創(chuàng)面的愈合速度，但進一步的細胞分子學(xué)機制仍然需要通過細胞學(xué)的方法進行驗證。

由于本研究納入的病例比較少，仍需要進一步加大臨床樣本和隨訪以評估聯(lián)合NPWT和局部胰島素在糖尿病組的應(yīng)用效果。綜上所述，NPWT聯(lián)合胰島素局部應(yīng)用能顯著提高糖尿病足創(chuàng)面的愈合速度，提高創(chuàng)面組織β-catenin和cyclinD1表達。