鼠傷寒沙門氏菌群體感應復蘇oxyR基因缺失引起的VBNC狀態(tài)

廖何斌， 徐 磊， 夏靜若， 劉 暢， 肖 丹， 馬 強,2,， 郭曉蘭,2,*

(1.川北醫(yī)學院 轉化醫(yī)學研究中心，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 檢驗科，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學院 醫(yī)學檢驗系，四川 南充 637000)

沙門氏菌屬于腸桿菌科，沙門氏菌屬，是一種非常重要的人畜共患病病原菌，能引起動物或人發(fā)熱、腸炎和敗血癥等多種癥狀?；谄浔尘扒宄?、宿主廣泛、基因操作方便、兼性厭氧等特點，鼠傷寒沙門氏菌常被改造為弱毒疫苗，運用于多種病毒[1-2]、細菌[3-4]、寄生蟲[5-6]和腫瘤[7-8]等的免疫與治療研究，并取得了良好的效果。宿主體內(nèi)的酸、堿、溫度、滲透壓、氧等因素對鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生各種壓力脅迫，使其通過相關的調控系統(tǒng)調整相關蛋白的表達以應對各種環(huán)境。其中，oxyR調節(jié)子可以根據(jù)體內(nèi)活性氧，特別是H2O2的含量調節(jié)多種蛋白質的表達發(fā)揮抗氧化作用[9-10]。oxyR調節(jié)子編碼的關鍵調控蛋白OxyR能根據(jù)H2O2的含量在氧化態(tài)和還原態(tài)之間轉換，氧化態(tài)的OxyR蛋白能與受調控的基因啟動子結合從而啟動受調控基因的轉錄過程，還原態(tài)的OxyR也能與部分基因啟動子結合但不能啟動轉錄[11-12]。所以，oxyR基因的缺失將導致自氧化物產(chǎn)物累計、過氧化氫酶產(chǎn)量過低、過氧化氫敏感性增加等抗氧化能力減弱的現(xiàn)象。我們發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌的oxyR基因缺失株進入了VBNC狀態(tài)(Viable But Non-Culturable)。微生物的VBNC，即“活的但非可培養(yǎng)” 狀態(tài)是指細菌在一定環(huán)境脅迫條件下，不能在培養(yǎng)基上形成菌落，但保留一定生理活性的狀態(tài)[13]。不同的細菌進入VBNC狀態(tài)的條件和機理不盡相同，主要包括物理因素、化學因素和生物因素[14-18]。VBNC狀態(tài)是可逆的，在一定條件下可以復蘇[19-20]。也有研究表明，群體感應系統(tǒng)能使VBNC狀態(tài)的創(chuàng)傷弧菌得到復蘇[21]。群體感應是一種細菌細胞與細胞間的通訊系統(tǒng)(Bacterial cell-to-cell signaling)，細菌分泌擴散性小分子信號(Autoinducer)，此信號隨著細胞密度增加而同步增加，當積累到一定濃度時會引起特定基因在轉錄水平協(xié)調表達，該系統(tǒng)是一種依賴于細菌濃度的調控系統(tǒng)[22]。沙門氏菌中也存在群體感應現(xiàn)象[22]，并對生物被膜和運動性等生命活動進行調控[23]。本研究將初步探討鼠傷寒沙門氏菌的群體感應復蘇oxyR基因缺失引起的VBNC狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌種與細胞株 質粒pRE112、大腸埃希菌7213和7232由本實驗室保存；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC 14028s由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 PCR試劑盒TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase Kit、內(nèi)切酶BamHI、XbaI和T4 DNA Ligase購自北京全式金生物公司；質粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；氯霉素(Cm)、二氨基庚二酸(DAP)、蔗糖(Sucrose)購自Sigma；MarkerIII購自康維試劑；H2O2購自南昌白云藥業(yè)有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備 PCR儀(T100TMThermal Cycler，BIO-RAD)；酶標儀(SpectraMax?Paradigm?Multi-Mode Detection Platform，Molecular Devices)；冷凍離心機(SORVALL ST16R centrifuge，Thermo)；凝膠成像系統(tǒng)(Quantum-ST5，Vilber Lourmat)；生化培養(yǎng)箱(SPX-250BIII，TAISITE)。

1.2 方法

1.2.1oxyR基因缺失株的構建 根據(jù)GenBank中收錄的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028s的基因組序列，分別設計了oxyR基因上/下游同源臂的引物UP1/UP2和DP1/DP2(表1)；用PCR試劑盒，按照使用說明書分別擴增上下游同源臂U和D，再用DNA純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物；分別取1 ng U片段和1 ng D片段的混合物作為模板，以UP1和DP2作為引物進行融合PCR，并將融合PCR產(chǎn)物UD純化回收；分別用內(nèi)切酶BamHI和XbaI消化融合PCR產(chǎn)物UD和質粒pRE112，純化回收后用T4 DNA Ligase將兩段DNA連接；連接產(chǎn)物轉化到大腸埃希菌7232感受態(tài)，并涂布于LB+Cm(20 μg/mL)平板進行篩選，得到的陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后進一步提取質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，序列比對無誤即成功構建重組自殺質粒pRE112∷ΔoxyR。將構建的自殺質粒pRE112∷ΔoxyR轉化到接合轉移供體大腸埃希菌7213中，在LB+Cm+DAP(50 μg/mL)平板中篩選陽性轉化子；分別將陽性轉化子7213 pRE112∷ΔoxyR和S.typhimurium親本株(WT)液體震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照2∶1的比例混合2種菌液，取500 μL菌液濃縮后涂布于LB平板，37 ℃條件下孵育8 h，刮取菌體，涂布于LB+Cm平板篩選陽性接合子；將陽性接合子接種于LB+Cm液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，稀釋50倍，取100 μL涂布于LB+Sucrose(10%)平板，室溫培養(yǎng)36 h；PCR鑒定長出的菌落是否為S.typhimuriumΔoxyR，陽性菌落的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測序以確定插入序列正確性。

表1 引物設計

1.2.2 過氧化氫敏感性實驗 接種S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB平板， 37 ℃靜置培養(yǎng)12 h；刮取部分菌體于LB肉湯中，混勻后調整各菌OD600為0.1；分別取3 μL菌液滴于LB+H2O2(0/0.1/1 mmol/L)平板，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h，觀察各菌生長情況。該部分試驗至少重復3次，展示代表性結果。

1.2.3 泳動與群集運動 接種S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB平板，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h；刮取部分菌體于LB肉湯中，混勻后調整各菌OD600為1，分別取2 μL菌液滴于泳動(swimming)平板(0.5%瓊脂粉)和群集運動(swarming)平板(0.25%瓊脂粉)；所有平板置于37 ℃靜置培養(yǎng)4.5 h，觀察各菌生長情況。該部分試驗至少重復期3次，展示代表性結果。

1.2.4 濃度依賴性生長實驗 接種S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB平板，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h；刮取部分菌體于LB肉湯中，混勻后調整各菌OD600為100(濃度相當于2×109cfu/mL)、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，分別取3 μL菌液滴于LB平板，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h，觀察各菌生長情況；分別取6×106和6×105cfu/mL細菌涂布于LB平板，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h，觀察各菌生長情況。該部分試驗至少重復3次，展示代表性結果。

1.2.5 細菌過氧化物酶活力 接種S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB平板，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h；接種S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，次日100倍稀釋于新鮮LB液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。同時收集上述4種菌體，調整各菌OD600為0.01，各1 mL，分別添加200 μL H2O2(3%)，混勻后室溫反應20 min，觀察氣泡生成情況。該部分試驗至少重復3次，展示代表性結果。

2 結果與分析

2.1 S. typhimurium ΔoxyR構建

通過分析S.typhimuriumATCC 14028s的基因組，選擇oxyR基因上下游各500 bp左右的序列作為上下游同源臂進行PCR擴增，PCR擴增結果如圖1所示。與Marker進行比較，U和D片段符合其理論值大小(544和531 bp)；將U/D片段進行融合PCR擴增，得到UD片段，與Marker進行比較，UD片段符合其理論值大小(1 075 bp)。融合PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連接到質粒pRE112上，構建成重組的自殺質粒pRE112∷ΔoxyR，經(jīng)測序鑒定構建成功?；谕粗亟M的原理，用構建的重組自殺質粒pRE112∷ΔoxyR無痕敲除沙門氏菌基因組中的oxyR基因。PCR分別擴增WT和缺失株oxyR基因上下游同源臂，結果如圖1所示，與Marker進行比較，缺失株和親本株UD片段符合其理論值大小(1 075 bp和1 955 bp)。經(jīng)DNA測序表明，oxyR基因缺失株構建成功。

圖1 PCR擴增Fig.1 The amplification of fragments used to construct oxyR mutant strainM：Marker III；1～5分別為U、D、融合PCR產(chǎn)物UD、缺失株UD、親本株UDM: Marker III; Line 1 to line 5 are U, D, UD amplified by fusion-PCR, UD amplified from ΔoxyR strain and WT

2.2 oxyR基因缺失增加沙門氏菌的H2O2敏感性

oxyR是細菌抗氧化作用的關鍵調控因子，調控眾多參與抗氧化作用的基因轉錄，包括過氧化氫酶(Kat)的表達。所以oxyR基因的缺失將導致細菌對H2O2的敏感性增加，細菌抗氧化作用能力的減弱。因此，將3 μLOD600為0.1沙門氏菌WT和oxyR基因缺失株菌液滴于含有不同濃度H2O2的LB平板上，觀察其生長情況(圖2)。在0.1 mmol/L H2O2的LB平板上，WT生長正常，而oxyR基因缺失株的菌苔邊緣由均勻圓潤變?yōu)殇忼X不規(guī)則狀；當H2O2達到1 mmol/L時，WT的菌苔由均勻圓潤變?yōu)殇忼X不規(guī)則狀，而oxyR基因缺失株已不能生長。實驗結果表明，oxyR基因的缺失導致其H2O2敏感性增加，抗氧化能力降低，在多種細菌中有類似結果[24-26]。

圖2 H2O2敏感性實驗Fig.2 H2O2 sensitive assayA、B、C分別表示H2O2的濃度為0、0.1、1 mmol/LA：0 mmol/L H2O2；B：0.1 mmol/L H2O2；C：1 mmol/L H2O2

2.3 oxyR基因缺失使沙門氏菌進入VBNC狀態(tài)

在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)ΔoxyR株能在液體培養(yǎng)基中正常生長，而當其從液體培養(yǎng)基轉接到固體培養(yǎng)基時，則不能生長。這可能是由于oxyR基因的缺失導致其抗氧化能力減弱，從液體培養(yǎng)基轉接到固體培養(yǎng)基時，在新的氧化壓力下，細菌進入了VBNC狀態(tài)。因此，將6×106和6×105cfu/mL涂布于LB平板上培養(yǎng)。由圖3可知，WT在LB平板上生長正常，由于活菌數(shù)高，整個平板長滿了菌苔；而oxyR缺失株在LB平板上沒有菌落生成。結果表明，oxyR基因的缺失導致沙門氏菌進入了VBNC狀態(tài)。

圖3 WT和oxyR株在平板生長情況Fig.3 The growth of WT and oxyR mutant strain on LB platesA:接種6×106 cfu/mL,WT株；B：接種6×105 cfu/mL,WT株；C：接種6×106 cfu/mL，ΔoxyR株；D：接種6×105 cfu/mL,ΔoxyR株A: 6×106 cfu/mL， WT; B: 6×105 cfu/mL，WT; C: 6×106 cfu/mL， ΔoxyR; D: 6×105 cfu/mL， ΔoxyR

2.4 沙門氏菌群體感應能復蘇VBNC狀態(tài)

雖然oxyR基因的缺失導致沙門氏菌進入了VBNC狀態(tài)，但是我們也發(fā)現(xiàn)ΔoxyR株能從固體培養(yǎng)基上取種劃線培養(yǎng)于新鮮LB平板，所以我們猜想當ΔoxyR株細菌濃度達到一定時，VBNC狀態(tài)能夠復蘇。因此，制備OD600為100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的WT和ΔoxyR株菌液，各取3 μL，直接滴于LB平板。生長結果如圖4所示，WT在所有濃度下均能生長為菌苔，而oxyR基因缺失株僅在濃度極高，即OD600為100和10-1時能形成菌苔，當濃度稀釋至OD600為10-2及更低時沒有任何菌落生成。結果表明，當ΔoxyR株濃度極高時，由于群體感應的相關調控，使其從VBNC狀態(tài)復蘇。

圖4 WT和oxyR株在高濃度平板生長情況Fig.4 The growth of the high concentration of WT and oxyR mutant strain on LB platesA、B、C、D、E、F分別表示OD600為100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5A, B, C, D, E and F represent the OD values at 600 nm were 100, 10-1，10-2，10-3，10-4and 10-5, respectively

2.5 oxyR基因缺失增強群集運動

oxyR基因的缺失使其在固體培養(yǎng)基上生長依賴于細菌的高濃度。在高濃度細菌條件下，細菌個體有更多的機會與其他細菌個體發(fā)生信息交流，產(chǎn)生群體感應。此外，細菌的運動能力越強也會使細菌間的交流增多，加強群體感應。進一步檢測oxyR基因的缺失對其運動能力的影響。將2 μLOD600為0.1的WT和oxyR基因的缺失株滴在swimming平板和swarming平板中央，小心置于37 ℃靜置培養(yǎng)4.5 h，生長情況如圖5和圖6所示。oxyR基因的缺失使其泳動能力稍微減弱(圖5)，但與WT的泳動距離相比不成顯著性差異(圖6)；oxyR基因的缺失使其群集運動明顯增強(圖5)，且與WT的群集運動距離相比有顯著性差異(圖6)。該現(xiàn)象與綠針假單胞菌的現(xiàn)象相反[27]，提示oxyR基因的缺失使其群集運動加強，細菌間信息交流增加，更容易發(fā)生群體感應，以應對oxyR基因缺失帶來的VBNC狀態(tài)。

圖5 泳動與群集運動Fig.5 Swimming and swarming A、B：泳動；C、D：群集運動；A、C：WT株；B、D：ΔoxyR株A and B: swimming; C and D: swarming; A and C: WT; B and D: ΔoxyR

圖6 泳動和群集運動的大小Fig.6 The diameter of swimming and swarming**P<0.01

2.6 群體感應增強沙門氏菌分解H2O2的能力

由于群體感應能復蘇由oxyR基因缺失所引起的VBNC狀態(tài)，提示群體效應系統(tǒng)可能具有獨立于oxyR系統(tǒng)的抗氧化調節(jié)機制。收集來自固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基的WT和oxyR基因缺失株，調整到OD600為0.01，并與3%的H2O2反應20 min，結果如圖7所示，固體培養(yǎng)基上的WT和oxyR基因缺失株有明顯的分解H2O2產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象，而液體培養(yǎng)基上的WT和oxyR基因缺失株均沒有氣泡生成。結果表明，鼠傷寒沙門氏菌的過氧化物酶產(chǎn)量或活性受到群體效應的調控，而這種調控與oxyR的調控是相互獨立的。

圖7 過氧化氫分解實驗Fig.7 H2O2 decomposing assayA、B：WT;C、D：ΔoxyR;A、C：收集于LB平板;B、D：收集于LB肉湯A and B: WT; C and D: ΔoxyR; A and C: LB plate; B and D: LB broth

3 討 論

作為兼性厭氧菌，鼠傷寒沙門氏菌擁有完善的抗氧化機制，其中研究最廣泛和深入的oxyR調控子更是在鼠傷寒沙門氏菌中被首次發(fā)現(xiàn)[28]。目前，研究發(fā)現(xiàn)oxyR調控子除了抗氧化作用，還具有抑制自發(fā)突變、致病性、鐵代謝、外膜蛋白相變等重要生理作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028s株的oxyR基因缺失株能在液體培養(yǎng)基中正常生長，但不能涂布于固體培養(yǎng)基進行活菌計數(shù)，即進入了VBNC狀態(tài)。這可能是由于oxyR基因的缺失導致細菌不能應對從液體培養(yǎng)轉向固體培養(yǎng)時所面臨的新的氧化應激狀態(tài)。類似的現(xiàn)象在野油菜黃單胞菌和綠針假單胞菌中也有發(fā)現(xiàn)[27,29]。而在構建oxyR基因缺失株的蔗糖復篩涂板時能生長出oxyR基因缺失株單菌落，這可能是在基因敲除的第二次同源重組的菌中殘留了足夠的抗氧化酶類；而當oxyR基因缺失株純培養(yǎng)后，隨著細菌分裂的代數(shù)增加，這些儲存物質逐漸減少，以至于不能從液體培養(yǎng)基轉移到固體培養(yǎng)基上生長。oxyR基因缺失株可以從固體培養(yǎng)基上的單菌落劃線于新鮮的固體培養(yǎng)基上生長，所以我們懷疑這種特性與群體感應密切相關，因為固體培養(yǎng)基上菌落的細菌濃度遠高于液體培養(yǎng)基中的細菌濃度。據(jù)報道，綠膿桿菌和洋蔥伯克霍爾德菌的群體感應系統(tǒng)也具有抗氧化應激的作用[30-31]。沙門氏菌中已發(fā)現(xiàn)的群體感應系統(tǒng)至少有3套：SdiA(AI-1)、LuxS(AI-2)和QseB/C(AI-3)[22]。其中，AI-1系統(tǒng)是沙門氏菌識別其他細菌合成的自誘導物而進行的群體感應；AI-2系統(tǒng)是沙門氏菌識別自身或與其他細菌分泌的自誘導物而進行的群體感應；AI-3系統(tǒng)是沙門氏菌識別自身或其他生物(包括人類)的信號分子而進行的群體感應[22]。

研究表明，濃度高達OD600=0.1(約2×108cfu/mL當量)的oxyR基因缺失株能恢復在固體培養(yǎng)基形成菌苔的能力。其原因之一可能是oxyR基因缺失株加強了群集運動能力，使細菌間的信息交流加強，能更充分的發(fā)揮群體感應調控；其二，高濃度生長下，鼠傷寒沙門氏菌通過群體感應系統(tǒng)調控使細胞具有更強的分解H2O2的能力，可能是相關過氧化氫酶產(chǎn)量增加，也可能是提高了過氧化氫酶的活力。據(jù)基因組信息分析，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌能編碼過氧化氫酶KatE(83.6 kDa)、KatG(79.7 kDa)和一個假定的過氧化氫酶Cat(31.8 kDa)。研究表明，KatE和KatG的表達受oxyR調控，以清除體內(nèi)外的H2O2，維持氧化與抗氧化平衡；而Cat蛋白的分子量較常見的Kat蛋白小很多，目前還未見關于該蛋白的相關報道，其是否具有過氧化氫酶活性尚不清楚。為進一步弄清群體感應系統(tǒng)復蘇oxyR基因缺失所引起的VBNC狀態(tài)的機理，下一步將尋找鼠傷寒沙門氏菌中由群體感應系統(tǒng)調控的過氧化物酶基因，并確定其受哪種群體感應系統(tǒng)調節(jié)。