IL-21/IL-21R信號(hào)在TNBS誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病病變形成中的作用研究

姜雪峰, 賈 楠， 岳 丹,2， 王媛媛， 張曉清， 孫 遜*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110004；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 麻醉科，遼寧 沈陽 110032)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種特殊的慢性炎癥性腸道疾病,包括克羅恩氏病(Crohn′s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis, UC)。其病因和發(fā)病機(jī)制與遺傳基因、環(huán)境、生活習(xí)慣和免疫系統(tǒng)功能紊亂等多種因素密切相關(guān)。目前普遍認(rèn)為腸黏膜異常的免疫應(yīng)答是引起黏膜組織損傷及慢性炎癥的重要原因。CD主要由Th1和Th17型細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子介導(dǎo),UC主要由Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子和自然殺傷性T細(xì)胞(natural killer T cell，NKT)介導(dǎo)[1]。同時(shí),調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在調(diào)節(jié)IBD 患者腸黏膜適應(yīng)性免疫應(yīng)答、抑制其炎癥發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。Monteleone等[3]發(fā)現(xiàn)在CD或UC患者的炎性腸組織中IL-21的分泌明顯增加，IL-21通過對(duì)多種細(xì)胞的靶向作用增加了腸炎的嚴(yán)重程度。例如，IL-21通過自分泌方式維持Th1細(xì)胞應(yīng)答在CD中的主導(dǎo)地位。這也刺激細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白酶分泌成纖維細(xì)胞趨化因子，促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞生成，相反抑制Treg的活性，并增強(qiáng)Th17細(xì)胞分化及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。利用抗IL-21抗體或IL-21r-IgG融合蛋白阻斷IL-21/IL-21R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效抑制CD患者腸固有層T細(xì)胞IL-17A和IFN-γ分泌。同時(shí)，IL-21基因缺陷小鼠抵抗Th1/Th17細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)腸炎支持了IL-21正向調(diào)控Th1/Th17細(xì)胞相關(guān)炎癥通路的說法[4]。但最新研究表明，IL-21基因的純合子突變與普通變量相關(guān)聯(lián)免疫缺陷樣B細(xì)胞導(dǎo)致人類早發(fā)性炎癥性腸病[5]。此外，Yeste等[6]也通過實(shí)驗(yàn)得出IL-21刺激STAT3，維甲酸相關(guān)孤核受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)和芳香烴受體路徑誘導(dǎo)腸黏膜T細(xì)胞產(chǎn)生IL-22，從而抑制DSS誘導(dǎo)的免疫缺陷小鼠腸道炎癥的病變形成。據(jù)報(bào)道，IL-21可抑制IL-2的產(chǎn)生從而抑制Treg細(xì)胞的生存及下調(diào)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，同時(shí)刺激CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化及IFN-γ的產(chǎn)生，加重腸道炎癥。相反，最近研究發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的mIL-21iso-Tg小鼠炎癥性腸黏膜組織中Treg和Th17細(xì)胞應(yīng)答上調(diào)，小鼠腸道炎癥明顯加重[7]。由此可見，IL-21/IL-21R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在IBD腸道炎癥發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制是復(fù)雜的、矛盾的，至少目前仍不十分清楚。綜上所述,在CD或UC患者外周血和腸道組織中IL-21的水平顯著增加[8]，提示IL-21 /IL-21R信號(hào)可能在炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了潛在的重要作用。然而,IL-21/IL-21R信號(hào)在IBD中到底扮演怎樣的角色尚不確定。因此,本研究利用TNBS誘導(dǎo)C57BL/6和IL-21R KO小鼠，通過觀察模型、流式細(xì)胞染色、ELISA等方法來驗(yàn)證IL-21/IL-21R信號(hào)在炎癥性腸病腸黏膜免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠 SPF級(jí)C57BL/6小鼠(6～8周，18～22 g，雄性)，購于華阜康生物科技有限公司；IL-21R KO小鼠由日本九州大學(xué)生體防御醫(yī)學(xué)研究所感染制御研究室吉開泰信教授贈(zèng)與。

1.1.2 主要試劑及儀器 TNBS購自Sigma公司；RPMI-1640購自Thermo公司；胎牛血清購自Invitrogen公司；流式抗體及相關(guān)試劑購自BD公司；IL-4等多種ELISA試劑盒購自R&D公司。酶標(biāo)儀購自BIO-TEK公司；離心機(jī)購自Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 TNBS誘導(dǎo)的腸炎動(dòng)物模型的建立與觀察 C57BL/6、IL-21R KO小鼠各15只，禁食12 h后用7.2%水合氯醛100 μL麻醉。待麻醉成功后用連有灌腸針的微量注射器抽取TNBS溶液(2%或2.5%，用50%乙醇溶解)100 μL，小鼠頭部朝下，再將針頭插入小鼠肛門內(nèi)約3～4 cm深，緩慢推入藥液，灌腸完畢后緩慢拔出針頭，以免漏液。讓小鼠持續(xù)向下傾斜5～10 min，使其最大量吸收藥液，并與腸道充分作用，待小鼠清醒后放回籠中。

1.2.2 腸組織HE染色 2%TNBS誘導(dǎo)小鼠腸炎模型第5天處死小鼠，取小鼠結(jié)腸近心端二分之一組織約0.5 cm，沖洗干凈，用200 μL槍頭撐起腸管，置于4%多聚甲醛溶液中4 ℃避光固定24 h。經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后常規(guī)HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的病理變化，根據(jù)Sun等[9]的炎癥分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分見表1。

表1 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分表

注：病理評(píng)分=E+I

1.2.3 腸固有層淋巴細(xì)胞(LPL)的提取 2%TNBS誘導(dǎo)小鼠腸炎模型第5天處死小鼠，取出結(jié)直腸，分離提取腸固有層淋巴細(xì)胞，具體提取方法按本課題組以往發(fā)表文章所述[9]。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色檢測腸固有層(LP)中Th細(xì)胞分化 提取LPL，加入96孔板，同時(shí)加入 PMA(25 ng/mL)，Ionomycin(1 μg/mL)和BFA(10 μg/mL)，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。孵育結(jié)束后，用HBSS回收細(xì)胞至EP管中，按照BD公司流式抗體說明書進(jìn)行表面及細(xì)胞內(nèi)染色。最后利用BD LSRFortessa進(jìn)行檢測及分析。

1.2.5 ELISA檢測LP中Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平 用10% RPMI1640將提取的LPL細(xì)胞濃度調(diào)整至2×105/mL, 接種到已提前一夜鋪好CD3抗體的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；加入細(xì)胞的同時(shí)加入CD28抗體，并設(shè)置分為刺激組和無刺激組。刺激組：抗CD3抗體(10 μg/mL)+抗CD28抗體(1 μg/mL)；無刺激組：不加抗體；置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育48 h后，回收細(xì)胞上清。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A的分泌水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-21R信號(hào)缺失導(dǎo)致小鼠對(duì)TNBS誘導(dǎo)的腸炎易感性增加

利用WT和IL-21R KO小鼠建立TNBS誘導(dǎo)的腸炎模型，觀察IL-21R信號(hào)缺失對(duì)腸道炎癥的影響。體重下降是TNBS誘導(dǎo)腸炎的一個(gè)重要癥狀，每天在固定時(shí)間測量小鼠的體重變化。如圖1A所示，給予TNBS第1天，WT小鼠體重明顯下降，但從第2天開始體重逐漸回升，并接近于最初體重，生存率高達(dá)50%。但I(xiàn)L-21R KO組小鼠從用藥第1天起體重就開始明顯下降，到第2天時(shí)與WT組小鼠相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P<0.05)，并逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少、體型消瘦、精神萎靡的現(xiàn)象，而且部分小鼠排泄稀便且肛周有血跡，生存率明顯下降，到第5天時(shí)，體重下降≥20%，生存率為零，與WT組小鼠相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(*P<0.05)。如圖1B所示，解剖小鼠取出完整的大腸，兩組小鼠在沒有TNBS誘導(dǎo)的條件下，腸管長度及性狀沒有明顯差異，腸壁厚薄均勻，表面光滑，腸腔內(nèi)糞便成形。但經(jīng)過TNBS誘導(dǎo)后，兩組小鼠腸管明顯縮短，狹窄變形，腸腔內(nèi)有稀便，IL-21R KO組小鼠更加嚴(yán)重(*P<0.05)。如圖1C所示，小鼠結(jié)腸組織切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察可見，兩組小鼠均有上皮結(jié)構(gòu)明顯不完整，隱窩大面積消失，杯狀細(xì)胞大面積消失，及大量炎性細(xì)胞浸潤，但I(xiàn)L-21R KO組小鼠更加嚴(yán)重，幾乎沒有完整的上皮組織，且炎性細(xì)胞浸潤至黏膜肌層，腸黏膜水腫增厚，組織學(xué)評(píng)分明顯增高(**P<0.01)。上述結(jié)果說明IL-21R信號(hào)缺失導(dǎo)致小鼠對(duì)TNBS誘導(dǎo)的腸炎易感性增加。

2.2 IL-21R信號(hào)缺失對(duì)腸黏膜LP中Th細(xì)胞分化的影響

據(jù)報(bào)道，效應(yīng)性T細(xì)胞如Th1、Th2、Th17、Treg及其相關(guān)的細(xì)胞因子在IBD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]。因此，在TNBS誘導(dǎo)腸炎的第5天，提取小鼠結(jié)腸組織中的LPL，檢測腸道黏膜LP中Th細(xì)胞的分化情況。如圖2A和2B所示，與WT組小鼠相比，IL-21R KO組小鼠中CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和百分比明顯增加(*P<0.05，**P<0.01)，但是Th2和Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化的IL-4、IL-5和IL-17A明顯下降(*P<0.05，**P<0.01)。這說明在TNBS誘導(dǎo)的腸炎中IL-21/IL-21R信號(hào)有能力調(diào)節(jié)LP中Th1、Th2和Th17細(xì)胞的分化。有研究表明，Treg細(xì)胞可以通過抑制Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)小鼠免受DSS誘導(dǎo)的腸炎[12]。我們研究了在IL-21R缺失的情況下，腸道LP中Treg細(xì)胞的免疫應(yīng)答。如圖2C所示，與WT組小鼠相比，IL-21R KO組小鼠中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞百分比明顯下降(*P<0.05)，而且其細(xì)胞絕對(duì)數(shù)也明顯下降(**P<0.01)。CD4+CD25+T細(xì)胞上IL-10的百分比和絕對(duì)數(shù)也明顯下降(*P<0.05，**P<0.01)，這也促使了腸炎的加重。說明在腸炎組織中IL-21/IL-21R信號(hào)在上調(diào)Treg細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用，信號(hào)缺失后抑制了Treg細(xì)胞分化，腸炎加重。上述結(jié)果證明IL-21R信號(hào)缺失會(huì)通過增強(qiáng)Th1細(xì)胞的應(yīng)答，抑制Th2、Th17和Treg細(xì)胞的應(yīng)答加重腸炎的發(fā)展。

圖1 TNBS誘導(dǎo)的腸炎小鼠疾病嚴(yán)重程度Fig.1 Severity of enteritis in TNBS-induced colitis miceA:體重和生存率；B：結(jié)腸長度；C：HE染色(×200)及病理評(píng)分；*P< 0.05，**P<0.01A: body weight and survival rate;B:macroscopic changes and colon length;C:histological score (original magnification, ×200) were analyzed; *P< 0.05，**P<0.01

圖2 流式胞內(nèi)染色檢測TNBS誘導(dǎo)的腸炎小鼠中LPL-T細(xì)胞的分化Fig.2 Cytokine-producing T cells in the LPL of colon in IL-21R KO mice with TNBS-induced colitis A：IFN-γ+CD4+、IL-17A+CD4+、IFN-γ+IL-17A+CD4+T細(xì)胞的比例及絕對(duì)數(shù)；B：IL-4+CD4+、IL-5+CD4+、IL-4+IL-5+CD4+ T細(xì)胞的比例及絕對(duì)數(shù)；C：IL-10+Foxp3+和IL-10+Foxp3-CD4+T細(xì)胞的比例及絕對(duì)數(shù)；*P< 0.05，**P<0.01A：The proportions and absolute numbers of IFN-γ+CD4+, IL-17A+CD4+, IFN-γ+IL-17A+CD4+ T in LPL of colon;B： The percentage of IL-4+CD4+, IL-5+CD4+, IL-4+IL-5+CD4+ T in LPL of colon; C：The proportion and absolute number of IL-10+Foxp3+ and IL-10+Foxp3-CD4+ T cells in LPL of colon；*P<0.05，**P<0.01

2.3 IL-21R信號(hào)缺失對(duì)腸黏膜Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響

TNBS誘導(dǎo)小鼠的第5天，檢測腸黏膜LPL-T細(xì)胞在體外TCR刺激下分泌的細(xì)胞因子水平。提取結(jié)腸LPL后，用抗CD3抗體和抗CD28抗體體外培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子分泌含量。如圖3所示，與WT組小鼠相比，IL-21R KO小鼠中Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ明顯升高(**P<0.01)，而Th2分泌的細(xì)胞因子IL-4、Th17細(xì)胞因子IL-17A和Treg細(xì)胞因子IL-10明顯下降(*P<0.05)。上述結(jié)果說明，在TNBS誘導(dǎo)的腸炎中IL-21R信號(hào)的缺失增強(qiáng)了Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答，抑制了Th2、Th17、Treg細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

圖3 ELISA檢測TNBS誘導(dǎo)的腸炎小鼠中LPL-T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平Fig.3 The cell-associated cytokines productions in LP cells of colon after TNBS-inducted colitisA：IFN-γ；B：IL-4；C：IL-17A；D：IL-10；*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

在IBD免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中Th1/Th2免疫應(yīng)答失調(diào)理論一直占主導(dǎo)地位。最初CD被認(rèn)為是一種以分泌促炎癥性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α為特征的Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的慢性腸道炎癥性疾病，而UC則被認(rèn)為是由Th2型細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥，但隨著免疫學(xué)研究的飛速發(fā)展，Th17細(xì)胞亞群被確立，Th17細(xì)胞可分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6等細(xì)胞因子，參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，IL-21R KO小鼠對(duì)TNBS誘導(dǎo)的腸炎易感性增加，結(jié)腸LP上通過巨噬細(xì)胞釋放的自發(fā)性炎性因子明顯增加，Th2、Th17和Treg的細(xì)胞免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)明顯下降，而Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)明顯升高。

研究發(fā)現(xiàn)與IBD相關(guān)的炎癥中都有IL-21的高表達(dá)，說明IL-21在這些免疫失常的疾病中扮演了重要角色[14]。但最新研究表明IL-21基因的純合子突變與普通變量相關(guān)聯(lián)免疫缺陷樣B細(xì)胞導(dǎo)致人類早發(fā)性炎癥性腸病[5]。此外，Yeste等[6]也通過實(shí)驗(yàn)得出IL-21通過STAT3，RORγt和芳香烴受體誘導(dǎo)黏膜T細(xì)胞產(chǎn)生IL-22，從而抑制DSS誘導(dǎo)的免疫缺陷小鼠腸道炎癥的病變形成。根據(jù)這些結(jié)論，我們想驗(yàn)證IL-21/IL-21R信號(hào)在炎癥性腸病模型中到底是加重還是緩解了腸炎，及其調(diào)節(jié)腸上皮LP中輔助T細(xì)胞的具體機(jī)制。

在TNBS誘導(dǎo)的腸炎模型中，小鼠的遺傳背景決定其對(duì)腸炎的易感性，我們選擇C57BL/6背景的小鼠是因?yàn)樗嬖诿黠@的物種和應(yīng)變差異。Th1細(xì)胞通過減少IFN-γ的產(chǎn)生抑制Th2細(xì)胞增殖,說明Th1、Th2細(xì)胞可以相互調(diào)節(jié)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)TNBS誘導(dǎo)的腸炎在以C57BL/6小鼠為背景的IL-21R KO小鼠中明顯加重，與WT小鼠相比,IL-21R KO組小鼠大腸的腸黏膜固有層上CD4+T細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ，但Th2型細(xì)胞因子分泌減少。因此,在TNBS誘導(dǎo)的IL-21R KO小鼠腸炎模型中，Th2型細(xì)胞分泌IL-4和IL-5的能力受損,而Th1型細(xì)胞分泌IFN-γ的能力增強(qiáng)。這些結(jié)果證明IL-21/IL-21R 信號(hào)在通過偏離Th1/Th2向Th2的平衡來控制腸道炎癥中發(fā)揮了重要作用。

Th17細(xì)胞的特點(diǎn)是在自身免疫病和傳染病的炎癥組織中起到顯著的保護(hù)或致病性作用[13]。IL-21誘導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞,增強(qiáng)Th17細(xì)胞中IL-23R的表達(dá)[16]。在小鼠中IL-21主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生,它在Th17/Th2細(xì)胞應(yīng)答擴(kuò)增方面起到重要作用。由此我們發(fā)現(xiàn)在TNBS誘導(dǎo)腸炎的IL-21R KO小鼠中Th17 (CD4+IL-17A+)和 Th2 (CD4+IL-4+和CD4+IL-5+)細(xì)胞分化明顯下降。

研究顯示IL-21可以抑制Foxp3+Tregs應(yīng)答加重腸炎[17],但最新研究表明在DSS誘導(dǎo)腸炎的mIL-21iso-Tg小鼠中Treg細(xì)胞應(yīng)答上調(diào)[7]。本研究中，IL-21R KO小鼠在TNBS誘導(dǎo)腸炎后Treg細(xì)胞明顯下降。IL-21的調(diào)節(jié)抑制了IL-2的產(chǎn)生，進(jìn)而間接降低了Treg細(xì)胞的生存能力[18]。由于IL-21/IL-21R信號(hào)的缺失，IL-10可能影響了Treg細(xì)胞的生存能力。IL-21具有免疫抑制力，因?yàn)樗梢哉T導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10[19]。Th1或Th17細(xì)胞在IL-21存在的情況下也可以產(chǎn)生高水平的IL-10，然后IL-21通過T-調(diào)節(jié)型1(T-regulatory type 1，Tr1)細(xì)胞的免疫抑制力誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生。本研究在TNBS誘導(dǎo)的IL-21R KO小鼠中CD4+CD25+Foxp3-細(xì)胞數(shù)和IL-10的分泌都明顯下降，促成了腸炎的持續(xù)加重，原因可能是IL-21/IL-21R信號(hào)的缺失。

綜上所述，可以確定IL-21/IL-21R信號(hào)在炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)節(jié)作用。但是由于IBD復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制及IBD患者的個(gè)體差異性，不能盲目地將IL-21/IL-21R信號(hào)作為治療這類疾病的藥物靶點(diǎn)。本研究為IL-21/IL-21R信號(hào)在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制的研究提供參考。