土壤中鉀細(xì)菌的篩選及篩選底物加入量對(duì)其數(shù)量的影響

郭玲玲， 吳紅艷， 宗玉麗， 徐 沖， 柴林山， 張疏雨

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽(yáng) 122000)

鉀細(xì)菌又稱(chēng)硅酸鹽細(xì)菌(Silicate bacteria)，主要指膠質(zhì)芽胞桿菌等幾種特殊的細(xì)菌[1]，是一類(lèi)細(xì)菌的總稱(chēng)，包括膠質(zhì)芽胞桿菌 (Bacillusmucilaginosus)、土壤芽胞桿菌(B.edaphicus)和環(huán)狀芽胞桿菌(B.circulans)，能夠分解土壤中的不溶性硅酸鹽礦物，釋放其中的硅、磷、鉀等元素，起到增加土壤肥力的作用[2-3]，農(nóng)業(yè)上用作生物肥料，可以全部或部分替代化肥，而且因?yàn)槭腔罴?xì)菌，作用時(shí)間長(zhǎng)，可持續(xù)提供磷、鉀元素[4-5]。然而我國(guó)大多數(shù)土壤中全鉀和有效鉀含量較低。土壤學(xué)家認(rèn)為，有至少三分之一的土壤是缺鉀的，而且增施氮肥后，較高的作物產(chǎn)量加速了其他養(yǎng)分的消耗，加重了由土壤有效鉀含量低所引起的作物生產(chǎn)問(wèn)題[6]。對(duì)于鉀細(xì)菌的研究，自1950年前蘇聯(lián)學(xué)者亞歷山大羅夫從土壤中分離得到具有釋放鋁硅酸鹽礦物中鉀元素能力的硅酸鹽細(xì)菌后，王偉等[7]從河北地區(qū)的玉米田土壤中分離得到具有分解硅酸鹽類(lèi)礦物能力的膠質(zhì)芽胞桿菌h-3菌株，盛下放[8]分離篩選到具有高效解鉀活性的硅酸鹽細(xì)菌NBT菌株，這些菌株解鉀效率都明顯增加。雖然有效鉀含量較少, 但我國(guó)擁有豐富的、以鉀長(zhǎng)石為主的難溶性硅鋁酸鉀礦產(chǎn)資源[9-10]。因此有效地開(kāi)發(fā)鉀長(zhǎng)石資源是解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可溶性鉀匱乏問(wèn)題的重要方法和途徑,目前利用鉀長(zhǎng)石粉作為篩選底物篩選鉀細(xì)菌的方法研究較少。本研究旨在研究盆栽番茄土壤中加入不同數(shù)量的鉀長(zhǎng)石粉后其解鉀細(xì)菌數(shù)量的變化，同時(shí)對(duì)土壤中的鉀細(xì)菌進(jìn)行初步篩選，為進(jìn)一步研究土壤中解鉀細(xì)菌的分離、純化及其鑒定提供參考，也為鉀細(xì)菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 植物品名為番茄中蔬四號(hào)(購(gòu)自市場(chǎng))，鉀細(xì)菌K01(購(gòu)自中科院微生物所菌種保藏中心)，鉀細(xì)菌K02(本研究室自行篩選，生產(chǎn)用菌株)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①液體富集培養(yǎng)基：蔗糖10 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO42.0 g，CaCO30.1 g，F(xiàn)eCl30.05 g，鉀長(zhǎng)石粉1.0 g，水1 000 mL。②固體初篩培養(yǎng)基：蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO42 g，CaCO30.1 g，F(xiàn)eCl30.05 g，鉀長(zhǎng)石粉1.0 g，瓊脂 18 g，水1 000 mL。③解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基：甘露醇10 g，酵母膏0.4 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，CaCO331.0 g，MgCl20.2 g，水1 000 mL。

1.1.3 試劑 鉀長(zhǎng)石粉(泰州市長(zhǎng)浦化學(xué)試劑有限公司)；四苯硼鈉、硝酸鈉、EDTA、硼砂、甲醛、氯化鉀均為分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備 SPX-450生化培養(yǎng)箱(中儀國(guó)科科技有限公司)，HZQ-Q全溫振蕩器(東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，T6新悅-723分光光度計(jì)，低溫冷凍高速離心機(jī)(SIGMA)。

1.2 方法

1.2.1 土壤處理及移栽 ①鉀長(zhǎng)石粉的處理：鉀長(zhǎng)石粉過(guò)180目，用去離子水浸泡過(guò)夜，然后用去離子水反復(fù)沖洗，去除其中的可溶性鉀，陰干，備用。②土壤處理及番茄秧苗的移栽：在土壤中加入不同數(shù)量的鉀長(zhǎng)石粉，各處理組質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.1%、0.2%、0.4%，對(duì)應(yīng)編號(hào)為1、2、3、4。將培養(yǎng)缽中的幼苗移栽至含有不同濃度鉀長(zhǎng)石粉土壤的小花盆中，定期定量澆水。

1.2.2 樣品取得及菌株篩選 ①取樣方法：將花盆內(nèi)去除秧苗地上部分的土壤及根際所附著的土壤混合均勻，即為土壤樣品。在1個(gè)植株生長(zhǎng)過(guò)程中定期取樣，即每15～20 d取樣1次。②菌株篩選：取混合均勻的土壤樣品5 g于液體富集培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)72 h，取培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)坎加诠腆w初篩培養(yǎng)基上，30 ℃ 恒溫培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)。觀察菌落的形狀、邊緣整齊度，是否凸起，是否有彈性等特征，挑取有效菌株并保存。

1.2.3 菌株解鉀能力測(cè)試(以速效鉀含量計(jì)) 采用四苯硼鈉比濁法[11]進(jìn)行測(cè)定。①原理：樣品中的K+在微堿性介質(zhì)中與四苯硼鈉反應(yīng)，生成溶解度很小的微小顆粒四苯硼鉀白色沉淀，用分光光度計(jì)檢測(cè)其濁性，從而得到樣品中可溶性鉀的含量。②鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：按不同濃度吸取氯化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液8 mL，加入甲醛-EDTA掩蔽劑，搖勻，再加入3%四苯硼鈉溶液，立即搖勻，室溫放置30 min，分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)吸光度值(A)，以吸光度值為縱坐標(biāo)、四苯硼鈉濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。③樣品測(cè)試：將篩選的有效菌株及對(duì)照菌株K01、K02分別接種于解鉀能力測(cè)試培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液8 000 r/min 離心20 min，上清液作為供試液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄不同生長(zhǎng)時(shí)間不同鉀長(zhǎng)石粉加入量鉀細(xì)菌菌數(shù)測(cè)試

從圖1可以看出，在番茄整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，不同取樣時(shí)間土壤樣品中鉀長(zhǎng)石粉加入量為0.2%時(shí)鉀細(xì)菌數(shù)量最多，其次為0.1%，再次為0.4%，三種處理的鉀細(xì)菌數(shù)量均多于空白對(duì)照，由多至少的順序?yàn)?.2%>0.1%>0.4%>空白對(duì)照。

圖1 番茄不同生長(zhǎng)時(shí)間不同鉀長(zhǎng)石粉加入量鉀細(xì)菌菌數(shù)測(cè)試Fig.1 Tested results of PDB amount after adding different amount of feldspar powder on the growing times of tomato

2.2 番茄生長(zhǎng)過(guò)程中鉀細(xì)菌菌落形態(tài)觀察

圖2 番茄生長(zhǎng)過(guò)程中鉀細(xì)菌菌落形態(tài)觀察Fig.2 Observation results of potassium bacteria colony morphology during the growth of tomato

番茄生長(zhǎng)過(guò)程中鉀細(xì)菌菌落形態(tài)見(jiàn)圖2。挑取呈圓形、邊緣整齊、表面濕潤(rùn)、菌落黏稠、呈玻璃珠狀、透明、凸出、有勃稠感、有彈性的菌落，進(jìn)一步純化，選取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株保藏，用于進(jìn)一步研究。

2.3 菌株解鉀能力測(cè)試

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 菌株解鉀能力測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線(四苯硼鈉法)及回歸方程見(jiàn)圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備Fig.3 Preparation results of standard curve

2.3.2 鉀細(xì)菌菌株解鉀能力測(cè)試 鉀細(xì)菌菌株解鉀能力測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，篩選菌株的解鉀效率高于K01的共14株，高于K02的共9株。其中解鉀效率最高的菌株為5.15-2，解鉀效率達(dá)35.4%，較外購(gòu)生產(chǎn)菌種K01高13倍，較本實(shí)驗(yàn)室保存菌種K02高3.6倍。

圖4 鉀細(xì)菌菌株解鉀能力測(cè)試Fig.4 Observation results of potassium bacteria colony morphology during the growth of tomato

3 討 論

本研究結(jié)果表明，不同鉀長(zhǎng)石粉加入量對(duì)土壤中鉀細(xì)菌數(shù)量具有一定的影響，隨著加入量的增加，鉀細(xì)菌數(shù)量也增加，但增加到一定比例時(shí)反而會(huì)抑制菌群的生長(zhǎng)，數(shù)量會(huì)相對(duì)減少，但是仍然會(huì)高于未加入鉀長(zhǎng)石粉的土壤鉀細(xì)菌數(shù)量。同時(shí)，在植株生長(zhǎng)過(guò)程中，適合地篩選底物濃度能促進(jìn)植株生長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)明顯好于空白對(duì)照，而且座果率也高于空白對(duì)照?；诮忖浘芯楷F(xiàn)狀，今后在篩選獲得高效解鉀菌株的基礎(chǔ)上，應(yīng)通過(guò)誘變育種或采用基因工程技術(shù)等手段改良菌株[12]。同時(shí)，在鉀肥中加入適當(dāng)?shù)娜玮涢L(zhǎng)石粉之類(lèi)的篩選底物，進(jìn)一步提高菌種的生長(zhǎng)能力和解鉀活力，使其在微生物浸礦和微生物肥料等方面得到廣泛應(yīng)用。